不同年齡雌性恒河猴腎多模式分子功能影像的觀察

王梓延，何 蕊，謝 飛，林慶鏗，王 嬌，胡建偉，潘興華，朱高紅*，呂龍寶

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，昆明 650032； 2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032； 3.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650223)

恒河猴(rhesus monkey)組織器官結(jié)構(gòu)、生理功能及代謝功能與人相似。人工養(yǎng)殖的恒河猴作為一種高級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。腎是調(diào)節(jié)體內(nèi)水鹽平衡的重要器官。目前常用恒河猴進(jìn)行糖尿病腎病、急慢性腎損傷等腎臟疾病的模型制作，進(jìn)行臨床治療藥物機(jī)制的探索和療效驗(yàn)證[2-3]。對(duì)恒河猴進(jìn)行腎移植等修復(fù)重建相關(guān)研究也較多[4]。既往對(duì)于實(shí)驗(yàn)恒河猴的影像學(xué)研究多以CT為主，而其他影像學(xué)方法研究及相關(guān)報(bào)道資料較少[5-6]。本研究測量雌性恒河猴腎功能形態(tài)顯像的相關(guān)指標(biāo)，即腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)、表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)、標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standard uptake value，SUV)、CT值等，并進(jìn)行不同年齡組的比較，探究年齡對(duì)雌性恒河猴腎的多種影像學(xué)定量指標(biāo)的影響，為恒河猴腎影像學(xué)定量分析研究以及科學(xué)實(shí)驗(yàn)方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人工繁殖普通級(jí)恒河猴由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供[SCXK (滇) K2017-0003]，共17只，雌性，年齡范圍為2～26歲，體質(zhì)量范圍為2.2～9.1 kg。按年齡分為幼年組(2～3歲)、成年組(6～7歲)、老年組(22～26歲)[7]。恒河猴飼養(yǎng)于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所[SYXK (滇) K2017-0008]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)認(rèn)可證書(注冊(cè)號(hào)：CNAS LA0001)。本研究獲得中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批件號(hào)：倫審2019-003(科)-01)。恒河猴的飼養(yǎng)及使用過程嚴(yán)格遵守《美國公共衛(wèi)生署人道管理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物政策》[8]，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中按3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑公司，進(jìn)口分裝，批號(hào)：F20140915)；高锝酸鈉溶液(成都原子高科股份有限公司)；注射用亞錫噴替酸(北京欣科思達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)；PET/CT掃描顯像藥物18F-FDG(生產(chǎn)設(shè)備為美國GE公司的MINItrace麒麟回旋加速器，束流能量10 MeV；靶材料為日本產(chǎn)大陽牌H218O(豐度> 98%)；合成器為GE公司的TracerLab FDG、FN型號(hào)；合成試劑為德國ABX公司)；BUN、Cre、UA檢測試劑(均由北京利德曼公司提供)。SPECT/CT設(shè)備(德國Siemens公司Symbia T16雙探頭SPECT/CT儀，由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供)；磁共振設(shè)備(聯(lián)影3.0T uMR780磁共振掃描儀，由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所提供)；PET/CT設(shè)備(美國GE DiscoveryTMPET/CT Elite，由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供)；AW4.6后處理工作站(美國GE)；全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼AU5821)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 顯像方法

所有顯像檢查前，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉1 mL/kg(按體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉。

SPECT腎動(dòng)態(tài)顯像：顯像前充分水化，麻醉恒河猴后常規(guī)取仰臥位，探頭靠近置于檢查床下，雙腎及膀胱均置于有效視野內(nèi)。由肘靜脈“彈丸”式注射99 mTc-二乙三胺五乙酸(99mTc-DTPA)后，動(dòng)態(tài)采集：血流相2 s/幀，共60 s；功能相60 s/幀，共1200 s。能峰140 keV，窗寬20%，矩陣64×64，放大倍數(shù)1.5。

磁共振掃描：體部相控陣線圈，對(duì)恒河猴行SE-EPI序列DWI檢查。DWI檢查采用單次激發(fā)平面回波序列(SE-EPI)。雙側(cè)腎軸位DWI成像：TR 3000 ms，TE 57.1 ms，層厚8 mm，層間距1 mm，采集次數(shù)(NEX)2，矩陣128×128，b值為800 s/mm2。掃描范圍覆蓋雙腎及腎上腺。

18F-FDG PET/CT掃描：恒河猴禁食至少6 h，麻醉后測量血糖< 8 mmol/L，靜脈注射18F-FDG注射劑量0.3 mCi/kg(按體質(zhì)量)，安靜休息60～90 min后，使用PET/CT進(jìn)行掃描。CT采用常規(guī)全身螺旋掃描，管電壓120 kV，管電流260 mA，螺距0.561，轉(zhuǎn)速0.5 s/周，層厚3.75 mm，間隔3.75 mm，矩陣512 × 512，F(xiàn)OV 50 cm × 50 cm；隨后行PET掃描，每個(gè)床位采集2.5 min。

1.3.2 圖像處理

腎動(dòng)態(tài)顯像圖像處理：在后處理軟件輸入恒河猴的體長、體重信息以及腎臟深度(通過CT圖像測量獲得)，勾畫雙側(cè)腎臟及本底的感興趣區(qū)(region of interest，ROI)并采用Gate’s法測定腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)。測量并記錄左右腎小球?yàn)V過率(GFRL、GFRR)和總腎小球?yàn)V過率(GFRtotal)。

PET/CT圖像處理：把圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入AW4.6后處理工作站對(duì)腎的PET及CT圖像進(jìn)行ROI的勾畫，勾畫ROI時(shí)避開腎柱及腎血管。測量并記錄SUVmax、SUVmean、CT值。臟器標(biāo)準(zhǔn)化攝取值計(jì)算公式：SUV=局部感興趣區(qū)放射性活度(MBq/mL)/注射放射性活度(MBq)/體質(zhì)量(g)。

磁共振圖像處理：在工作站上進(jìn)行DWI后處理及測量腎實(shí)質(zhì)的表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)。處理時(shí)避開腎柱及腎血管，設(shè)置橢圓形ROI，測得相應(yīng)數(shù)據(jù)并記錄。

1.3.3 血液學(xué)檢測

所有研究對(duì)象均取清晨空腹靜脈血5 mL，標(biāo)本送往中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血液中的尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、血尿酸(UA)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腎動(dòng)態(tài)顯像圖像處理結(jié)果

采用后處理軟件進(jìn)行腎動(dòng)態(tài)顯像圖像處理。恒河猴腹盆部99mTc-DTPA腎動(dòng)態(tài)顯像結(jié)果如圖1所示。靜脈注射后，腹主動(dòng)脈上段顯影后2～4 s，雙側(cè)腎隱約可見，隨之出現(xiàn)明顯腎影，此為腎內(nèi)小動(dòng)脈和毛細(xì)血管床的灌注影像。2～3 min后腎影最濃，影像完整，腎內(nèi)放射性分布均勻，為腎實(shí)質(zhì)影。此后腎影周邊的放射性逐漸降低，而腎盂腎盞部位放射性逐漸增高，輸尿管隱約可見，膀胱影逐漸明顯，在20～30 min，腎影甚至基本消退，大部分影像集中在膀胱里。

注：A：恒河猴99mTc-DTPA腎動(dòng)態(tài)顯像血流灌注相；B：恒河猴99mTc-DTPA腎動(dòng)態(tài)顯像功能動(dòng)態(tài)相。Fr：幀；紅粗箭頭：左腎；紅細(xì)箭頭：右腎；紅彎箭頭：膀胱。圖1 恒河猴腹盆部99mTc-DTPA腎動(dòng)態(tài)顯像Note. A, The flow phase of 99mTc-DTPA nuclide renal dynamic imaging in rhesus monkeys. B, The functional dynamic phase of 99mTc-DTPA nuclide renal dynamic imaging in rhesus monkeys. Fr means frame. Thick red arrow indicates the left kidney. Thin red arrow indicates the right kidney. Curved red arrow indicates the bladder.Figure 1 99mTc-DTPA nuclide renal dynamic imaging of the abdomen and pelvis of rhesus monkeys

2.2 恒河猴PET/CT圖像處理及磁共振圖像處理結(jié)果

恒河猴PET/CT全身最大密度投影(maximum intensity projection，MIP)圖像如圖2A所示，恒河猴腎SUVmax、SUVmean、CT值測量如圖2B、2C所示；磁共振圖像處理及恒河猴腎ADC值測量如圖2D所示。

注：A：恒河猴PET/CT全身最大密度投影圖像(灰色區(qū)域)；B：測量恒河猴腎SUVmax、SUVmean；C：測量恒河猴腎CT值；D：測量恒河猴腎ADC值。B、C中的白色圓圈及D中紅線區(qū)域?yàn)镽OI。圖2 將恒河猴圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入后處理工作站，勾畫腎PET、CT、MR圖像的ROINote. A, Maximum intensity projection of PET/CT of rhesus monkeys (grey regions). B, Renal SUVmax and SUVmean were measured in rhesus monkeys. C, Renal CT values were measured in rhesus monkeys. D, Renal ADC values were measured in rhesus monkeys. The white circles in B and C and the red area in D show ROI.Figure 2 Rhesus monkey imaging data was imported into the post-processing workstation to sketch the ROI for PET, CT, and MR images of the kidney

2.3 影像學(xué)形態(tài)功能指標(biāo)

如表1所示，雌性恒河猴老年組的左右腎小球?yàn)V過率(GFRL、GFRR)和總腎小球?yàn)V過率(GFRtotal)均顯著低于成年組(t=-2.713，-3.562，-3.397，P<0.05)和幼年組(t=-3.948，-4.990，-6.192，P<0.05)，而成年組和幼年組GFRL、GFRR和GFRtotal三指標(biāo)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.934，-1.660，-1.685，P>0.05)。

老年組的腎ADC值顯著低于成年組和幼年組(F=53.050，P<0.05)。而成年組和幼年組腎ADC值無顯著性差異(t=-1.038，P>0.05)。

不同年齡組雌性恒河猴間，腎的CT值、SUVmax、SUVmean指標(biāo)均無顯著性差異(F=0.436，1.356，1.258，P>0.05)。

同一年齡組的雌性恒河猴中，左右兩腎間的GFR、ADC值、CT值、SUVmax、SUVmean指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 腎功能血清學(xué)指標(biāo)

如表1所示，雌性恒河猴中幼年組、成年組、老年組三組的血尿素氮(BUN)分別為、(6.10±1.28) mmol/L、(5.72±1.48) mmol/L、(5.37±1.58) mmol/L；三組血肌酐(Cre)分別為(43.00±4.24) μmol/L、(44.2±11.05) μmol/L、(52.14±9.70) μmol/L；三組尿酸(UA)分別為(2.80±3.49) μmol/L、(1.80±1.79) μmol/L、(1.29±0.49) μmol/L，三個(gè)指標(biāo)在幼年組、成年組、老年組三組間均無顯著性差異(F=0.179，1.2，0.762，P>0.05)。

2.5 相關(guān)性分析

如圖3所示，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，BUN、Cre均分別與GFRtotal呈現(xiàn)中度相關(guān)性(r=0.56，-0.56，P<0.05)。UA與GFRtotal無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

恒河猴是人類的近屬動(dòng)物，許多生物學(xué)特性和人類較為接近。在腎解剖學(xué)上，恒河猴與人類不同在于左腎較右腎低約半個(gè)腰椎體，而人類的右腎較左腎低[9]。隨著年齡增長，恒河猴腎衰老性變化逐漸明顯。老年猴的腎常常表現(xiàn)為腎皮質(zhì)變薄，部分腎小球纖維化、玻璃樣變甚至消失；腎間質(zhì)結(jié)締組織增加，腎小球數(shù)量減少，腎小管呈現(xiàn)萎縮表現(xiàn)，近曲小管上皮細(xì)胞減少而遠(yuǎn)曲小管局限性擴(kuò)張[7]。

CT具有較高的密度分辨率，其利用不同密度組織結(jié)構(gòu)對(duì)X射線吸收衰減系數(shù)的不同，通過計(jì)算機(jī)處理，獲得各組織器官結(jié)構(gòu)影像。18F-FDG是一種葡萄糖的類似物，標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)是反映18F-FDG在細(xì)胞中聚集的半定量指標(biāo)，反映著細(xì)胞組織的葡萄糖代謝情況[10]。本研究采用PET/CT對(duì)恒河猴腎進(jìn)行顯像，觀察解剖結(jié)構(gòu)并測量腎的CT值、SUVmax、SUVmean。結(jié)果顯示不同年齡組的雌性恒河猴腎解剖以及其與周圍組織器官的位置關(guān)系與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致。Meier等人[11]使用PET/CT掃描并評(píng)估人腹部器官結(jié)構(gòu)和功能與年齡的相關(guān)變化，結(jié)果表明人左右腎CT值與年齡均無顯著相關(guān)性。本研究顯示雌性恒河猴各年齡組內(nèi)左右腎間、不同年齡組間，腎CT值均無顯著性差異，結(jié)果與人類似。同時(shí)Meier等人[11]認(rèn)為，腎是顯像劑18F-FDG經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)代謝后主要的排泄器官，限制了使用SUV指標(biāo)定量評(píng)估腎代謝功能的能力。而本研究雌性恒河猴腎SUVmax、SUVmean數(shù)值與年齡無顯著相關(guān)，亦證實(shí)了此觀點(diǎn)。

表1 不同年齡組雌性恒河猴腎血清學(xué)、影像學(xué)觀察指標(biāo)

注：與老年組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the old group,*P<0.05.

圖3 GFR與BUN、Cre、UA的相關(guān)分析Figure 3 Correlation analysis of GFR with BUN, Cre, and UA

磁共振彌散加權(quán)成像(diffusion-weighted imaging，DWI)是反映活體組織內(nèi)水分子布朗運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的磁共振功能成像技術(shù)之一。不僅可以通過圖像觀察體內(nèi)組織、器官的功能狀態(tài)，還能通過測量表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)對(duì)組織功能狀態(tài)進(jìn)行定量分析。腎是水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所，為了有效觀察腎臟水分子的布朗運(yùn)動(dòng)，本研究采用b值為800進(jìn)行研究，此時(shí)ADC值主要反映水分子的彌散運(yùn)動(dòng)[12]。在正常人中，當(dāng)高b值時(shí)，腎實(shí)質(zhì)ADC值隨著年齡增長而下降。本研究雌性恒河猴腎實(shí)質(zhì)ADC隨年齡的變化趨勢與人的變化類似，原因可能是因?yàn)槟I間質(zhì)組織纖維化的程度隨年齡增長而逐漸加重，水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)因此減慢[13]。

99mTc-DTPA是一種幾乎全部被腎小球?yàn)V過而不被腎小管吸收和分泌的放射性物質(zhì)，測定其清除率能準(zhǔn)確反映腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)。99mTc-DTPA SPECT/CT腎動(dòng)態(tài)顯像法測定GFR廣泛用于臨床，可同時(shí)獲得雙腎及分腎功能。Gate’s法是腎動(dòng)態(tài)顯像測定GFR時(shí)所用的核心方法，如果未對(duì)腎深度進(jìn)行校正，就會(huì)對(duì)腎功能的定量造成誤差。本研究通過CT圖像實(shí)測腎深度獲得校正值，所測恒河猴GFR數(shù)據(jù)更貼近實(shí)際[14-15]。Goyal[16]研究發(fā)現(xiàn)在正常成人中，腎小管和腎小球細(xì)胞的數(shù)量隨著年齡增加而減少。Melk等人[17]認(rèn)為隨著年齡的增加，腎纖維化激活增加以及細(xì)胞凋亡加速也可能導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。Jiang等人[18]研究表明腎中與脂質(zhì)合成和腎膽固醇蓄積相關(guān)的某些蛋白的表達(dá)隨著年齡的增長而增加，脂質(zhì)在衰老腎內(nèi)的蓄積可能導(dǎo)致腎功能的下降。Fardoun等人[19]在衰老的大鼠中，發(fā)現(xiàn)腎單位近端小管的多巴胺受體與G蛋白解偶聯(lián)，這種解偶聯(lián)現(xiàn)象和由此產(chǎn)生的功能障礙可能源于隨著年齡增長而積累的氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物。本研究雌性恒河猴按年齡分組，老年組GFR顯著低于成年組、幼年組，結(jié)論與以上研究觀點(diǎn)相符。

有學(xué)者指出BUN、Cre等腎血清學(xué)指標(biāo)并不是反映GFR的敏感指標(biāo)，特別是在老年人群中[20]。本研究相關(guān)性分析中雌性恒河猴腎GFR與BUN、Cre相關(guān)性不高(均呈中等相關(guān))，而與UA則無顯著相關(guān)，也支持此觀點(diǎn)。這可能是由于BUN、Cre、UA易受飲食、蛋白合成、分解代謝及血液容量等多種因素的影響，因而不能準(zhǔn)確及時(shí)地反映腎小球?yàn)V過率的變化[21]。此結(jié)論進(jìn)一步反映了SPECT/CT腎動(dòng)態(tài)顯像在評(píng)價(jià)腎功能方面優(yōu)于其它影像學(xué)及血清學(xué)檢測。

郭菲等人[22]對(duì)804個(gè)健康人體的生化參數(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明對(duì)于40歲以后的人類女性來說，BUN、Cre、UA水平均隨著年齡逐漸下降。而本研究雌性恒河猴血清BUN、Cre、UA在三個(gè)年齡組間均無顯著性差異，可能是由于本實(shí)驗(yàn)恒河猴樣本數(shù)目較少，未體現(xiàn)恒河猴各年齡組腎功能血清學(xué)指標(biāo)的差別。針對(duì)年齡對(duì)生化指標(biāo)的影響，將在下一階段實(shí)驗(yàn)中加大恒河猴樣本數(shù)目加以驗(yàn)證。

本研究應(yīng)用多種影像學(xué)設(shè)備對(duì)不同年齡組雌性恒河猴腎顯像并測量相應(yīng)影像學(xué)指標(biāo)，觀察年齡對(duì)雌性恒河猴腎分子功能影像指標(biāo)的影響。結(jié)果充分顯示了分子功能影像對(duì)恒河猴腎進(jìn)行觀察研究的優(yōu)勢。該研究通過SPECT/CT分子功能影像為恒河猴左右分腎功能定量分析提供參考依據(jù)，作為分腎功能“金標(biāo)準(zhǔn)”評(píng)價(jià)為恒河猴腎相關(guān)科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)資料。