兩種方法制備心搏驟停兔模型的比較

李湘民，姚政彬，朱浙祥，佘長壽，粟 楓，黃國慶*

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院急診科，長沙 410008； 2.湖南省人民醫(yī)院急診科，長沙 410005)

心肺腦復(fù)蘇是急診醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)與難點(diǎn)，我國每年約有54.4萬人發(fā)生心搏驟停(CA)[1]，雖然在美國心臟協(xié)會(AHA)指南推廣下急救人員多數(shù)能夠按照流程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)蘇，但每位患者的具體發(fā)病情況、復(fù)蘇時(shí)間均不盡相同，70%的院前非創(chuàng)傷性CA發(fā)生在家中，且50%沒有第一目擊者[2]，這導(dǎo)致臨床心肺復(fù)蘇(CPR)研究開展困難。故建立標(biāo)準(zhǔn)化的動物模型來研究心肺腦復(fù)蘇過程中機(jī)體的病理生理變化顯得尤為重要。迄今為止，已模擬不同的致病因素建立了心臟電刺激、窒息、大血管夾閉、藥物注射等多種誘導(dǎo)CA的動物模型[3-5]。窒息方式最為便捷，但誘導(dǎo)時(shí)間長達(dá)數(shù)分鐘，個(gè)體變異范圍大?；谂R床上CA多與突發(fā)惡性心律失常有關(guān)，且CA預(yù)后與發(fā)病后無干預(yù)時(shí)間緊密相關(guān)，每分鐘的延誤均可明顯降低存活率，故采用可在短時(shí)間內(nèi)迅速誘發(fā)心室纖顫(室顫)的動物模型更符合臨床研究要求，其中最有代表性的是電致顫和藥物誘導(dǎo)室顫法。注射氯化鉀作為最便捷的藥物誘導(dǎo)CA方式，既往相關(guān)研究多是聯(lián)合肌松藥或窒息誘發(fā)CA[6]，遺憾的是文獻(xiàn)中未明確告知氯化鉀用量，且誘導(dǎo)CA時(shí)間達(dá)2 min以上，并不能達(dá)到快速致顫的目的。本研究摸索了靜注氯化鉀致顫的劑量方法后與經(jīng)食道-胸壁電致顫[7]造模方式進(jìn)行比較，為心肺腦復(fù)蘇后續(xù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性新西蘭大白兔20只，10～12周齡，體重2.1～2.4 kg，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[SCXK (湘) 2014-0010]，飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物部[SYXK (湘) 2015-0017]。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(Sigma公司)；氯化鉀(中國大冢制藥有限公司)；腎上腺素(鄂遠(yuǎn)大醫(yī)藥)。君宇高精度電子秤(JY08型，廣州市君宇家用電子衡器有限公司)；探針式溫度計(jì)(倍爾康DT-001型數(shù)字溫度計(jì)，廣州番禺金鑫寶電子有限公司生產(chǎn))；22G、24G密閉式靜脈留置針(BD Intima ⅡTM，蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；多導(dǎo)監(jiān)護(hù)儀(成都泰盟BL-420s)；2.5#氣管導(dǎo)管(江蘇康樂醫(yī)療器械有限公司)；i-STAT300血?dú)夥治鰞x(美國雅培)；小動物呼吸機(jī)(成都泰盟HX-100E)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備

參照本課題組前期報(bào)道的兔CA模型操作步驟[7]，體重使用高精度電子秤精確稱量，使用探針式溫度計(jì)測量直腸溫度，24G密閉式靜脈留置針穿刺右側(cè)耳緣靜脈，戊巴比妥鈉30 mg/kg由耳緣靜脈注入麻醉[8]，并用22G密閉式靜脈留置針留置股動脈，接多導(dǎo)監(jiān)護(hù)儀行心電、有創(chuàng)動脈壓監(jiān)測，經(jīng)口氣管插管。

1.3.2 動物分組及造模處理

按隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為電致顫組和氯化鉀致顫組，每組10只。氯化鉀致顫組用10%氯化鉀0.3 mL/kg脈沖式靜注誘發(fā)CA。電致顫組經(jīng)食道-胸壁用35 mA交流電誘發(fā)CA，達(dá)標(biāo)后仍持續(xù)電刺激60 s；若持續(xù)電刺激60 s仍達(dá)不到CA標(biāo)準(zhǔn)則停止電刺激，判斷為誘導(dǎo)失敗，待自行復(fù)律循環(huán)穩(wěn)定30 min后再次實(shí)驗(yàn)。CA達(dá)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)為有創(chuàng)動脈壓降至25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以下并動脈搏動波形消失，CA時(shí)間以給予干預(yù)因素后至CA達(dá)標(biāo)開始計(jì)算。兩組均在CA達(dá)標(biāo)后無干預(yù)觀察5 min，觀察期間恢復(fù)室上性自主心律且收縮壓大于25 mmHg者計(jì)為誘導(dǎo)CA失敗。誘導(dǎo)CA 5 min后，參照Utstein模式進(jìn)行CPR，胸外按壓頻率為200次/min，按壓深度為胸廓前后徑的1/3，按壓:放松為1∶1。使用小動物呼吸機(jī)予以間歇正壓通氣，參數(shù)設(shè)定：頻率35次/min，潮氣量10 mL/kg，吸入氧濃度(FiO2)1.00，復(fù)蘇即刻靜脈注射腎上腺素20 μg/kg，必要時(shí)間隔2 min重復(fù)應(yīng)用，如心電監(jiān)護(hù)呈室顫波形則予以20 J單向波除顫并繼續(xù)按壓，必要時(shí)2 min后重復(fù)除顫。自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)且平均動脈壓(MAP)≥ 60 mmHg并維持10 min以上，判定為復(fù)蘇成功。經(jīng)上述流程搶救10 min未能ROSC者為復(fù)蘇失敗。ROSC的動物復(fù)蘇后連續(xù)進(jìn)行心電和血流動力學(xué)監(jiān)測1 h，在ROSC后30 min撤除呼吸機(jī)，1 h后拔除氣管插管及有創(chuàng)動脈置管，縫合傷口下臺，獨(dú)籠飼養(yǎng)，觀察復(fù)蘇后存活時(shí)間，終點(diǎn)為72 h。所有中途死亡及存活至觀察終點(diǎn)的動物常規(guī)進(jìn)行解剖尸檢，觀察是否有與建立模型操作相關(guān)的損傷。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：201403077。動物處置方法符合動物倫理學(xué)3R原則的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 檢測指標(biāo)及方法

記錄動物制模誘發(fā)CA時(shí)間、CPR時(shí)間、實(shí)施除顫比例、ROSC比例及72 h存活情況。復(fù)蘇1 h后取動脈血用血?dú)夥治鰞x行血?dú)夥治鰴z測，記錄pH值、氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)、HCO3-、K+、乳酸(Lac)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組兔術(shù)前一般情況

兩組動物基礎(chǔ)體重、體溫、呼吸頻率(RR)、心率(HR)、平均動脈壓(MAP)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)，說明兩組基線資料均衡，有可比性。

2.2 建立兔CA模型結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中20只兔均成功誘發(fā)CA。電致顫組在開始CPR前有6只心電呈室顫，4只為無脈性電活動(pulseless electrical activity，PEA)；氯化鉀組有3只為室顫，1只為無脈性室速，3只呈PEA，3只呈直線。氯化鉀致顫組誘導(dǎo)CA時(shí)間、CPR時(shí)間較電致顫組均明顯縮短(P<0.01)，但復(fù)蘇過程中除顫成功、ROSC、72 h存活的動物數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)蘇成功后兩組兔HR、MAP均在1 h內(nèi)恢復(fù)平穩(wěn)，無需血管活性藥物維持，對比無明顯差異。見表2，圖1、圖2。

2.3 兩組兔自主循環(huán)恢復(fù)后血?dú)饧吧笜?biāo)比較

兩組均有9只兔自主循環(huán)恢復(fù)，氯化鉀致顫組自主循環(huán)恢復(fù)后1 h pH值、HCO3-均明顯高于電致顫組，Lac明顯低于電致顫組(P<0.05)，PO2較電致顫組更高，PCO2、K+更低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表1 不同方法制備心搏驟停模型兔術(shù)前一般情況比較

表2 不同方法制備心搏驟停模型兔復(fù)蘇參數(shù)比較

注：與電致顫組比較，★★P<0.01。

Note. Compared with the electrical stimulation group,★★P<0.01.

圖1 10%氯化鉀靜脈注射誘發(fā)心搏驟停時(shí)心電圖和血壓的波形變化Figure 1 Electrocardiographic wave and arterial pulse wave after cardiac arrest induced by intravenous injection with 10% potassium chloride

圖2 電刺激誘發(fā)心搏驟停時(shí)心電圖和血壓波形的變化Figure 2 Electrocardiographic wave and arterial pulse wave after cardiac arrest induced by electrical stimulation

組別GroupspHPO2(mmHg)PCO2(mmHg)HCO3-(mmol/L)K+(mmol/L)Lac(mmol/L)電致顫組Electrical stimulation group7.29±0.1175.78±12.3646.74±15.3718.32±2.614.04±0.515.39±3.40氯化鉀致顫組Potassium chloride group7.38±0.06★82.16±13.7437.32±5.1121.86±3.65★3.76±0.281.77±0.77★★

注：與電致顫組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

Note. Compared with the electrical stimulation group,★P<0.05,★★P<0.01.

2.4 建模相關(guān)并發(fā)癥

電刺激組在進(jìn)行電刺激時(shí)均會出現(xiàn)短時(shí)間明顯全身抽搐，在達(dá)到CA標(biāo)準(zhǔn)后抽搐即自行緩解，胸壁表面針灸針接觸點(diǎn)有局部輕微灼傷。CA組及氯化鉀組中各有2例尸體解剖發(fā)現(xiàn)有雙側(cè)肺葉挫傷，均為經(jīng)歷較長時(shí)間復(fù)蘇，考慮與胸外按壓時(shí)間久后按壓部位移位，胸廓彈性下降有關(guān)。所有動物心臟表面均未見明顯損傷，無心包積血。

3 討論

臨床上，非創(chuàng)傷性心搏驟停(CA)多由于冠心病導(dǎo)致，甚至為冠心病的首發(fā)表現(xiàn)，其中75%～80%的CA患者首先記錄到的心律失常是室顫[9]，因此在心肺腦復(fù)蘇基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，使用各種方式誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物室顫可較好地模擬臨床上CA的病理生理過程。電致顫是最為經(jīng)典的誘發(fā)室顫方式，無論是精細(xì)的右心導(dǎo)管電極刺激心內(nèi)膜或是開胸電刺激心外膜[10]、以及本研究采用的經(jīng)食道-胸壁電刺激[7]，均可快速有效地實(shí)現(xiàn)致顫。本課題組前期研究已證實(shí)，經(jīng)食道-胸壁電刺激致顫操作方便，致顫效率高，同時(shí)有較高的復(fù)蘇成功率[7]。但在實(shí)驗(yàn)過程中我們也發(fā)現(xiàn)，電刺激致顫模型存在一定的弊端：小動物基礎(chǔ)心率快，無論大鼠或兔平均心率均在200次/min以上，具有很強(qiáng)的抗心律失常能力，高頻電刺激雖可快速誘發(fā)室顫，但在停止電刺激后，可迅速恢復(fù)竇性節(jié)律，導(dǎo)致制模失敗，故電刺激需要持續(xù)一段時(shí)間以防止自動復(fù)律。本研究中持續(xù)電刺激60 s致顫，電流引起的軀干肌肉持續(xù)收縮會導(dǎo)致較為嚴(yán)重的酸中毒，血?dú)夥治鼋Y(jié)果證實(shí)，在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后1 h，電刺激組pH值更低，且PCO2也高于氯化鉀致顫組，可能與電刺激導(dǎo)致支氣管平滑肌痙攣引起通氣障礙有關(guān)；電致顫制模產(chǎn)生的微循環(huán)灌注障礙更為明顯，表現(xiàn)在血Lac更高，這些因素都導(dǎo)致了制模動物在復(fù)蘇后有較差預(yù)后。

本研究使用脈沖式直接注射10%氯化鉀原液0.3 mL/kg，可在10 s內(nèi)快速誘發(fā)CA，其中以無脈性室性心動過速(室速)為主，部分為無脈性電活動。與經(jīng)食道-胸壁電致顫相比，氯化鉀致顫誘發(fā)CA時(shí)間更短，可控性更強(qiáng)，且復(fù)蘇成功率亦較高，ROSC所需時(shí)間明顯短于電致顫組，這使得CA-ROSC時(shí)間變異度更小，更具有可比性。氯化鉀致顫組兔復(fù)蘇成功后無一因?yàn)楦哜浹Y再次發(fā)生惡性心律失常。令人驚訝的是，ROSC后1 h血K+正常，甚至低于電致顫組，血Lac水平基本正常，復(fù)蘇后72 h存活率優(yōu)于電致顫組。左艷芳等[11]也對比過氯化鉀致顫和食道電刺激致顫對小鼠CA模型的影響，證實(shí)氯化鉀組有更高存活率。楊葉桂等[12]通過在復(fù)蘇時(shí)靜注2.5%氯化鉀0.8 mL/kg來提高室顫大鼠血K+濃度，證實(shí)高鉀有助于提高室顫振幅，促使室顫自動復(fù)律，進(jìn)而增加復(fù)蘇成功率。本課題組前期小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯化鉀的注射速度對于能否誘發(fā)CA非常重要，超過5 s的緩慢注射多數(shù)僅引起室性心律失常，但很快即恢復(fù)正常；能否發(fā)生致命性心律失常取決于瞬時(shí)通過心臟的血K+濃度，脈沖式注射在1 s左右完成，可造成來不及稀釋的高濃度血K+進(jìn)入冠狀動脈循環(huán)而干擾心肌電活動誘發(fā)CA，這種局部血管內(nèi)的高鉀血癥在復(fù)蘇過程中隨著全身循環(huán)的血液稀釋迅速使體循環(huán)血K+降至正常水平[13]。我們前期小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)10%氯化鉀達(dá)到0.5 mL/kg時(shí)復(fù)蘇成功率明顯降低，而0.2 mL/kg誘導(dǎo)CA成功率則明顯下降，故采用0.3 mL/kg的劑量。氯化鉀作為心跳停搏液的主要成分，已明確其具有心肌保護(hù)作用[14]。對于心肺腦復(fù)蘇研究而言，因?yàn)閯游锬Ｐ蜔o法根本上模擬心臟的慢性病變過程，而各種制模手段所產(chǎn)生的心肌直接損傷會對復(fù)蘇后循環(huán)穩(wěn)定產(chǎn)生巨大影響，復(fù)蘇后低心排及由此產(chǎn)生的酸中毒等不利因素是導(dǎo)致模型動物復(fù)蘇后短期死亡的主要原因。在以腦復(fù)蘇為主要目的的研究中我們更側(cè)重觀察全腦缺血/再灌注(I/R)損傷，故氯化鉀的致顫作用及心肌保護(hù)作用就顯得尤為有價(jià)值。CA導(dǎo)致腦損傷的差異重點(diǎn)在全腦I/R時(shí)間，CA時(shí)間的精確界定有助于模型的標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性，靜注氯化鉀不僅讓CA制模過程變得更為便捷、精準(zhǔn)，復(fù)蘇也更為便利，可以更好匹配制模過程中導(dǎo)致的全腦I/R損傷，以利于后續(xù)研究。