甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用

李紅威，張 玲，李 卓，秦 川

(國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

甲醛是一類廣泛存在于自然環(huán)境和人類生活環(huán)境中的醛類分子，其分子結(jié)構(gòu)簡單，化學(xué)性質(zhì)活潑，是一種能導(dǎo)致DNA損傷的毒性分子，它是一種強(qiáng)力的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)劑[1-2]。但在體細(xì)胞增殖和發(fā)揮正常功能所必須的一碳循環(huán)(one carbon cycle)中，絲氨酸酶解生成內(nèi)源性甲醛，內(nèi)源性甲醛作為體細(xì)胞正常生命活動(dòng)的一種副產(chǎn)物，機(jī)體在維持正常生理機(jī)能和代謝平衡方面有著固有的抵御甲醛威脅的雙重保護(hù)機(jī)制，使機(jī)體免受內(nèi)源性甲醛的侵害。機(jī)制之一即醇脫氫酶3(ADH3)將內(nèi)源性甲醛轉(zhuǎn)化為甲酸[3]，進(jìn)而促進(jìn)核苷酸的合成；而通過范科尼貧血途徑(Fanconi anaemia pathway)進(jìn)行DNA交聯(lián)修復(fù)，逆轉(zhuǎn)甲醛所致的DNA損傷為機(jī)制之二[4]。

過量的甲醛會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，有研究發(fā)現(xiàn)[5]在甲醛濃度超標(biāo)的環(huán)境中長期工作，對(duì)暴露者的記憶力、注意力以及感覺認(rèn)知等方面均有不同程度的損害。臨床研究表明[6]，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者的尿液甲醛濃度顯著高于同齡正常老年人，且與認(rèn)知功能下降程度呈正相關(guān)。神經(jīng)細(xì)胞特別是神經(jīng)元的減少和丟失是認(rèn)知障礙性疾病AD的特征性病理表型[7]。然而，目前對(duì)甲醛損傷神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究，我們利用SH-SY5Y細(xì)胞系作為神經(jīng)細(xì)胞的體外模型，探索甲醛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，為甲醛損傷神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)，也為我們后續(xù)建立神經(jīng)細(xì)胞損傷的體內(nèi)模型提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SYSY)細(xì)胞系作為研究對(duì)象，由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心/國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)提供。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(FBS)、RPMI-1640購自美國Gibco公司；甲醛、PMSF購自美國Sigma公司；Cell Titer-Glo? Luminescent Cell Viability試劑盒購自美國Promega公司；NE-PER Nuclear and Cytoplastic Protein Extraction試劑盒、Protease inhibitor cocktail購自美國Thermo公司；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒購自日本同仁公司；T231兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；6E10鼠單克隆抗體購自美國Biolegend公司；DRP1(dynamin-related protein 1)兔單克隆抗體購自美國CST公司；MID49(mitochondrial dynamics protein 49)、MID51(mitochondrial dynamics protein 51)兔多克隆抗體購自美國Proteintech公司；anti-β-tubulin內(nèi)參購自中國中杉金橋公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國NAPCO公司；超凈工作臺(tái)購自中國北京半導(dǎo)體設(shè)備廠；流式細(xì)胞儀購自美國AccuriTMBD Biosciences公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國PerkinElmer公司；JEM-1400 Plus電鏡購自日本電子株式會(huì)社；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將SH-SY5Y細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分包括：10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及RPMI-1640，置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組與處理

若無特殊說明，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組均按表1所示進(jìn)行處理。

表1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的分組及處理

注：處理方式即將不同濃度甲醛加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基/無血清培養(yǎng)基中混勻而成。

Note. The treatment method involved mixing of different formaldehyde concentrations into RPMI-1640 complete or serum-free medium.

1.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)具體步驟參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，處理完畢立刻于顯微鏡下選取固定位點(diǎn)，拍照后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。之后分別以6 h、12 h、24 h為時(shí)間點(diǎn)拍照，最后用Image-pro Plus軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕面積變化；處理30 h后高倍觀察并拍照。

1.3.4 細(xì)胞活性檢測實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以104個(gè)/mL的比例接種于管壁不透明的96孔板內(nèi)，每孔100 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)處理組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，只加入培養(yǎng)基而不加入細(xì)胞；第二日將常規(guī)培養(yǎng)基更換為含甲醛的培養(yǎng)基，分別作用2 h和4 h時(shí)，提前30 min從培養(yǎng)箱取出平衡至室溫，加入100 μL/孔CellTiter-Glo試劑，室溫孵育10 min后在酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光值。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測

參照文獻(xiàn)[9]應(yīng)用Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒進(jìn)行各處理組的細(xì)胞凋亡檢測，其中Annexin V-/PI-代表細(xì)胞正常；Annexin V+/PI-代表細(xì)胞早期凋亡；Annexin V+/PI+代表細(xì)胞晚期凋亡/死亡；Annexin V-/PI+代表細(xì)胞機(jī)械性死亡。

1.3.6 透射電鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

將各組細(xì)胞處理完畢后用0.125%胰酶消化，離心后棄上清，PBS重懸，使其密度不低于1×107個(gè)/mL，再離心形成細(xì)胞沉淀，加入足量2.5%戊二醛，4℃固定過夜。第二日用PBS(pH=7.2)沖洗三次，每次10 min；之后1%鋨酸4°C固定2 h，雙蒸水沖洗三次，每次10 min；梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換處理，樹脂浸透，包埋，制成90 nm厚的超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，應(yīng)用JEM-1400 Plus電鏡觀察。

1.3.7 免疫印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞以相同濃度接種于6孔板，待生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，加入各處理因素，作用4 h。處理結(jié)束后收集細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，濃縮膠為5%，分離膠為10%，加樣量為30 μg，60 V恒壓電泳30 min至條帶到達(dá)分離膠(溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠)，調(diào)至100 V恒壓電泳至蛋白marker分離開合適間距(約1～1.5 h)，即結(jié)束電泳。用濕法電轉(zhuǎn)印將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(300 mA，1 h)，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫孵育60 min，分別加入一抗T231、6E10、DRP1、MID49、MID51，稀釋比例均為1∶1000，4℃過夜；第二日TBST漂洗三次，每次10 min，然后加入二抗，稀釋比例1∶7500，室溫孵育1 h；anti-β-tubulin內(nèi)參(1∶7500)室溫孵育1 h；TBST漂洗三次，將ECL發(fā)光試劑A和B液等體積混合，均勻加到PVDF膜上，反應(yīng)約1 min，置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，自動(dòng)顯影。利用Image J軟件進(jìn)行條帶光密度值的分析，并利用目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的光密度比值比較目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而比較不同樣本目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量之間的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞遷移能力的影響

相對(duì)于對(duì)照組，甲醛處理組的SH-SY5Y細(xì)胞的遷移能力降低，其與甲醛濃度相關(guān)。甲醛處理濃度越高，對(duì)遷移能力的影響越大，細(xì)胞遷移能力越低。如圖1所示，在甲醛作用24 h后，與對(duì)照組相比，甲醛組劃痕縮小面積均存在顯著性差異(P<0.001)。FA-1(1 mmol/L)組細(xì)胞則在甲醛作用19 h后全部死亡，而在培養(yǎng)24 h后FA-0.5(0.5 mmol/L)組細(xì)胞死亡約10%，F(xiàn)A-0.25(0.25 mmol/L)組也存在少量細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

注：A：劃痕后于0 h、6 h、12 h、24 h拍照?qǐng)D片；B：劃痕24 h后各組間遷移面積的比較；C：劃痕后0 h、6 h、12 h、24 h各組遷移面積的改變。與對(duì)照組比較，***P<0.001。標(biāo)尺=100 μm。圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示甲醛作用對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞遷移能力的影響Note. A, Images acquired at 0 h, 6 h, 12 h, and 24 h after scratching. B, Comparison of migration areas between groups at 24 h after scratching. C, Changes in migration area of each group at 0 h, 6 h, 12 h, and 24 h after scratching. Compared with the control group, ***P<0.001. Bars=100 μm.Figure 1 Scratch testing revealed the effect of formaldehyde on the migratory ability of SH-SY5Y cells

2.2 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響

結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，在甲醛作用2 h后，F(xiàn)A-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)及FA-0.25(0.25 mmol/L)組細(xì)胞存活率均顯著降低，P值分別為0.0003，0.0460， 0.0400；而FA-0.1(0.1 mmol/L)組、FA-0.05(0.05 mmol/L)組細(xì)胞存活率雖然有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.072，0.095。在甲醛作用4 h后，與對(duì)照組相比，F(xiàn)A-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)組及FA-0.1(0.1 mmol/L)組細(xì)胞存活率均顯著降低，P值分別為0.001，0.002， 0.001，0.002；而FA-0.05(0.05 mmol/L)組細(xì)胞存活率雖然有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.101。在FA-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)組，作用4 h與作用2 h相比，細(xì)胞存活率也出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，P值分別為0.014，0.037，0.044；而在FA-0.1(0.1 mmol/L)組和FA-0.05(0.05 mmol/L)組，作用4 h與作用2 h相比，細(xì)胞存活率差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.382，0.990。

注：分別于甲醛作用2 h、4 h檢測。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；同一處理濃度組內(nèi)的不同時(shí)間比較，#P<0.05。圖2 CTG細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響Note. Detection after formaldehyde treatment for 2 h and 4 h, respectively. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Comparison between different time points within the group treated with the same concentration, #P<0.05.Figure 2 CTG cell viability assay revealed the effect of formaldehyde on SH-SY5Y cells

2.3 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

在中高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。如圖3所示，當(dāng)甲醛作用30 h后拍照，與對(duì)照組相比，甲醛處理組細(xì)胞隨著甲醛濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)的改變愈加明顯。FA-0.05(0.05 mmol/L)組細(xì)胞數(shù)量輕度減少，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；而FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)、FA-0.1(0.1 mmol/L)組細(xì)胞依次減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸不規(guī)則，神經(jīng)突樣結(jié)構(gòu)變短、消失，出現(xiàn)大量凋亡及死亡細(xì)胞；而FA-1(1 mmol/L)組細(xì)胞則全部死亡，只留細(xì)胞輪廓尚存，細(xì)胞失去活性，暗淡無光。

2.4 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比較，F(xiàn)A-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)、FA-0.1(0.1 mmol/L)組的細(xì)胞早期凋亡水平顯著性升高(P<0.001)，而FA-0.05(0.05 mmol/L組細(xì)胞的早期凋亡水平與對(duì)照組未見顯著性差異，P=0.078；這與細(xì)胞活性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。在晚期凋亡方面，甲醛處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡水平均存在顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)A-0.05(0.05 mmol/L)組不同時(shí)間比較，P=0.043；其余各組相比，均P<0.001。

注：中高倍顯微鏡下拍攝細(xì)胞形態(tài)，于甲醛作用30 h后拍攝。藍(lán)色標(biāo)尺=100 μm。圖3 甲醛作用對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響Note. Cell morphology was photographed under medium- and high-magnification 30 h after formaldehyde treatment. Blue bars=100 μm.Figure 3 Effect of formaldehyde on cell morphology

注：A：Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡水平(%)，包括早期凋亡和晚期凋亡及死亡細(xì)胞的水平。B：不同處理組間細(xì)胞凋亡率相比較，可見與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與不同濃度甲醛處理組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖4 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡的影響Note. A, Annexin V/PI double staining assay for apoptosis levels (%), including early apoptosis, late apoptosis, and dead cells. B, Ratios of apoptotic cells in different treatment groups were compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; or compared between formaldehyde treatment groups of different concentrations, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 4 Effect of formaldehyde on apoptosis in SH-SY5Y cells

2.5 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)線粒體的影響

注：A：不同處理組間亞細(xì)胞器線粒體的比較，包括2000倍視野下的平均數(shù)量與形態(tài)改變，紅色箭頭指示線粒體；B：不同處理組間2000倍視野下線粒體的平均數(shù)量比較，與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與不同濃度甲醛處理組比較，##P<0.01。圖5 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體的影響Note. A, Comparison of mitochondria between different treatment groups, including the average number and morphological changes under a 2000× visual field. Red arrows indicate mitochondria. B, Average number of mitochondria in 2000× field of different treatment groups was compared with the control group, *P<0.05, ***P<0.001; or compared between formaldehyde treatment groups of different concentrations, ##P<0.01.Figure 5 Effect of formaldehyde on mitochondria of SH-SY5Y cells

在透射電鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞，對(duì)其超微結(jié)構(gòu)線粒體進(jìn)行重點(diǎn)觀察，發(fā)現(xiàn)不同處理組間線粒體的損傷程度存在一定的差異。如圖5所示，在數(shù)量方面，對(duì)照組細(xì)胞線粒體密集，均勻分布；與對(duì)照組相比，F(xiàn)A-0.05(0.05 mmol/L)組和FA-0.1(0.1 mmol/L)組線粒體數(shù)目雖有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.158，0.288；FA-0.25(0.25 mmol/L)組則線粒體數(shù)目顯著性減少，P=0.013；FA-0.5(0.5 mmol/L)組和FA-1(1 mmol/L)組與對(duì)照組相比，線粒體數(shù)目減少地更加顯著，P值分別為0.0009，0.0007。而在線粒體形態(tài)方面比較，對(duì)照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴分布均勻；與對(duì)照組相比，F(xiàn)A-0.05(0.05 mmol/L)組與對(duì)照組形態(tài)近似，體積稍大(膨脹)；FA-0.1(0.1 mmol/L)組線粒體大部分形態(tài)正常，偶見雙層膜崩解現(xiàn)象；FA-0.5(0.5 mmol/L)組和FA-1(1 mmol/L)組則線粒體腫脹明顯，部分線粒體殘留少量內(nèi)嵴或嵴結(jié)構(gòu)完全消失。

2.6 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞磷酸化tau蛋白及線粒體裂解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測Control、FA-0.25(0.25 mmol/L)、FA-0. 5(0.5 mmol/L)及FA-1(1 mmol/L)組不同處理組間SH-SY5Y細(xì)胞蛋白表達(dá)水平，包括Aβ(6E10)、磷酸化tau蛋白(T231)，線粒體裂解相關(guān)蛋白DRP1、MID51、MID49。結(jié)果如圖6A、6B所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)A-0.25(0.25 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)組和FA-1(1 mmol/L)組T231位點(diǎn)的磷酸化tau蛋白表達(dá)量明顯增高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.016，0.006，0.010。而甲醛處理組之間的表達(dá)量無明顯差異，P>0.05。Aβ(6E10)雖然在甲醛處理組表達(dá)量略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組相比，P值分別為0.048，0.076，0.117。DRP1、MID51、MID49為線粒體裂解相關(guān)蛋白，當(dāng)線粒體裂解增強(qiáng)時(shí)，其表達(dá)增多。如圖6C所示，與對(duì)照組相比，三種蛋白表達(dá)都有顯著增多(P<0.05)，但DRP1和MID51并未表現(xiàn)出甲醛處理組之間存在差異，而MID49除較對(duì)照組明顯表達(dá)升高外，F(xiàn)A-0.25(0.25 mmol/L)組與FA-0.5(0.5 mmol/L)組，F(xiàn)A-0.25(0.25 mmol/L)組與FA-1(1 mmol/L)組間表達(dá)量均存在顯著差異，P值分別為0.012，0.023。

注：A：T231、6E10、DRP1、MID51、MID49的免疫印跡蛋白表達(dá)條帶；B：不同處理組SH-SY5Y細(xì)胞中T231、6E10蛋白表達(dá)的灰度分析結(jié)果；C：不同處理組SH-SY5Y細(xì)胞中DRP1、MID51、MID4蛋白表達(dá)的灰度分析結(jié)果。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；不同濃度甲醛處理組間比較，#P<0.05。圖6 甲醛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞磷酸化tau蛋白及線粒體裂解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note. A, Western blot showing protein expression of T231, 6E10, DRP1, MID51 and MID49. B, Grayscale analysis results of T231 and 6E10 protein expression in SH-SY5Y cells of different formaldehyde treatment groups. C, Grayscale analysis results of DRP1, MID51, and MID4 protein expression in SH-SY5Y cells of different formaldehyde treatment groups. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01. Comparison between groups treated with different concentrations of formaldehyde, #P<0.05.Figure 6 Effect of formaldehyde on expression of phosphorylated tau proteins and mitochondrial fission-associated proteins in the SH-SY5Y cells

3 討論

甲醛在人體中，血液甲醛濃度的范圍是20～100 μmol/L[4]。而本實(shí)驗(yàn)圍繞正常血液濃度設(shè)置甲醛處理組的濃度梯度，對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞模型進(jìn)行處理。發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L甲醛作用4 h即可降低細(xì)胞生存活性和增殖能力，且甲醛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用與作用時(shí)間和劑量呈正相關(guān)。相比于對(duì)照組，甲醛濃度越高，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的遷移能力的抑制作用越明顯。而作用時(shí)間越長，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的生長存活能力、增殖能力抑制性越顯著。細(xì)胞的遷移能力是正常細(xì)胞的基本功能之一，是機(jī)體正常生長發(fā)育的重要生理過程，遷移也是活細(xì)胞普遍具備的一種運(yùn)動(dòng)形式[10]。機(jī)體在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及血管生成、傷口愈合等過程中都會(huì)涉及細(xì)胞遷移。而甲醛對(duì)細(xì)胞的遷移能力的抑制，無疑是對(duì)其正常生理功能的干擾和損傷。而本研究中細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測的結(jié)果表明，甲醛作用濃度越大，對(duì)細(xì)胞的存活能力損傷越顯著，其結(jié)果就是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死[11]。這可能是由于甲醛導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA的交聯(lián)作用，引起DNA大量損傷，而超出了細(xì)胞自身修復(fù)的能力，最后導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡和減少。

在神經(jīng)病理學(xué)方面，認(rèn)知障礙腦病理的重要表型是神經(jīng)元的變性和凋亡[12-13]。在本研究中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了不同處理組間SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)甲醛可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，且與甲醛作用劑量呈正相關(guān)。而線粒體是作為一種細(xì)胞器，在真核細(xì)胞中具有重要的生理功能，是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生的主要場所[14]。在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中，由于DNA損傷等因素，會(huì)激活Bcl-2家族促凋亡因子，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體通透性增加，線粒體釋放凋亡相關(guān)因子，導(dǎo)致蛋白水解酶Caspase-3的激活，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。研究顯示線粒體內(nèi)膜通透性的轉(zhuǎn)變可以導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[15]。這與我們?cè)谕干潆婄R下觀察到的線粒體形態(tài)改變結(jié)果相一致。線粒體在較高濃度甲醛作用下，結(jié)構(gòu)受到破壞且數(shù)量顯著減少，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)腫脹和內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)消失，是甲醛作用使線粒體膜的通透性改變，從而加劇了細(xì)胞的凋亡。

另外，線粒體能夠發(fā)生高度的動(dòng)態(tài)變化，能在細(xì)胞中發(fā)生移位，同時(shí)也通過自身的不斷分裂和融合活動(dòng)而發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。它的分裂與融合動(dòng)態(tài)平衡對(duì)機(jī)體健康非常重要[16-17]。DRP1(dynamin-related protein 1)蛋白，即線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白，它的主要功能是調(diào)控線粒體分裂，它對(duì)線粒體分裂活動(dòng)以及維持線粒體在軸突、樹突和神經(jīng)突觸的分布都是必不可少的。MID49(mitochondrial dynamics protein 49)和MID51(mitochondrial dynamics protein 51)是線粒體動(dòng)態(tài)蛋白，在線粒體分裂過程中也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)線粒體處于分裂期時(shí)，MID49、MID51及其他線粒體分裂因子(如Mff)會(huì)招募胞漿中的DRP1，并與之結(jié)合起來調(diào)控線粒體分裂過程。正常表達(dá)的DRP1能維持線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，維持細(xì)胞正常功能。而異常表達(dá)的DRP1會(huì)引起線粒體動(dòng)態(tài)異常，影響線粒體形態(tài)進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。有研究顯示[18]，在基因修飾大鼠模型中，過氧化物酶體呈細(xì)管狀，認(rèn)為原因之一是DRP1的表達(dá)上調(diào)，原因之二是DRP1與Pex11β結(jié)合，從而影響了過氧化物酶的功能。我們的研究發(fā)現(xiàn)，甲醛作用組DRP1和MID49/51均表達(dá)上調(diào)，證明線粒體分裂增加，而影響了正常的線粒體功能和分布，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能受損。這與我們的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果一致，甲醛作用組線粒體形態(tài)異常，數(shù)量顯著減少，提示線粒體形態(tài)和分布異常，失去正常功能，最終影響神經(jīng)細(xì)胞的功能和活性。

微管系統(tǒng)是神經(jīng)細(xì)胞的骨架成分，tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，它在正常腦中與微管結(jié)合，維持微管的穩(wěn)定性[19-20]。在本研究的免疫印跡檢測中，發(fā)現(xiàn)較高劑量甲醛組比對(duì)照組的磷酸化tau蛋白含量有顯著增多，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。有研究將純化的tau蛋白與5%濃度的甲醛溫育24 h后，發(fā)現(xiàn)tau蛋白明顯集聚,形成配對(duì)螺旋樣二聚體，tau蛋白錯(cuò)誤折疊成類球形，類似阿爾茨海默病患者腦內(nèi)的異常超微結(jié)構(gòu)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，且其聚集產(chǎn)物有明顯的細(xì)胞毒性，可以導(dǎo)致細(xì)胞的代謝障礙和死亡。因此提出“內(nèi)源性甲醛慢性損傷”假說[21]。Aβ陽性斑塊形成增多是神經(jīng)細(xì)胞受損時(shí)神經(jīng)病理的另一個(gè)重要特征，但在本研究中，甲醛作用組與對(duì)照組相比，Aβ(6E10)蛋白表達(dá)量雖有所升高，但未存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這需要我們進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行研究。

綜上所述，甲醛通過抑制細(xì)胞遷移、降低生存活性、促進(jìn)凋亡、破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能并使其分裂增強(qiáng)等途徑損傷神經(jīng)細(xì)胞，同時(shí)上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白的磷酸化水平。