血漿miR-92a和miR-126水平變化在冠心病中的應(yīng)用價(jià)值

劉玉薇，馮曉敏，萬(wàn) 楠

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，遼寧 沈陽(yáng)110016)

近年來(lái)，心血管疾病的發(fā)生率不斷上升，已成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病，盡管現(xiàn)在可以進(jìn)行有效的再灌注以及藥物治療，但每年全球仍有1700萬(wàn)人死于心血管疾病[1]。MicroRNA(miRNA)在真核生物中固有的長(zhǎng)度為21-25個(gè)核苷酸，是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，特異性識(shí)別靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[2]。miRNAs調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育并且參與許多病理生理過(guò)程，包括心血管疾病。有研究表明，在不同心血管疾病中，患者血漿miRNA含量不同，包括冠心病、心力衰竭、心肌炎、糖尿病等。重要的是，由于特定的miRNAs在心臟的各種細(xì)胞類(lèi)型中差異性地富集，因此提示特定的miRNA的水平改變可能反映不同的心血管病理狀態(tài)[3]。miRNA以無(wú)細(xì)胞形式存在于人體循環(huán)中，可以在外周血中檢測(cè)到，并且在血漿和其他體液中發(fā)現(xiàn)了保護(hù)miRNA免受內(nèi)源性RNA酶活性降解的穩(wěn)定分子，這表明循環(huán)miRNA可能是心血管疾病中理想的生物標(biāo)志物[4,5]。miR-126和miR-92a廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，被認(rèn)為是生理血管生成的主要調(diào)節(jié)劑。而內(nèi)皮功能障礙促進(jìn)了冠脈粥樣硬化的發(fā)生。因此，我們?cè)诒疚闹醒芯苛搜獫{miR-126和miR-92a水平與冠心病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年10月至2017年12月就診于沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院的胸痛患者93例，其中非冠心病(non-CAD)組20例，心絞痛(AP)組24例，急性心肌梗死(AMI)組49例，所有入組患者均行冠脈造影檢查。冠心病診斷參照世界衛(wèi)生組織1979年《缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)》和中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)2007年《不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有急慢性感染性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全、血液病、周?chē)苄约膊?、自身免疫疾病、腦卒中、其他心臟疾病的患者及既往心肌梗死、冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)術(shù)后或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)術(shù)后的患者。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 在患者入院后、未進(jìn)行任何干預(yù)措施前，采集肘靜脈血，將EDTA-K2真空采血管中全血，4 000 r/min離心15分鐘，分離血漿于無(wú)RNA酶的EP試管中，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2全球急性冠狀動(dòng)脈注冊(cè)事件危險(xiǎn)評(píng)分(GRACE評(píng)分) 計(jì)算年齡、心率、動(dòng)脈收縮壓、肌酐、ST段變化、Killip分級(jí)、心肌標(biāo)志物是否升高及入院時(shí)是否心臟驟停等8項(xiàng)指標(biāo)積分之和。

1.2.3冠脈Gensini評(píng)分 對(duì)每支冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度進(jìn)行定量評(píng)定，以每一冠狀動(dòng)脈的狹窄基本評(píng)分乘以該病變部位的系數(shù)，即為該病變血管的評(píng)分，各病變血管得分總和即為該患者冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度的總評(píng)分。

1.2.4試劑與儀器 EasyPure miRNA Kit(#ER601,TransGen Biotech)試劑盒，TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(#AT311,TransGen Biotech)試劑盒，Light Cycler 480 SYBR Green IMaster(#04707516001,Roche)。羅氏480PCR擴(kuò)增儀。

1.2.5miRNA檢測(cè) 血漿miRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄等操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所有操作步驟均在冰上完成，避免RNA的降解。以U6作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體積為20 μl,包括5 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 μl Master Mix，正向引物1 μl，反向引物1 μl，3 μl無(wú)核酸酶水，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)，每份樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，使用2-△Ct法分析miR-126和miR-92a的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本資料

總共研究了93名患者，non-CAD組20人，AP組24人，AMI組49人。值得注意的是，非冠心病組并不是健康對(duì)照組，因無(wú)法對(duì)健康人群進(jìn)行冠脈造影及采血，非冠心病組是通過(guò)臨床表現(xiàn)懷疑為冠心病，但通過(guò)冠脈造影而排除的人群。AMI組較其他兩組吸煙患者的百分率顯著增加，高敏肌鈣蛋白T(hs-cTnT)和GRACE評(píng)分明顯升高，左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低。Gensini積分AMI組明顯高于AP組，AP組顯著高于non-CAD組(表1)。

2.2 血漿中miRNA的相對(duì)表達(dá)量

如表1所示，在非冠心病、心絞痛和心肌梗死三組中患者血漿中miR-92a和miR-126水平呈遞降趨勢(shì)，miR-92a水平AP組較non-CAD組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)；AMI組較AP組有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.079)。而miR-126水平，AP組與non-CAD組相比略降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.212)；AMI組較AP組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。

2.3 miRNA與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性

進(jìn)一步分析miR-92a和miR-126與其他臨床特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MiR-92a和miR-126表達(dá)與hs-cTnT、Gensini評(píng)分、GRACE評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，而與EF呈正相關(guān)(表2)。

注：a與其他兩組相比，P<0.05。

表2 r值表

2.4 miRNA在冠心病中的診斷價(jià)值

繪制miR-92a，miR-126與miR-92a+miR-126對(duì)冠心病或心梗診斷的受試者工作曲線，計(jì)算曲線下面積，并以約登指數(shù)最大值處為最佳診斷界值，CHD的診斷界值為miR-92a≤18.17，miR-126≤15.71，AMI的診斷界值為miR-92a≤18.17，miR-126≤16.41，聯(lián)合診斷時(shí)，任一指標(biāo)低于診斷界值即診斷為陽(yáng)性，各指標(biāo)診斷的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度見(jiàn)表3。

表3 miR-92a和miR-126的診斷價(jià)值

3 討論

本文結(jié)果顯示，在非冠心病、心絞痛和心肌梗死三組中患者血漿中miR-92a和miR-126水平呈遞降趨勢(shì)，即miR-92a和miR-126水平隨冠心病的嚴(yán)重程度的增加而降低，血漿miR-92a水平在AP和AMI患者中明顯下降，而miR-126則在心?；颊咧酗@著降低。表2表明血漿miR-92a和miR-126水平與hs-cTnT顯著相關(guān)，提示其表達(dá)水平在冠心病患者中的降低可能與心肌損傷程度有關(guān)。在排除血壓及其他心臟疾病的影響后，血漿miR-92a和miR-126水平與左室射血分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，也提示miR-92a和miR-126與心臟功能的相關(guān)性可能是由于心肌損傷造成。

Rosa等人發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞富含的miR-126的循環(huán)濃度的跨冠脈降低與心肌損傷的程度直接相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞富含的miR-126表現(xiàn)出逆冠狀動(dòng)脈內(nèi)濃度梯度，表明肌鈣蛋白陽(yáng)性冠心病患者miR-126在通過(guò)冠脈循環(huán)期間被攝入或降解，并且觀察到內(nèi)皮細(xì)胞富集的miR-92a存在類(lèi)似的模式[4]。影響血漿miRNA的水平可能包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、組織表達(dá)量、蛋白加工和釋放等多方面因素，并且不同的miRNA有各自特異的釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[6]。很多miRNA存在于不同的細(xì)胞外囊泡中，這些miRNA由囊泡保護(hù)而不被RNA酶降解[7,8]。另有一些miRNA可與蛋白質(zhì)結(jié)合，如miR-92a與Argonaute-2蛋白結(jié)合后釋放或與脂質(zhì)蛋白結(jié)合后轉(zhuǎn)運(yùn)[9]，這些復(fù)合物可以使miRNA在一定程度上保持不被RNA酶降解。不同的保護(hù)機(jī)制導(dǎo)致不同的降解率：如與蛋白質(zhì)結(jié)合的miRNA對(duì)可以被心梗后釋放的蛋白酶水解，而囊泡內(nèi)的miRNA對(duì)蛋白酶不敏感。因此，當(dāng)心肌損傷時(shí)蛋白酶[10,11]或RNA水解酶[12,13]分泌增加，則可導(dǎo)致血漿miRNA水平降低。

表2表明患者血漿miRNA表達(dá)水平與冠脈病變程度呈明顯負(fù)相關(guān)，Gensini積分越高，miR-92a和miR-126表達(dá)水平越低。目前研究認(rèn)為miR-92a是內(nèi)皮細(xì)胞源性血管形成抑制物[14]，在心肌缺血或肢端缺血的小鼠動(dòng)物模型中其抑制血管形成作用更明顯，miR-92a過(guò)表達(dá)可以減少抗粥樣硬化血流調(diào)控性轉(zhuǎn)錄因子KLF2/4的表達(dá)，從而參與內(nèi)皮損傷過(guò)程，當(dāng)存在動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，心肌組織中富集miR-92a，相反，因上述轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的不同導(dǎo)致釋放入血的miR-92a減少[6]。Andreas等人的研究結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞中miR-126通過(guò)抑制印記基因Dlk1維持內(nèi)皮細(xì)胞的增殖儲(chǔ)備，從而防止動(dòng)脈粥樣硬化病變形成[15]。也有研究表明在動(dòng)脈粥樣硬化層流剪切力的作用下，內(nèi)皮釋放的miRNA-126減少[16]。

GRACE風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)冠心病患者院內(nèi)臨床結(jié)局和遠(yuǎn)期臨床結(jié)局[17]。對(duì)于低、中、高危患者，院內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)分別為<1%,1%-3%,>3%。出院后6個(gè)月死亡風(fēng)險(xiǎn)分別為<3%,3%-8%,>8%。本文研究顯示血漿miR-92a和miR-126水平與GRACE風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示血漿miR-92a和miR-126水平可能與預(yù)后相關(guān)。Karakas等人研究結(jié)果也表明miRNA水平與心肌梗死后患者的心血管預(yù)后相關(guān)，在首次前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，miR-126水平與隨后發(fā)生的心梗呈負(fù)相關(guān)，并且miR-126的表達(dá)預(yù)測(cè)了一組具有癥狀的冠狀動(dòng)脈疾病患者的死亡率[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)急性心梗進(jìn)行診斷時(shí)，最佳診斷界值為miR-92a≤18.17，miR-126≤16.41，但與現(xiàn)有指標(biāo)如hs-cTnT相比，診斷效力并不理想，二者聯(lián)合診斷靈敏度為89.80%，特異度為59.09%，準(zhǔn)確度為75.27%。雖然不穩(wěn)定性心絞痛患者miR-92a的相對(duì)表達(dá)水平高于急性心?；颊?，但是本研究得出的對(duì)冠心病的最佳診斷界值仍為miR-92a≤18.17，這可能是由于各組人數(shù)不均且非冠心病患者較少的原因。miR-92a與miR-126聯(lián)合對(duì)冠心病診斷效力最佳，靈敏度為78.08%，特異度為80.00%，準(zhǔn)確度為78.49%，由于miRNA檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)、便捷、微創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，或許可以作為冠心病早期發(fā)現(xiàn)的參考指標(biāo)。此外，本研究中非冠心病組并非健康體檢者，可能對(duì)結(jié)果造成影響，因此，今后需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。