腎毒血清腎炎動物模型的造模方法及其免疫機制評述

呂晶晶，黃巖杰*，郭慶寅，吳光華，楊曉青

(1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科，鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046)

新月體腎炎是一個病理學診斷，指有新月體形成的腎小球超過全部腎小球的50%，新月體超過腎小囊面積的50%，診斷需依靠腎活檢[1]。根據(jù)其免疫熒光表現(xiàn)不同分為三型[2]：Ⅰ型為抗腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)抗體型，代表性的動物模型為實驗性自體免疫腎小球腎炎模型，屬于主動誘導模型，多用于研究原發(fā)性抗GBM抗體型腎小球腎炎(不伴肺出血)和Goodpasture綜合征(伴肺出血)；Ⅱ型為免疫復合物型，其代表性的動物模型為腎毒血清腎炎(nephrotoxic serum nephritis，NTSN)模型，主要用于研究免疫復合物介導的新月體腎炎；Ⅲ型為寡免疫復合物型，針對這一型尚無理想的動物模型，目前多使用實驗性自體免疫脈管炎模型。三種動物模型分別用于研究不同的疾病，其中NTSN模型病變典型、應(yīng)用廣泛，造模方法繁瑣、免疫機制復雜，下面主要針對NTSN模型的造模方法、免疫機制進行評述。

1 概述

NTSN動物模型是將腎毒血清經(jīng)靜脈一次性注射免疫動物制備而成，臨床表現(xiàn)多為蛋白尿、腎功能下降等，腎組織病理可見固有細胞增生、炎性細胞浸潤、GBM斷裂、包曼氏囊有新月體形成等，免疫熒光可見GBM外側(cè)有顆粒團塊狀免疫復合物(主要為IgG、C3)沉積，是具有典型的人類新月體腎炎病理變化的動物模型。該模型可用于研究循環(huán)免疫復合物介導的有新月體形成的原發(fā)性和繼發(fā)性腎病的發(fā)病機制、免疫機制、治療方案等，如原發(fā)性IgA腎病，狼瘡性腎炎(Ⅲ、Ⅳ)、紫癜性腎炎等。

2 溯源及改良過程

2.1 溯源

1900年，Lindeman[3]創(chuàng)建了NTSN模型，用兔腎免疫豚鼠，然后將豚鼠的血清注射給健康家兔，家兔出現(xiàn)了蛋白尿和尿毒癥，這是該模型的雛形。

2.2 改良后的Masugi腎炎和加速型NTSN模型

1932年，Masugi對該模型進行了改良，他將大鼠的腎皮質(zhì)勻漿后反復免疫家兔，然后用兔抗大鼠腎皮質(zhì)的腎毒血清免疫大鼠制備NTSN，因此該模型又稱為Masugi腎炎。Masugi腎炎具有與人類新月體腎炎類似的表現(xiàn)，如腎固有細胞增生、炎性細胞浸潤、基底膜斷裂、新月體形成等，但制備時間長，免疫反應(yīng)弱，不利于研究[2]。

1965年，Unanue等[4]對該模型進一步改進，他們用兔IgG對Sprague Dawley(SD)大鼠進行預免疫后再注射腎毒血清來進行造模，結(jié)果經(jīng)預免疫的大鼠提前出現(xiàn)了腎組織學改變，造模過程明顯縮短，學者將其稱為加速型NTSN。1994年，任國輝等[5]也使用該方法成功建立了SD大鼠的加速型NTSN模型。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為免疫增強劑，可以替代IgG進行預免疫建立加速型NTSN[6]。

目前，不論是改良后的加速型NTSN模型[7-8]還是非加速的NTSN模型[9-12]都在沿用，但加速型模型使用最廣泛。

3 造模

NTSN模型的建立，包含選擇易感的實驗動物、制備純化的腎毒血清、造模(加速型、非加速型)，其關(guān)鍵在于實驗動物的選擇和血清的制備。

3.1 選擇易感動物

建立動物模型，選擇易感動物是造模成功關(guān)鍵的第一步。目前大鼠造模方法成熟，在國內(nèi)外研究中廣泛使用。國外使用Wistar-Kyoto(WKY)大鼠者居多，其模型具有典型的新月體形成的組織病理表現(xiàn)，如腎固有細胞增生、炎細胞浸潤、基底膜斷裂、新月體形成等[13-14]。Takabatake等[9]使用WKY大鼠建立非加速型的NTSN模型，在第8天模型組大鼠60%的腎小球有新月體產(chǎn)生。WKY大鼠對腎毒血清敏感，新月體產(chǎn)生所需時間短。有研究表明WKY大鼠含有易感基因Crgn1和Crgn2，分別位于13和16號染色體上[15]。

WKY大鼠敏感性好、病變典型，但價格昂貴，約為普通SD大鼠的4～5倍。SD大鼠也可用于該模型的建立，Unanue等[4]在創(chuàng)建加速型NTSN模型時使用的就是SD大鼠，目前國內(nèi)外新月體腎炎研究中也均有使用[16-19]。王坤等[16]選取體重190～205 g的雄性SD大鼠，建立加速型NTSN模型，2周后正常對照組未見新月體形成，模型組新月體形成率超過50%，以細胞性新月體為主，部分為纖維細胞性新月體。Karavana等[20]也用180～200 g的雄性SD大鼠建立了加速型NTSN模型，14 d觀察模型組蛋白尿明顯高于對照組，且腎組織中發(fā)現(xiàn)小球和球旁有巨噬細胞和單核細胞浸潤，并可見纖維細胞性新月體。由此可見，SD大鼠雖可用于NTSN的造模，但是較WKY大鼠產(chǎn)生新月體的時間長，加速型模型一般大于2周，而WKY非加速型模型約1周左右[9]。

除了WKY大鼠、SD大鼠外，Wistar大鼠也可用于造模[21-22]。但并不是所有的大鼠都適于該模型的建立，如從Wistar品系繁育而成的Lewis(LEW)大鼠被注射腎毒血清后就不會產(chǎn)生新月體，常用于陰性對照。那么把WKY的易感基因轉(zhuǎn)染給LEW大鼠會不會產(chǎn)生新月體呢？Zelpha等[23]將WKY大鼠的易感基因Crgn1、Crgn2轉(zhuǎn)染給LEW大鼠得到LEW.WCrgn1、LEW.WCrgn2、LEW.WCrgn1,2三種轉(zhuǎn)基因大鼠，然后對8周齡的雄性WKY、LEW、LEW.WCrgn1、LEW.WCrgn2、LEW.WCrgn1,2大鼠均靜脈注射等量的腎毒血清，9 d后檢測24 h尿蛋白含量發(fā)現(xiàn)LEW.WCrgn1,2組低于WKY組，但是明顯高于其他三組；同時含有WKY大鼠易感基因Crgn1和Crgn2的LEW.WCrgn1,2大鼠有新月體產(chǎn)生，但是少于WKY組，而LEW大鼠和含單一易感基因的LEW.WCrgn1、LEW.WCrgn2大鼠均無新月體產(chǎn)生。因此Crgn1和Crgn2為WKY大鼠的易感基因，且需同時存在。LEW.WCrgn1,2大鼠新月體產(chǎn)生較少，易感性較差，且轉(zhuǎn)基因LEW.WCrgn1,2需要一定的技術(shù)支持，因此少用。

除了大鼠外，小鼠轉(zhuǎn)基因種類豐富、技術(shù)成熟，也可用于該模型的建立，如C57BL/6[24-26]、pod-EGFP[27]、CD1小鼠[11,24]等。李向陽等[6]使用小鼠建立加速型模型，第14天模型組光鏡下可見腎小球壁層上皮細胞增生，新月體形成，腎小囊囊腔縮小閉塞，尿蛋白達到高峰，但21 d尿蛋白開始下降，這可能與小鼠模型的微血栓較多、腎小囊囊腔縮小閉塞有關(guān)。小鼠模型與人類新月體腎炎的病情發(fā)展、病理變化不太相符，這可能是目前使用大鼠者居多的原因之一。

除了鼠系外，兔子、羊[28]也可以用來造模，但是耗材相對較貴，較少使用。因此在NTSN模型建立過程中，WKY大鼠可能更適于NTSN模型的建立，SD大鼠次之。不同種屬、不同性別的動物所產(chǎn)生的病變是否存在差異呢？Ougaard等[24]使用CD1和C57BL/6小鼠建立NTSN模型，發(fā)現(xiàn)兩種雌性小鼠模型疾病發(fā)展過程相似，且較雄性小鼠對腎毒血清更敏感。Kaneko等[29]發(fā)現(xiàn)不同年齡的C57BL/6 J鼠之間存在差異，分別用12周齡和18月齡的C57BL/6 J鼠經(jīng)羊血清預免疫后建立加速型NTSN模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合在GBM上的羊IgG、鼠抗羊IgG和血清中的鼠抗羊IgG滴度相似，但是18月齡的C57BL/6 J老年鼠腎損傷較輕，這可能與腎小球的單核巨噬細胞浸潤減少，細胞表面的C-C趨化因子受體1、C-C趨化因子受體2、Fcγ受體的表達下調(diào)有關(guān)。

3.2 腎毒血清制備

除了選擇合適的易感動物，腎毒血清的制備是建立該模型的另一個關(guān)鍵。經(jīng)典的NTSN模型制備方法是將A種動物的GBM成分多次免疫B種動物，B種動物就會產(chǎn)生抗A種動物GBM的抗體，等達到一定滴度后留取血清(即腎毒血清)，再一次性靜脈注射給A種動物,建立NTSN模型。

制備腎毒血清的第一步是提取純化的GBM成分，Lindeman[3]創(chuàng)建NTSN模型時直接用兔腎，成分復雜，特異性差；目前使用的主要有三種方法：①皮質(zhì)勻漿：將腎皮質(zhì)用組織勻漿機進行勻漿獲得，該方法操作簡便，但是皮質(zhì)勻漿得到的GBM成分復雜，特異性較差；②相對純化的GBM成分：將腎皮質(zhì)研磨、過篩后得到腎小球，減少腎小管成分污染，純度越高越好，一般需大于95%；離心、洗滌將腎小球破碎，得到相對純化的GBM成分，目前多用此法；③單克隆抗體：GBM的主要成分為Ⅳ型膠原，因此也可以用抗α3(Ⅳ)NCl單克隆抗體或抗α3(Ⅳ)NCI腎毒血清來制備NTSN，但是單克隆抗體價格昂貴。因此，有人在第二種方法的前提下，加入膠原酶，提取相對較純的可溶性的GBM成分。

將上述方法提取的GBM成分用生理鹽水稀釋后與等量弗氏佐劑乳化后皮下注射或腹腔注射免疫B種動物，用間接免疫熒光、瓊脂雙向擴散法檢測抗體的效價，抗體的滴度直接決定血清的使用劑量及造模成功與否。免疫成功后留取血清，加熱(56℃)滅活補體，與A動物紅細胞混勻后吸附過夜，離心收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 造模

3.3.1 造模方法

得到一定滴度的抗體血清后，經(jīng)一次性靜脈注射給A種動物開始造模。目前造模的方法主要有兩種：①非加速型：直接將腎毒血清經(jīng)靜脈注射給A種動物；②加速型：在注射腎毒血清前的5～7 d，使用LPS或B種動物的IgG進行預免疫。

除WKY大鼠外，由于非加速型模型造模所需時間較長，因此目前多使用加速型模型。加速的方法是用IgG或LPS進行預免疫，那么兩種加速型的方法有什么區(qū)別呢？李向陽等[30]使用兔IgG和LPS對兩組昆明小鼠進行預免疫，在注射腎毒血清后的第7天，兩組尿蛋白、血肌酐和血尿素氮含量均明顯升高，高于正常對照組，且兔IgG預免疫組升高更明顯；兔IgG預免疫組在第14天可見新月體開始形成，21 d有大量新月體形成，而LPS預免疫組在第21天才有少量新月體形成。由此可見，IgG預免疫加速型模型反應(yīng)更為劇烈，形成新月體較早，而LPS容易誘發(fā)小鼠產(chǎn)生Shwartzman-Sanarelli現(xiàn)象，造成組織損傷壞死，因此目前較少使用。IgG預免疫可以加速造模的時間，但是改變了體液免疫時相，縮短了異體反應(yīng)時相，不利于免疫機制的精細研究。因此，臨床上應(yīng)根據(jù)實驗目的選擇合適的造模方法。

圖1 NTSN模型的體液免疫機制Figure 1 The humoral immune mechanisms of NTSN model

3.3.2 最佳血清劑量

不同種屬的實驗動物，對腎毒血清的敏感性不同，因此最佳血清劑量也不盡相同。早在1965年，Unanue等[4]就提出該模型的建立,取決于兩個因素：(1)結(jié)合到受體腎小球中異源性抗GBM的抗體量；(2)受體對異源性IgG的免疫反應(yīng)。經(jīng)預免疫的動物，亞致腎炎劑量(若無預免疫，不產(chǎn)生蛋白尿)的血清即可誘發(fā)典型的新月體形成[5,20]，預免疫除了可以加速造模的時間，還可以減少腎毒血清的用量，且不同窩別、年齡、性別的動物對腎毒血清的敏感性可能也存在差異，因此實驗中最佳血清劑量須經(jīng)預實驗確定。

4 NTSN造模過程的免疫機制

NTSN的造模過程繁瑣，免疫機制相對復雜。該模型的病理改變主要是體液免疫、細胞免疫、多種細胞因子共同作用的結(jié)果。

4.1 體液免疫

B種動物的腎毒血清經(jīng)靜脈注射給A種動物后，會經(jīng)歷兩個體液免疫時相，即早期的異體反應(yīng)時相和晚期的自體反應(yīng)時相[1]。下面以兔代替B種動物，大鼠代表A種動物為例，闡述如下(見圖1)。

外源性的抗GBM抗體(兔抗鼠GBM抗體，兔IgG★)與大鼠的GBM存在相同的抗原決定簇，因此流經(jīng)腎時可以迅速結(jié)合到GBM處，免疫熒光可見IgG呈線性沉積，這就是早期的異體反應(yīng)時相，該時期出現(xiàn)內(nèi)皮細胞與GBM部分分離、足突融合等輕微的病理變化[6]。

外源性的抗GBM抗體(兔IgG★)對于大鼠來說是一種抗原，約7～10 d后，進入自體反應(yīng)時相，大鼠會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體(鼠抗兔IgG★抗體)，這一抗體與GBM上和循環(huán)中的抗原(兔IgG★)結(jié)合，導致原位和循環(huán)免疫復合物形成，GBM的免疫熒光呈不連續(xù)的顆粒狀，原位和循環(huán)免疫復合物介導Ⅲ型超敏反應(yīng)的發(fā)生，激活補體系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)和炎癥細胞等，GBM明顯增厚、皺縮，部分斷裂，球囊黏連，最終導致新月體形成[6, 31]。

而加速型NTSN實際上是縮短了異體反應(yīng)時相，提前使大鼠產(chǎn)生抗兔IgG的抗體(鼠抗兔IgG▲抗體)，當腎毒血清(兔IgG★)注射給大鼠時，大鼠早已產(chǎn)生的抗兔IgG的抗體立即與其結(jié)合，產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)。

由于形成的原位免疫復合物顆粒較大，加之又有循環(huán)免疫復合物及補體的沉積，原位和循環(huán)免疫復合物不能及時被清除，則誘發(fā)細胞Ⅳ型超敏反應(yīng)，在一系列酶和細胞因子的作用下，基底膜受損，腎小球壁層上皮細胞增生，最終導致新月體形成，見圖1。

4.2 細胞免疫

免疫細胞介導的腎損傷是新月體腎炎的發(fā)病基礎(chǔ)[32-33]，其中T淋巴細胞產(chǎn)生多種炎癥因子，在新月體腎炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。T淋巴細胞包括多種細胞亞群，如Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、γδT細胞和NKT細胞等。Summers等[34-35]建立NTSN模型，發(fā)現(xiàn)模型組Th1細胞、Th17細胞中的轉(zhuǎn)錄因子T盒(T-box expressed in T cell，T-bet)、維甲酸相關(guān)孤核受體γt表達升高，提示Th1細胞、Th17細胞參與新月體腎炎腎小球損傷的病理過程。Guo等[36]也發(fā)現(xiàn)IL-17參與腎損傷。Paust等[37]發(fā)現(xiàn)Th17細胞、Th1細胞分別作用于新月體腎炎的不同時期，Th17細胞在新月體腎炎早期(第5～10天)發(fā)揮主要作用，而Th1細胞則在新月體腎炎后期(第20天后)作用逐漸增強。但是Sally等[38]發(fā)現(xiàn)腎肥大細胞產(chǎn)生的IL-17具有保護作用。

Th1細胞介導的免疫應(yīng)答促進新月體的形成，而調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)具有免疫抑制作用，通過分泌IL-10等方式抑制其他T細胞的功能和B細胞的抗體合成，發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用，在新月體腎炎形成過程中具有重要的意義。Diefenhardt等[39]通過敲除IL-10受體的小鼠建立NTSN模型，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，模型組Th17介導的免疫應(yīng)答增強，腎損傷加重。Takabatake等[9]運用NTSN模型發(fā)現(xiàn)CD28的單克隆抗體JJ316減少了模型組大鼠的蛋白尿、新月體的形成、巨噬細胞和CD8+細胞聚集，同時伴隨Treg增多，且在發(fā)病第3天單次注射JJ316可以阻止WKY大鼠在2月內(nèi)死亡，因此，JJ316可能通過擴增和激活Treg細胞對新月體腎炎起顯著的治療作用。NKT細胞也對新月體的發(fā)展起抑制作用[40]。細胞免疫是新月體形成的關(guān)鍵，吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase, IDO)是催化色氨酸代謝通路中的裂解吡咯環(huán)關(guān)鍵步驟的限速酶，可明顯抑制T細胞介導的細胞免疫。Hou等[12]建立加速型NTSN模型，發(fā)現(xiàn)IDO活性在NTSN小鼠血清和腎組織中明顯升高，免疫組化顯示IDO在小球和腎小管上皮細胞表達明顯上調(diào)；用1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan, 1-MT)抑制IDO活性，腎病變惡化，新月體形成增加，CD4+T細胞和巨噬細胞在腎組織聚集，腎損傷加劇，這些研究結(jié)果表明新月體腎炎的發(fā)生發(fā)展受IDO活性的負向調(diào)節(jié)。

5 結(jié)語

綜上所述，NTSN造模方法雖繁瑣，但易于掌握、制作容易、造模成功率高、病變典型、重復性好、免疫機制復雜，臨床廣泛應(yīng)用于研究原發(fā)或繼發(fā)的免疫復合物介導的新月體腎炎。