西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療對(duì)2型糖尿病Nrf2及氧化應(yīng)激的影響

陳傳綺　羅千軍　鄢燕瓊　莊嚴(yán)

【摘要】 目的 研究西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療對(duì)2型糖尿病患者核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）及氧化應(yīng)激的影響。方法 選取100例2型糖尿病患者， 隨機(jī)分為西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組， 每組50例;另選取健康體檢者50例作為對(duì)照組。西格列汀組采用西格列汀治療， 甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組采用西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療， 收集兩組患者治療前后及對(duì)照組研究對(duì)象血液進(jìn)行檢測(cè)， 觀察三組血糖、血脂及血清Nrf2、抗氧化酶[谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、血紅素氧合酶-1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）] 水平， 以及外周血單核細(xì)胞（PBMC）中HO-1/β-肌動(dòng)蛋白信使核糖核酸（β-actin mRNA）表達(dá)率的差異。結(jié)果 治療前， 西格列汀組及甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者空腹血糖（FPG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、糖化血紅蛋白（HbA1c）水平均明顯高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后， 西格列汀組及甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平均低于治療前且甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組的FPG、TG、TC、LDL-C、HbA1c水平分別為（6.41±0.62）mmol/L、（1.61±0.54）mmol/L、（4.65±0.72）mmol/L、（3.11±0.51）mmol/L、（6.93±0.52）%均低于西格列汀組的（6.93±0.54）mmol/L、（1.82±0.41）mmol/L、（4.98±0.88）mmol/L、（3.37±0.75）mmol/L、（7.63±0.64）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療前SOD、GST水平明顯低于對(duì)照組， Nrf2、NQO1、HO-1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率顯著高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與本組治療前比較， 西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療后血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率均明顯降低， GST、SOD水平升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;治療后， 甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者較西格列汀組患者血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率降低更為明顯， GST、SOD水平升高明顯， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療較單用西格列汀治療， 對(duì)于2型糖尿病的血糖、血脂等改善效果更好。西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療能夠抑制2 型糖尿病患者Nrf2的表達(dá)， 其可能通過Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）-Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號(hào)通路對(duì)2型糖尿病患者氧化應(yīng)激產(chǎn)生影響， 使Nrf2下游HO-1、NQO1等抗氧化酶活性受到調(diào)節(jié)， 血清GST、SOD水平升高， 值得臨床注意。

【關(guān)鍵詞】 西格列汀;甘精胰島素;2型糖尿病;核因子E2相關(guān)因子2;Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.24.060

2型糖尿病是全世界性的公共健康問題， 中國是世界上擁有最多糖尿病患者的國家之一[1， 2]。研究表明糖尿病與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系[3， 4]。Keap1-Nrf2- ARE信號(hào)通路是近年來抗氧化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5]。本文就西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療對(duì)2型糖尿病患者Nrf2及氧化應(yīng)激的影響進(jìn)行研究， 探討其分子生物學(xué)機(jī)制， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2014年6月～2016年6月在本院糖尿病中心門診和住院部診治的2型糖尿病患者共100例， 其中男58例， 女42例;年齡58～74歲， 平均年齡66.4歲。所有患者符合1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)， 患者入院前未給予降糖藥物治療， 無糖尿病酮癥酸中毒等嚴(yán)重糖尿病急性并發(fā)癥， 無嚴(yán)重的心臟疾病、活動(dòng)性肝病、不穩(wěn)定或快速進(jìn)展的腎臟疾病， 無嚴(yán)重的周圍血管病及腦血管疾病， 排除糖尿病病情較重需胰島素強(qiáng)化治療者。另在本院體檢中心選取同期健康體檢者50例， 其中男26例， 女24例;年齡55～72歲， 平均年齡64.0歲。將100例糖尿病患者隨機(jī)分為西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組， 每組50例。

1. 2 方法

1. 2. 1 糖尿病患者治療方法 西格列汀組采用西格列汀治療， 給予患者口服西格列汀片100 mg/次， 1次/d。甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組采用西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療， 給予患者口服西格列汀片100 mg/次， 1次/d， 聯(lián)合每晚10點(diǎn)皮下注射1次甘精胰島素， 根據(jù)患者體重計(jì)算所需甘精胰島素劑量并根據(jù)患者血糖情況調(diào)整胰島素劑量[6， 7]。兩組患者治療時(shí)間均為12周， 每2周門診隨訪1次。治療前及治療12周后各收集患者靜脈血液樣本15 ml。

1. 2. 2 血糖及血脂檢測(cè) 西格列汀組、甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療前后及對(duì)照組入院時(shí)分別抽取靜脈血5 ml，

采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定FPG， 采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定TG、TC、LDL-C， 采用高效液相色譜分析法測(cè)定HbA1c。檢測(cè)采用美國BeckmanLS20全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行。

1. 2. 3 Nrf2及血清抗氧化酶檢測(cè) 西格列汀組、甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療前后及對(duì)照組入院時(shí)分別抽取靜脈血5 ml， 采用12000 r/min離心25 min， 吸取上清液后， 分裝， 標(biāo)本保存于-70℃冰箱。雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組患者血清中Nrf2及抗氧化酶（GST、SOD、HO-1、NQO1）水平。試劑盒購自南京建成生物工程研究所， 按試劑盒說明進(jìn)行雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)Nrf2及血清抗氧化酶水平。

1. 2. 4 PBMC中HO-1/β-actin mRNA的表達(dá)率檢測(cè) 西格列汀組、甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療前后及對(duì)照組入院時(shí)分別抽取靜脈血5 ml， 裝于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝真空采血管中。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)PBMC中HO-1/β-actin mRNA的表達(dá)率。分別應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC， 用Trizol抽提液提取總RNA， 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司生產(chǎn)）， 采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物， HO-1的上游引物為5， -CTGGAGGAGGAGATTGAGCG-3， 下游引物為5， -TAAGGACCCATCGGAGAAGC-3。按試劑盒方法操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)， 加溶解曲線， 光密度值由計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算得出。分析三組PBMC中HO-1/β-actin mRNA的表達(dá)率。

1. 3 觀察指標(biāo) 觀察三組血糖及血脂與血清Nrf2、GST、SOD、HO-1、NQO1水平， 以及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率的差異。血糖及血脂指標(biāo)包括FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組研究對(duì)象血糖及血脂水平比較 治療前， 西格列汀組及甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平均明顯高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后， 西格列汀組及甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者FPG、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平均低于治療前且甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組的FPG、TG、TC、LDL-C、HbA1c水平分別為（6.41±0.62）mmol/L、（1.61±0.54）mmol/L、（4.65±0.72）mmol/L、（3.11±0.51）mmol/L、（6.93±0.52）%均低于西格列汀組的（6.93±0.54）mmol/L、（1.82±0.41）mmol/L、（4.98±0.88）mmol/L、（3.37±0.75）mmol/L、（7.63±0.64）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 三組研究對(duì)象血清Nrf2、GST、SOD、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率比較 西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療前SOD、GST水平明顯低于對(duì)照組， Nrf2、NQO1、HO-1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率顯著高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與本組治療前比較， 西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療后血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率均明顯降低， GST、SOD水平升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;治療后， 甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者較西格列汀組患者血清Nrf2、HO-1、NQO1水平及PBMC中HO-1/β-actin mRNA表達(dá)率降低更為明顯， GST、SOD水平升高明顯， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

氧化應(yīng)激與2 型糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)， 氧化產(chǎn)物過多可導(dǎo)致胰島B細(xì)胞損傷， 而改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)可能防止2型糖尿病及其并發(fā)癥進(jìn)展[8]。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)。Nrf2通過與ARE相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白， 非刺激狀態(tài)Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1結(jié)合， 在自由基或化學(xué)物質(zhì)刺激下， Nrf2與Keap1解離而活化。Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合， 啟動(dòng)ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá) [9]。ARE下游的抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶包括HO-1、NQO1、GST、SOD等。HO-1是體內(nèi)參與亞鐵血紅素代謝的一種微粒體氧化酶， 對(duì)氧化應(yīng)激的細(xì)胞起保護(hù)作用， 可減少糖尿病患者細(xì)胞的損傷和凋亡， 延緩糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[10]， 其在正常組織中表達(dá)甚微， 但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下大量生成， 從而產(chǎn)生上述作用， 一般隨著氧化應(yīng)激緩解， 其水平隨之下降。SOD 具有較強(qiáng)的清除氧自由基和炎癥因子的作用， 從而保護(hù)機(jī)體免受損傷[11]。

甘精胰島素是使用DNA重組技術(shù)制備的長效胰島素類似物。外源性胰島素除了具有降糖作用， 還具有抗氧化應(yīng)激作用[12]。陶松桔等[13]研究證實(shí)， 胰島素強(qiáng)化治療在控制糖尿病患者血糖的同時(shí)， 還可以提高血清 SOD水平。西格列汀是首個(gè)應(yīng)用于臨床的二肽基肽酶4（DPP-4）抑制劑， 是2型糖尿病治療的一線藥物。Jin等[14]的研究表明， DPP-4抑制劑能提高胰島細(xì)胞SOD的水平， 改善氧化應(yīng)激狀態(tài)。

本研究表明， 西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療前SOD與GST水平明顯低于對(duì)照組， Nrf2、NQO1、HO-1水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。分析原因：隨著Nrf2信號(hào)通路的激活， Nrf2、NQO1、HO-1表達(dá)的增加可能導(dǎo)致機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力的增強(qiáng)， 進(jìn)而起到清除氧自由基及炎癥因子作用;2 型糖尿病患者機(jī)體的長期高血糖可與SOD 活性中心的賴氨酸結(jié)合， 產(chǎn)生糖基化反應(yīng)， 使SOD 水平下降， 谷胱甘肽合成酶糖化， GST水平也隨之下降。上述指標(biāo)變化提示2型糖尿病患者體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

與治療前比較， 西格列汀組和甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療后血清Nrf2、HO-1和NQO1水平均明顯降低， GST、SOD水平升高， 且甘精胰島素聯(lián)合西格列汀組患者治療后上述指標(biāo)較西格列汀組改變更為明顯（P<0.05）。2型糖尿病患者血糖控制后， Nrf2、HO-1和NQO1水平隨之降低， 提示患者在血糖控制的同時(shí)， 降低了Nrf2及其通路下游 HO-1、NQO1的表達(dá)， 從而使體內(nèi)氧化應(yīng)激改善， 同時(shí)改善胰島素抵抗;隨著血糖的正常， 內(nèi)源性血清GST、SOD抑制狀態(tài)解除， 水平也趨于正常， 從而減少全身炎癥反應(yīng)。糖尿病患者應(yīng)用甘精胰島素聯(lián)合西格列汀治療后血清抗氧化酶的改變更為明顯， 提示二者聯(lián)合治療對(duì)糖尿病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)改善更為顯著。

PBMC中HO-1/β-actin mRNA基因表達(dá)率的改變與血清HO-1的變化一致， 進(jìn)一步提示甘精胰島素聯(lián)合西格列汀治療通過Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路改善糖尿病患者機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

綜上所述， 西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療較單用西格列汀治療， 對(duì)于2型糖尿病的血糖、血脂等改善效果更好。西格列汀聯(lián)合甘精胰島素治療能夠抑制2型糖尿病患者Nrf2的表達(dá)， 其可能通過Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路調(diào)節(jié)2型糖尿病患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路可能成為防治2型糖尿病患者一個(gè)非常有前景的靶點(diǎn)。

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