反相高效液相色譜法測定恩施不同產(chǎn)地刺五加中紫丁香苷和異嗪皮啶含量

袁麗君　李姣　張雪　李三宇　于啊香　涂星

摘要：目的 ?考察恩施不同產(chǎn)地刺五加中紫丁香苷和異嗪皮啶的含量，為恩施地區(qū)刺五加的開發(fā)和利用提供依據(jù)。方法 ?采用Inertsustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長分別為266、344 nm。結果 ?紫丁香苷和異嗪皮啶分別在2.5～100 μg/mL、5～500 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系，精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗RSD<2.30%，紫丁香苷、異嗪皮啶的加樣回收率分別為100.60%、97.77%，RSD分別為1.82%、2.50%。宣恩縣椿木營、利川市南坪鎮(zhèn)、建始縣官店鎮(zhèn)、建始縣高坪鎮(zhèn)、恩施市紅土鄉(xiāng)、鶴峰縣燕子鄉(xiāng)所產(chǎn)的刺五加中紫丁香苷平均含量分別為0.191%、0.225%、0.224%、0.278%、0.289%、0.239%，異嗪皮啶平均含量分別為0.018%、0.016%、0.016%、0.020%、0.009%、0.013%。結論 ?恩施地區(qū)所產(chǎn)刺五加中紫丁香苷含量較高，可作為紫丁香苷的重要來源。

關鍵詞：刺五加;紫丁香苷;異嗪皮啶;反相高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1????文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）09-0085-04

Content Determination of Syringing and Isofraxidin in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis from Different Producing Areas of Enshi by RP-HPLC

YUAN Lijun¹， LI Jiao²， ZHANG Xue²， LI Sanyu¹， YU Axiang¹， TU Xing^1，3

1. Department?of Medicine， Hubei Minzu University， Enshi 445000， China; 2. College of Science and Technology， Hubei Minzu University， Enshi 445000， China; 3. Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rheumatic Diseases， Enshi 445000， China

????Abstract： Objective To investigate the content of syringing and isofraxidin in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis?from different producing areas?of Enshi; To provide references for its development and utilization.?Methods?Separation was carried out by Inertsustain C18 column （4.6 mm ×?250 mm， 5 μm）.?Mobile phase consisted of methanol-water （25：75）; the flow rate was 1.0 mL/min;?column temperature was set as 30 ℃; sample volume was?10 μL;?the detection wavelengths?were set at 266 nm and 344 nm. Results?A good liner correlation of syringing and isofraxidin was obtained over the range of 2.5–100?μg/mL and 5–500 μg/mL， respectively. RSD value of precision， stability and repeatability were all under 2.30%. The recovery rates of syringing and isofraxidin were 100.60% and 97.77%， RSD were 1.82% and 2.50%， respectively. The average contents of syringing were 0.191%， 0.225%， 0.224%， 0.278%， 0.289% and 0.239% in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis originated in Chun-muying Town， Nanping Town， Guandian Town， Gaoping Town， Hongtu Town and Yanzi Town， respectively. The average contents of isofraxidin were 0.018%， 0.016%，?0.016%，?0.020%，?0.009% and 0.013%， respectively. Conclusion Content of syringing in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis?from Enshi area?is high， which can be the important source of syringing.

????Keywords：?Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis; syringing; isofraxidin; RP-HPLC

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Ru-pr. et Maxim.）Harms的干燥根及根莖或莖，味辛、微苦、性溫、無毒，具有益氣健脾、補腎安神、固本益智功效，主治腰膝酸軟、體虛乏力、失眠、多夢、食欲不振等癥^[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，刺五加主要含有苷類（如紫丁香苷、紫丁香樹脂苷）及多種木質(zhì)素類、異嗪皮啶和黃酮類等活性成分^[4-5]。異嗪皮啶具有鎮(zhèn)靜、抗腫瘤及抗氧化作用，而紫丁香苷具有抗腫瘤、保護肝缺血損傷的作用^[6-9]。2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）以異嗪皮啶為定性指標、紫丁香苷為定量指標，對刺五加進行質(zhì)量控制^[1]。

刺五加主要生長于東北地區(qū)，以黑龍江省產(chǎn)量最大，在吉林、遼寧、河北等地也有分布。恩施地區(qū)地處北緯30°，素有華中藥庫的美譽，其下屬八縣市均有刺五加分布。本研究采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定恩施不同地區(qū)所產(chǎn)刺五加中紫丁香苷和異嗪皮啶含量，為刺五加藥用資源的保護、開發(fā)和利用提供參考。

1 ?儀器與試藥

LC-2030C液相色譜儀（日本島津），VS-100UE型恒溫超聲提取儀（無錫沃信儀器制造有限公司），BT-25S型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯）。

紫丁香苷對照品（純度≥95.0%，HPLC級，批號111574-200603）、異嗪皮啶對照品（純度≥99.9%，HPLC級，批號0837-200203），中國食品藥品檢定研究院;甲醇（HPLC級），美國默克公司;水為去離子超純水;其他試劑均為分析純。刺五加樣品采集于恩施州不同地區(qū)，經(jīng)湖北民族大學醫(yī)學部朱敏英副教授鑒定為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Ru-pr. et Maxim.）Harms的干燥根及根莖，每個產(chǎn)地采集3批次，來源信息見表1。

2 ?方法與結果

2.1 ?對照品溶液制備

分別取紫丁香苷和異嗪皮啶對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含紫丁香苷和異嗪皮啶500 μg的溶液，即得。

2.2 ?供試品溶液制備

精密稱取刺五加粗粉1.0 g，置干凈的具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，40 ℃超聲（功率300 W，頻率50 kHz）處理60 min，室溫放涼后，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，精密移取續(xù)濾液1 mL，加50%甲醇定容至10 mL。

2.3 ?色譜條件及系統(tǒng)適用性

采用Inertsustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測波長為265 nm（紫丁香苷）、344 nm（異嗪皮啶），流動相為甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。

在上述色譜條件下，取紫丁香苷、異嗪皮啶對照品溶液和供試品溶液（恩施市紅土鄉(xiāng)）分別進樣，色譜圖見圖1。結果紫丁香苷的保留時間約為4.6 min，異嗪皮啶的保留時間約為13.8 min，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.4 ?線性關系考察

分別取紫丁香苷和異嗪皮啶對照品溶液，稀釋為系列濃度的溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定。以對照品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。紫丁香苷的回歸方程為Y=24 693.777 6X-217 342.556 1，r=0.999 3;異嗪皮啶的回歸方程為Y=81 153.720 7X-259 912.667 7，r=0.997 9。結果表明，紫丁香苷和異嗪皮啶分別在2.5～100 μg/mL、5～500 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.5 ?精密度試驗

取紫丁香苷（15 μg/mL）和異嗪皮啶（25 μg/mL）對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件，重復進樣6次，以峰面積計算精密度RSD，結果紫丁香苷和異嗪皮啶的精密度RSD分別為1.90%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.6 ?穩(wěn)定性試驗

精密稱取恩施市紅土鄉(xiāng)刺五加樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h各進樣1次，測定其峰面積，計算RSD。結果紫丁香苷和異嗪皮啶的RSD分別為1.52%、1.91%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 ?重復性試驗

分別精密稱取恩施市紅土鄉(xiāng)刺五加樣品6份，按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液，分別按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算峰面積RSD。結果紫丁香苷和異嗪皮啶的RSD分別為1.72%、1.48%，表明所建立的方法重復性良好。

2.8 ?加樣回收率試驗

精密稱取恩施市紅土鄉(xiāng)刺五加樣品6份，每份各1 g，分別加入500 μg/mL的紫丁香苷對照品溶液和25 μg/mL的異嗪皮啶對照品溶液4 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率和RSD，結果表明紫丁香苷和異嗪皮啶的回收率良好，見表2。

2.9 ?含量測定結果

取6個產(chǎn)地不同批次刺五加樣品，分別制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算紫丁香苷和異嗪皮啶的含量，結果見表3。

3 ?討論

本研究參考文獻[10-14]，分別選擇流動相為乙腈-0.1%磷酸（20∶80）、甲醇-0.05%磷酸（20∶80）、甲醇-0.02%醋酸（30∶70）、乙腈-水（20∶80）、甲醇-水（20∶80）進行考察，結果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸（20∶80）、乙腈-水（20∶80）、甲醇-水（20∶80）為流動相均能較好實現(xiàn)紫丁香苷和異嗪皮啶的分離。綜合考慮檢驗成本等，最終選擇流動相為甲醇-水（20∶80）。

本研究采用的PAD檢測器可實現(xiàn)同步分析，經(jīng)等高線和純度分析確定成分后，紫丁香苷的最大吸收波長為266 nm，異嗪皮啶的最大吸收波長為344 nm，與文獻[15]報道一致。

本研究考察了超聲提取、回流提取2種方法對提取效率的影響，結果發(fā)現(xiàn)二者無明顯差異，故選擇操作相對簡單的超聲提取法。本試驗考察了甲醇、50%甲醇、50%乙醇、75%乙醇、乙醇作為溶劑對提取效率的影響，結果50%甲醇>75%乙醇>50%乙醇>甲醇>乙醇，故選擇50%甲醇作為提取溶劑;考察了超聲時間和溶劑用量對提取效率的影響，結果發(fā)現(xiàn)超聲提取時間為60 min、溶劑用量為25倍效果最佳。

本研究測定結果表明，恩施地區(qū)6個產(chǎn)地18批次刺五加中紫丁香苷的含量均達到藥典規(guī)定，甚至高達5～6倍，就該成分而言具有較高的開發(fā)利用價值。本研究建立的紫丁香苷和異嗪皮啶同步測定方法可操作性強、簡便快捷、重復性好、回收率高，可更全面地評價刺五加的藥材質(zhì)量，可為刺五加的質(zhì)量控制提供參考和借鑒。

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