乳頭瘤病毒感染小鼠模型的研究進展

李 丹，王 衛(wèi)

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染可導致宮頸癌等多種疾病。截至2018年5月，乳頭瘤病毒基因組數據庫(PaVE)已收錄乳頭瘤病毒(papillomavirus，PV)基因型400種，其中193種為人乳頭瘤病毒[1]。針對HPV感染的預防，目前已有三種批準上市的疫苗，分別為二價、四價和九價HPV疫苗。雖然現有HPV疫苗可有效預防大多數引起宮頸癌病變的HPV感染[2-3]，但目前尚無針對HPV感染后病變或引起惡性腫瘤的有效治療方法。

1 乳頭瘤病毒及感染模型

乳頭瘤病毒為無包膜雙鏈DNA病毒，可感染哺乳類、鳥類及爬行類動物的粘膜和/或皮膚上皮細胞，并引起良性或惡性腫瘤[4-5]。1983年首次發(fā)現人乳頭瘤病毒[6]。大部分HPV感染皮膚主要引起良性病變或疣，例如HPV 1型和HPV 2型感染導致足底病變，而HPV 2型和HPV 4型可引起手上常見的疣[7]。約40種HPV可通過性傳播感染肛門或/和生殖器區(qū)粘膜，如HPV 6型及HPV 11型感染可引起生殖器疣或其它病變[8-9]。根據引起的臨床表現不同，HPV又分為高危型HPV(high risk human papillomavirus，HR-HPV)和低危型HPV(low risk human papillomavirus，LR-HPV)。持續(xù)感染的HR-HPV可使宿主細胞發(fā)生變化，導致肛門或/和生殖器或其它部位癌癥。研究證明HR-HPV感染可引起約5%的人類癌癥，包括宮頸癌、皮膚癌、口腔癌、肛門癌等[10-14]。

由于宿主特異性，HPV只能感染人，不能感染其它動物，這就限制了HPV感染動物模型的研發(fā)。1933年，Shope等[15]在棉尾兔中發(fā)現了一種乳頭瘤病毒，稱之為Shope乳頭瘤病毒或棉尾兔乳頭瘤病毒(cottontail rabbit papillomavirus，CRPV)。然而，家兔不是CRPV感染的天然宿主，在感染部位只能檢測到極低表達水平的病毒感染。隨后，陸續(xù)發(fā)現了犬口腔乳頭瘤病毒(canine oral papillomavirus，COPV)、牛乳頭瘤病毒(bovine papillomavirus，BPV)等，這些病毒感染動物模型的建立為HPV的感染過程、生命周期和發(fā)病機制以及在疫苗評價方面做出了重要貢獻[16]。但由于這些動物體積較大，且其生物學、遺傳學、免疫學與人類差別過大，以及實驗試劑局限等原因，限制了這些感染模型的應用。因此，迫切需要建立小動物模型，從而有效支撐HPV相關疾病的研究。

2 MmuPV1病毒及基因組結構

1989年，Tilbrook等人[17]從經紫外線照射的無毛小鼠的腫瘤組織中鑒定出小鼠乳頭瘤病毒DNA，但并未對此病毒進行分離或基因測序。2011年印度科學家從感染的NMRI-Foxn1nu/nu裸鼠上分離得到小鼠乳頭狀病毒(mouse papillomavirus type 1，MmuPV1)，該病毒可感染實驗小鼠，首次提供可用于乳頭瘤病毒小鼠模型制備的病毒[18]。

與HPV一樣，MmuPV1也是環(huán)狀雙鏈DNA，其基因組長度為7510 bp，至少編碼7個開放閱讀框(ORFs)，基于其在病毒基因組內的保守序列，以及與其它乳頭瘤病毒長度相當的ORF，MmuPV1基因分別命名為E1、E2、E4、E6、E7、L1及L2，分為早期編碼區(qū)(包含E1、E2、E4、E6與E7基因)和晚期編碼區(qū)(包含L1與L2基因)兩種。早期編碼區(qū)分子負責病毒復制、轉錄及翻譯，與多個宿主基因相互作用，并導致細胞惡性轉化，促進腫瘤的發(fā)生。其中，MmuPV1 E1和E2分子與其它乳頭瘤病毒一樣，是病毒DNA復制和轉錄關鍵因子[19-20]。HPV研究表明，E5、E6和E7分子可刺激感染的細胞增殖，并調節(jié)角質形成細胞分化，是主要的致癌基因。β-HPV可能因缺乏E5 ORF而使其無法引起嚴重的惡性腫瘤。與β-HPV類似，MmuPV1也無E5 ORF。與皮膚型HPV和某些粘膜低危型HPV類似[21-22]，MmuPV1利用兩個獨立的早期啟動子表達病毒E6(P7503)基因和E7(P360)基因，其中P7503是強啟動子。而高危型HPV E6和E7基因的表達是由E6 ORF上游的單個早期啟動子表達，而E7基因的表達需要在早期轉錄物中剪接掉E6基因的內含子。MmuPV1的第三個早期啟動子P859，其可能是表達E2和(或)E8^E2基因的弱啟動子。Dreer等人[23]研究證明E8^E2作為負調控基因，通過細胞NCoR/SMRT復合物抑制HPV16基因組擴增。同時，MmuPV1有兩個晚期啟動子，P7107(在L1 ORF下游的LCR區(qū)域內)和P533(在E7 ORF內)[24]。確定MmuPV1基因組結構及病毒基因表達圖譜，有助于了解導致乳頭瘤病毒感染機制和相應病毒基因的致病機制。

3 MmuPV1感染及其機制

多家實驗室報道，MmuPV1感染免疫健全的小鼠品系不會引起相應的乳頭狀瘤病，如BALB/c、FVB/NJ和C57/BL6等[18, 25-27]。但MmuPV1感染免疫缺陷小鼠卻可導致乳頭狀瘤病，免疫健全小鼠品系在免疫抑制后，如注射免疫抑制藥物環(huán)孢菌素、照射UVB(ultraviolet B)和注射抗CD3抗體，感染MmuPV1也可出現乳頭狀瘤癥狀[25-26, 28]?；蚓庉媱游锏膶嶒灲Y果也支持該結論，MmuPV1感染攜帶FoxN1nu/nu突變基因的小鼠，其病變區(qū)組織病理學分析顯示，與PV相關疾病特征一致，即具有PV特異性抗原陽性的空泡細胞乳頭狀突起[18]。不同轉基因或基因敲除而導致免疫缺陷的小鼠品系研究中發(fā)現，T細胞缺失對于MmuPV1的自然感染至關重要，而MmuPV1不能感染僅缺失B細胞的小鼠品系[29]。但尚不明確何種T細胞亞群在其中發(fā)揮主要作用。Handisurya等人[26]利用抗體耗竭C57BL/6小鼠與SENCAR小鼠CD4+或CD8+T細胞后感染MmuPV1，發(fā)現缺失CD4+或CD8+T細胞的SENCAR小鼠均可產生乳頭瘤病變，但缺失CD4+或CD8+T細胞的C57BL/6小鼠未發(fā)現病變。其他研究人員也得到類似結論[29-30]。

此外，小鼠品系也對MmuPV1的致瘤具有影響，見表1。SHO-PrkdcscidHrhr小鼠可感染MmuPV1，并在多處組織器官出現繼發(fā)感染[30]。然而，NOD(non-obese diabetic)遺傳背景的SCID小鼠感染MmuPV1后并未出現相關的皮膚乳頭狀瘤[29]。Handisurya等人[26]研究發(fā)現，H2單倍型背景對于MmuPV1的易感性并無相關性，如同是H2b單倍型的C57BL/6小鼠和129S6/SvEv小鼠，前者對病毒不易感，而后者易感；同為H2d單倍型的DBA/2NCr小鼠和BALB/cAnNCr小鼠，前者不易感，后者易感。

4 MmuPV1的致病及其機制

參與PV致癌作用最重要的兩個基因分別是E6和E7早期基因，目前已發(fā)現多個E6和E7的靶基因，其中一些在病毒感染機體后功能性失活，從而導致組織器官病變甚至惡性腫瘤的發(fā)生。與其它PV一樣，MmuPV1也含有這兩種推定的病毒致癌基因，E6和E7基因，兩種基因產物在體外研究中表現出顯著的增殖活性以及體內致瘤性[34]。系統(tǒng)發(fā)育學研究表明，MmuPV1是π屬成員，與γ-和β-HPV關系密切[35]。

MmuPV1 E6基因在病毒誘導的裸鼠乳頭狀瘤中起關鍵作用[36]，其長度約150個氨基酸，目前已經鑒定出PV E6可與多種細胞內基因結合而發(fā)揮功能，如paxillin蛋白[37]、細胞E3泛素連接酶E6AP[36]、核轉錄激活蛋白家族mastermind-like 1(MAML1)[38-39]及干擾素調節(jié)因子-3(interferon regulatory factor-3，IRF3)[40]等。Meyers等人[36]發(fā)現MmuPV1 E6基因與HPV8 E6基因作用于相似的靶基因，通過與TGF-β信號傳導通路中SMADs(R-SMADs)2和3調節(jié)的受體作用，以及與NOTCH信號傳導通路的重要共激活因子MAML1基因結合，抑制這兩條重要的腫瘤抑制通路。NOTCH和TGF-β腫瘤抑制因子是角質形成細胞分化和空泡細胞形成的關鍵因素，通過改變細胞周期和驅動角質形成細胞向終末分化，并最終導致細胞死亡。

PV研究中另一個重要的致癌基因是E7基因。通常情況下，細胞發(fā)生非程序性增殖時，可通過誘導細胞凋亡來清除增殖的細胞。所以，PV E7就可能誘導細胞的凋亡。同其它致癌型PV E7一樣，MmuPV1 E7可結合PTPN14使其降解，PTPN14基因是經典的非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶[41]。MmuPV1 E7基因與γ-HPV197 E7基因相似，均缺少視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)基因結合位點，多種PV E7基因可通過與腫瘤抑制蛋白RB蛋白家族結合進而導致惡性病變[42]。E6和E7基因通常是共同發(fā)揮作用，例如逃避免疫系統(tǒng)，這樣其中一個基因的變化都會引起另一種基因的改變[43]。這些研究結果推測，MmuPV1 E6和E7基因可能與高危型人乳頭瘤病毒E6和E7基因共享致癌特性。

5 MmuPV1小鼠模型的特點及其應用

MmuPV1感染小鼠模型，自首次報道以來，多個科研團隊在病毒免疫學、分子生物學等方面取得可觀的進展[18, 25-26, 28-33, 36, 44]。其中重要的發(fā)現及含義如下。

5.1 首個用于乳頭瘤病毒感染口腔、肛門生殖器等粘膜及相關疾病的小動物模型

超過66%的宮頸癌都與HPV的感染有關。現有的HPV預防性疫苗對已致病個體治療效果不明顯，因此，治療性疫苗的研究至關重要。已有的研究表明，某些免疫健全的小鼠品系可持續(xù)性陰道感染MmuPV1，用于治療性疫苗的測試[45-46]。

HPV有關的口腔癌在年輕男性中呈現上升趨勢[47]。因此，迫切需要一種適合研究口腔HPV相關疾病的臨床前模型。小鼠舌頭、舌根和口咽部都是MmuPV1的感染部位，這表明，MmuPV1感染小鼠模型可作為研究HPV相關口腔癌的理想模型[33, 48]。

表1 MmuPV1感染小鼠品系及解剖部位誘導腫瘤情況的總結

HPV感染的肛門病變病例逐年升高，原因尚不清楚，也無有效的干預措施[49]。MmuPV1可感染肛管，尤其是肛門生殖器的過渡區(qū)[50]。因此，MmuPV1感染小鼠模型也是在肛門癌研究中的亟需模型[51]。

5.2 乳頭瘤病毒感染引起皮膚相關疾病的小動物模型

某些皮膚癌與HPV的感染有關。并且，經紫外線照射的免疫缺陷和免疫健全小鼠品系，MmuPV1感染皮膚上皮組織后，可產生皮膚疣，甚至癌變[25, 52]。因此，MmuPV1感染小鼠模型可作為PV相關皮膚疾病和癌癥進程的一個首選模型。

5.3 乳頭瘤病毒相關組織嗜性及繼發(fā)感染相關疾病的小動物模型

大多數PV具有組織特異性，表現為皮膚或粘膜嗜性。而MmuPV1不但可感染皮膚，也表現出粘膜趨向性[27]。皮膚感染MmuPV1的小鼠不但可以繼發(fā)感染皮膚，還可繼發(fā)感染粘膜[30]，而粘膜感染MmuPV1后，也可擴散到各種皮膚部位[31]。HPV可感染男性和女性生殖器，并且，新生兒的復發(fā)性呼吸道乳頭瘤病就是由于HPV感染而導致[53]，這些繼發(fā)性病變均是由于原發(fā)性病毒脫落引起。上述結果表明，MmuPV1感染小鼠模型不但是皮膚、口腔、肛門生殖器病變、繼發(fā)感染甚至癌變的理想模型，也有助于伴侶之間病毒的橫向傳播和母嬰的垂直傳播[50, 54]研究。

5.4 乳頭瘤病毒感染過程中宿主防御機制研究的小動物模型

免疫健全的小鼠品系可在感染MmuPV1后，感染部位可檢測到病毒載量，但無可見乳頭瘤樣病變。而T細胞缺陷小鼠感染MmuPV1后，可產生乳頭瘤樣病變，甚至演變成腫瘤[29]。而病毒感染清除過程，B細胞雖不直接清除病毒，但產生的體液效應因子幫助T細胞清除病毒及因PV產生的腫瘤[44]。同時，MmuPV1的感染與小鼠品系有關，但相同H2單倍型小鼠品系對病毒的易感性不同。上述研究，有助于我們在不同背景下進行小鼠基因改造，為進一步研究病毒感染中的宿主因素提供幫助。

6 小結

流行病學數據表明，HPV感染與人類某些惡性疾病有關。因此，發(fā)展有效的抗HPV療法是一個重要的醫(yī)學挑戰(zhàn)?，F有HPV感染動物模型，包括HPV轉基因小鼠動物模型及其它PV病毒感染動物模型等，幫助人們理解了HPV感染宿主后的復制過程，以及病毒感染的疾病表型等。如科學家們利用動物模型確定了HPV E6和E7基因是主要致癌基因。但HPV感染誘發(fā)疾病，同時需要其它誘導因素，如遺傳易感性、煙草、雌激素耗竭、輻射以及免疫抑制等，有待進一步研究。因此，還需要加強HPV感染動物模型的研究工作。

鑒于乳頭瘤病毒嗜性和宿主免疫抑制，理想的HPV感染動物模型研究存在諸多困難。在科學家的努力下，構建了數個HPV的參比動物模型，如牛、狗、兔等PV感染模型，但其成本較高和技術困難限制了模型的進一步應用。新分離得到的MmuPV1能感染小鼠，是非常有價值的乳頭瘤病毒，可用于PV病毒感染及相關疾病機制研究，為HPV的感染及致病機制研究提供了更多的機會。