超快速液相色譜法同時(shí)測定刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E的含量

關(guān)皎，丁思宇，王宜優(yōu)，葛勝宇，王軍民，朱鶴云，韓麗琴（.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 303；.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 30）

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.Et Maxim.）Harms 的干燥根和根莖或莖，廣泛分布于中國東北部、日本、韓國和俄羅斯東部地區(qū)，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效[1]。藥理學(xué)研究[2-6]表明，刺五加對心腦血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，同時(shí)還具有抗疲勞、抗應(yīng)激、增強(qiáng)免疫力、抗輻射及抗腫瘤等作用。采用刺五加作為主要組分制備而成的刺五加注射液臨床上廣泛應(yīng)用于冠心病心絞痛、腦梗死、高血壓等疾病的治療，具有廣闊的應(yīng)用前景[7-9]。

刺五加的化學(xué)成分主要包括苷類、黃酮類、木脂素類、香豆素類等[10-11]。其中，苷類成分是刺五加中的主要活性成分，包括刺五加苷B（又名紫丁香苷）和刺五加苷E等。刺五加苷具有較好的抗氧化和亞硝酸鹽去除活性[12]；刺五加苷B具有改善高原肺水腫、抗運(yùn)動性疲勞、改善疲勞小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、抗腫瘤等作用[13-16]；刺五加苷E 具有抗帕金森、抗肺動脈高壓、防治心肌梗死等作用[17-19]。2020年版《中國藥典》僅以刺五加苷B作為定量指標(biāo)來控制刺五加藥材的質(zhì)量，無法全面控制刺五加藥材的質(zhì)量。目前刺五加苷B和刺五加苷E的含量測定方法主要有高效液相色譜法[20-23]，但存在樣品預(yù)處理復(fù)雜、專屬性差、出峰時(shí)間長等缺點(diǎn)。超快速液相色譜（Ultra fast liquid chromatography，UFLC）技術(shù)可以縮短分析時(shí)間，改善分離度和靈敏度，降低溶劑消耗，已被廣泛應(yīng)用[24-25]。本研究首次建立UFLC 法同時(shí)測定刺五加中苷類成分刺五加苷B和刺五加苷E的含量，具有分析時(shí)間短、分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，可為刺五加藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Prominence UFLC超高快速液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-250DE數(shù)控聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG16KR離心機(jī)（天津東旺儀器有限公司）；CPA 225D 百萬分之一電子天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；FW80高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥甲醇，色譜純，美國Fisher 科技有限公司；刺五加苷B 對照品（批號：MUST-22011212；純度：99.1%）、刺五加苷E 對照品（批號：MUST-22072402，純度：99.5%），成都曼思特生物技術(shù)有限公司，結(jié)構(gòu)式見圖1；刺五加藥材（購于吉林大藥房，批號：2023001-2023006；產(chǎn)地：遼寧）經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室李景華教授鑒定為五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus（Rupr.et Maxim.）Harms 的干燥根和根莖或莖。

圖1 刺五加苷B（A）和刺五加苷E（B）的結(jié)構(gòu)式Figure 1Structural formula of eleutheroside B（A）and eleutheroside E（B）

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用Shim-Pack XR-ODS 柱（75 mm×3.0 mm，2.2 μm）；H2O（A）-CH3OH（B）為流動相，梯度洗脫（0～1 min，10% B→35% B；1～5 min，35% B→50% B；5～8 min，50%B→60%B）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 °C；進(jìn)樣量：5 μL；平衡時(shí)間：5 min；檢測波長：215 nm。典型色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品（A）和刺五加樣品（B）的超快速液相色譜圖Figure 2 UFLC chromatograms of mixed reference substances（A）and sample of Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis（B）

2.2 對照品溶液的配制分別精密稱取刺五加苷B和刺五加苷E 對照品5 mg，置于5 mL 容量瓶中，水-甲醇（50∶50，V/V）溶解并定容，即得濃度均為1 mg·mL-1的刺五加苷B和刺五加苷E對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的配制刺五加藥材粉碎，過40 目篩后精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入水-甲醇溶液（50∶50，V/V）25 mL，超聲處理（功率250 W，45 kHz）30 min。放冷后離心5 min（13 000 r·min-1，離心半徑為7.5 cm），取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察用移液管移取“2.2”項(xiàng)下的刺五加苷B和刺五加苷E對照品儲備液適量，置于同一5 mL容量瓶中，用水-甲醇（50∶50，V/V）配制成系列混合對照品溶液（刺五加苷B 質(zhì)量濃度為10、20、40、100、200 和400 μg·mL-1；刺五加苷E 質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100 和200 μg·mL-1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得刺五加苷B和刺五加苷E回歸方程分別為：Y=5.615×104X-3.075×105（r=0.999 0），Y=4.877×104X-9.360×104（r=0.999 1）。結(jié)果表明，刺五加苷B和刺五加苷E 在10～400、5～200 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.4”項(xiàng)下制備的混合對照品溶液（刺五加苷B質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1，刺五加苷E 質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1）200 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示刺五加苷B和刺五加苷E 峰面積的RSD 分別為0.5%和1.3%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次（批號：2023001）的供試品溶液200 μL，于室溫條件下，分別于制備后0、2、4、6、8、12 和24 h 測定。結(jié)果刺五加苷B和刺五加苷E峰面積的RSD 分別為0.6%和2.4%，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次（批號：2023001）的刺五加樣品6 份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液。取供試品溶液200 μL，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算刺五加苷B和刺五加苷E的含量。結(jié)果刺五加苷B和刺五加苷E 的含量平均值（n=6）分別為0.129%和0.073%，RSD（n=6）分別為2.8%和2.6%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的刺五加樣品溶液（刺五加苷B和刺五加苷E 的含量分別為0.129%和0.073%）共9份，每份1.0 g，分別加入相當(dāng)于樣品中刺五加苷B和刺五加苷E 含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3 份，制備供試品溶液。進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算刺五加苷B和刺五加苷E的回收率和RSD。結(jié)果見表1。

表1 刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E 的回收率（n=9）Table 1 Recoveries of eleutheroside B and eleutheroside E in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis（n=9）

2.9 樣品含量測定取6 批次刺五加樣品，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，采用外標(biāo)法計(jì)算刺五加苷B和刺五加苷E 的含量。6 批樣品測定結(jié)果見表2。

表2 刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E 的含量測定結(jié)果（%，n=3）Table 2 Content determination of eleutheroside B and eleutheroside E in Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis（%，n=3）

3 討論

3.1 流動相的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)先后考察了3種不同流動相體系（水-乙腈、0.1%磷酸水-乙腈和水-甲醇）的分離效果。當(dāng)采用乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水作為流動相時(shí)，刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E無法與藥材中其他干擾成分分離。當(dāng)采用水-甲醇作為流動相時(shí)，分離效果較好，與已有的研究[20-23]相比，分析時(shí)間明顯縮短，僅為8 min，其他成分不干擾藥物的測定。

3.2 檢測波長的選擇對刺五加苷B和刺五加苷E進(jìn)行全波長掃描，刺五加苷B 在220 nm 和264 nm 波長處有最大吸收峰，其中，在220 nm 波長處吸收強(qiáng)度較高，刺五加苷E 在206 nm 波長處有最大吸收峰。為減少雜峰干擾，獲得較好的分離度，并考慮基線平穩(wěn)、色譜峰響應(yīng)和末端吸收等因素，最終選擇紫外215 nm作為檢測波長。

3.3 提取溶劑的選擇《中國藥典》（2020年版）中記載的刺五加供試品溶液的制備方法為超聲提取法，采用的提取溶劑為100%甲醇[1]。本研究采用100%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行提取時(shí)，刺五加苷B提取效果較好，但由于刺五加苷E在甲醇中溶解度較差，提取效果不佳，且峰形較差。采用甲醇-水（50∶50，V/V）作為提取溶劑時(shí)，刺五加苷B和刺五加苷E提取率均較高，且藥材中其他成分干擾較小。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-水（50∶50，V/V）作為提取溶劑。

本研究建立了UFLC 法同時(shí)測定刺五加中刺五加苷B和刺五加苷E 的含量，相比于HPLC 法，本方法縮短了分析時(shí)間，并保證了較好的分離度和較高的靈敏度。應(yīng)用本方法測定了6批刺五加藥材中刺五加苷B和刺五加苷E的含量，結(jié)果顯示，均符合《中國藥典》（2020年版）刺五加苷B 不得少于0.050%的要求。本方法具有專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、分析時(shí)間短等特點(diǎn)，可為刺五加藥材的質(zhì)量控制和體內(nèi)藥動學(xué)研究提供參考。