利用DMF溶解順鉑制備的DDP/PLA膜對口腔癌CAL-27細胞增殖抑制作用研究

賈顏鴻,周 童,王欣琦,栗 達,郝秀峰,張澤兵*

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院,吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)化學(xué)院)

靜電紡絲技術(shù)所制備的納米纖維膜具有優(yōu)良的載藥性能，廣泛應(yīng)用于抗生素、抗腫瘤藥物和生物大分子等控制釋放中[1]。本課題組在前期工作中，以H2O/CHCl3作為溶劑制備載順鉑(DDP)聚乳酸(PLA)靜電紡絲膜(DDP/PLA膜)，并作用于口腔鱗狀細胞癌細胞CAL-27細胞取得了很好的抑制效果[2]。但因順鉑在H2O中的溶解度小，導(dǎo)致DDP/PLA膜載藥量受到限制，影響對口腔癌細胞的抑制作用。本研究對該載藥體系加以改進，改用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作為順鉑的溶劑，探討改進后的DDP/PLA膜的載藥效果及其對口腔癌CAL-27細胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

口腔鱗狀細胞癌CAL-27細胞株由上海交通大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院陳萬濤教授惠贈。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液(以色列BI公司)、聚乳酸(PLA)(Mw≈150000)由吉林大學(xué)化學(xué)院提供，順鉑(DDP)(中國食品藥品檢定研究所)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(天津天泰精細化學(xué)品有限公司)，噻唑藍(MTT)(美國中杉金橋公司)，牛血清白蛋白(BSA)(美國Sigma公司)，注射泵(型號：SPLab02，保定申辰泵業(yè)有限公司)，靜電發(fā)生器(型號：DW-P303-1ACFO，東文高壓電源(天津)有限公司)，掃描電鏡(型號：SU8020，HITACHI)，紫外分光光度計(日本島津公司)，酶標儀(型號：SynergyHT，美國Biotek公司)。

1.2 靜電紡絲納米纖維的制備

1.2.1紡絲液配制 將PLA溶解在氯仿中，分別配制成5%wt、6%wt、7%wt、8%wt、9%wt的溶液。超聲30分鐘后室溫攪拌直至聚乳酸全部溶解。加入體積分數(shù)為35%的無水乙醇，室溫攪拌至溶液澄清均勻。

稱取DDP使其與PLA質(zhì)量比分別為1×10-3:1、2×10-3:1、3×10-3:1，并將其溶于1 ml DMF中配制成DDP溶液，將DDP溶液加入8%wtPLA溶液中，室溫攪拌至溶液澄清均勻。

將200 mg BSA溶于1 ml去離子水中，超聲至完全溶解，將BSA溶液加入11 ml 8%wtPLA溶液中，同時加入57 mg SDS，室溫下磁力攪拌至溶液呈均一乳白色。

1.2.2靜電紡絲 分別取上述紡絲液各5 ml于注射器中，針頭連接靜電發(fā)生器的電極，將鋁箔固定在接受屏表面用以收集納米纖維，接收屏與接地線相連，兩端電壓差設(shè)定為17 kV。設(shè)置注射泵推進速度為10 μl/min，紡絲距離 11 cm。烘箱干燥后密封保存。

1.3 掃描電鏡測試/微觀結(jié)構(gòu)觀測/形貌觀察

將制備好的靜電紡絲納米纖維膜充分干燥后表面噴金處理，進行掃描電鏡觀察。采用Photoshopcc2019統(tǒng)計8種靜電紡絲納米纖維圖片中的直徑，根據(jù)標尺計算出纖維直徑，每種納米纖維選取至少50根進行統(tǒng)計。

1.4 體外釋放性能測試

通過電子天平稱取BSA/PLA膜66 mg，其中含有BSA 6 mg。將樣品放入磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)浸泡，37℃條件下進行動態(tài)透析，每隔24 h取5 ml釋放液，每取完一次后即時補充同等體積空白PBS液。收集18 d緩沖液，采用紫外分光光度計測試BSA在PBS緩沖液中的溶解濃度。測試波長范圍為250 nm-300 nm，經(jīng)檢測BSA的特征吸收峰為280 nm，因此選擇樣品于波長280 nm處的吸光度數(shù)值，根據(jù)標準曲線方程，將相應(yīng)吸光度換算成溶出的BSA的量，并繪制成體外釋放曲線。

1.5 生物相容性測試

實驗分為兩組，對照組與PLA膜組。CAL-27細胞以3×104個/mL的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(0.2 mL/孔)，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，對照組重新加入0.2 ml培養(yǎng)液，PLA膜組加入未載藥空白PLA膜(8%wt)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT液，培養(yǎng)4 h后，棄掉上清液，每孔加入150 μl DMSO，室溫下震蕩10 min后使用酶標儀(490 nm波長)檢測各孔OD值，根據(jù)數(shù)值計算細胞生存率。細胞生存率計算公式：細胞生存率=PLA膜組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 檢測加入不同載藥量DDP/PLA膜后CAL-27細胞的生存率

實驗分為4組，分別為對照組，DDP/PLA膜1(1×10-3:1)組，DDP/PLA膜2(2×10-3:1)組、DDP/PLA膜3(3×10-3:1)組，每組設(shè)置9個復(fù)孔。CAL-27細胞以6×104個/mL的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(0.2 mL/孔)，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，然后棄掉孔內(nèi)上清液，各組加入相應(yīng)藥膜和新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)1、3、5、7 d后，每孔加入20 μl MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，每孔加入150 μl DMSO，室溫下震蕩10 min后使用酶標儀(490 nm波長)檢測各孔OD值，根據(jù)數(shù)值計算細胞生存率。

1.7 MTT法對比兩種載藥體系載相同量DDP對CAL-27細胞的生存率影響情況

根據(jù)溶解DDP的不同方法將兩種載藥體系命名為DDP/PLA(H2O)膜和DDP/PLA(DMF)膜，DDP/PLA(H2O)膜參考Hao等[2]所用方法制備，并向兩種不同方法制備的載藥膜中加入相同質(zhì)量的DDP。實驗分為3組，分別為對照組、DDP/PLA(H2O)膜組和DDP/PLA(DMF)膜組，每組設(shè)置9個復(fù)孔，CAL-27細胞以6×104個/mL的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(0.2 mL/孔)，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，然后棄掉孔內(nèi)上清液各組加入相應(yīng)藥膜和新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)1、3、5、7 d，每次取出一個孔板，分別加入20 μl MTT液，培養(yǎng)4 h后，棄掉上清液，每孔加入150 μl DMSO，室溫下震蕩10 min后使用酶標儀(490 nm波長)檢測各孔OD值，根據(jù)數(shù)值計算細胞生存率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量分數(shù)的PLA膜及不同載藥量的DDP/PLA膜的微觀形貌觀察

SEM觀察可見(如圖1)：當紡絲溶液濃度低于6%wt時，纖維出現(xiàn)彎曲斷裂的情況，隨著PLA質(zhì)量分數(shù)的增加，纖維由雜亂扭曲逐漸變得均勻光滑，纖維直徑也逐漸變大，當紡絲濃度達到7%時，基本可以得到連續(xù)的纖維，但仍存在纖維直徑不均勻現(xiàn)象，當紡絲溶液濃度增加至8%wt時，纖維則表現(xiàn)的更加均勻連續(xù)，當繼續(xù)增加紡絲溶液濃度至9%wt時，紡絲溶液粘度過高易導(dǎo)致注射器堵塞，紡絲困難。

向濃度為8%wt的PLA溶液中加入DDP溶液進行紡絲，載DDP后纖維表面光滑無結(jié)節(jié)或凸起，說明DDP很好的包裹在了纖維當中，加入DDP后直徑明顯增大，但提高載DDP的量對纖維直徑并無明顯影響(見表1)。

表1 各組靜電紡絲納米纖維直徑統(tǒng)計表(單位：nm)

2.2 紫外分光光度分析法測定體外釋放性能

根據(jù)圖2累積釋放曲線可以看出：藥膜在PBS中釋放均勻緩慢。第1天時，BSA/PLA膜中BSA的累積釋放量為32.05%，隨后逐漸表現(xiàn)為均勻緩慢的釋放趨勢，直至第19天釋放率幾乎與前一天持平達80.61%，表明BSA釋放趨于完全。

2.3 生物相容性測試

通過對空白PLA膜進行細胞實驗，以檢驗PLA作為藥物載體在體外實驗中的生物相容性。圖3為加入空白PLA膜24 h后實驗組與對照組細胞的生存率的對比情況。如圖所示，與對照組相比，未載藥PLA膜組的細胞生存率為(99.63±7.61)% (P>0.05)，說明本實驗中的藥物載體PLA膜有很好的生物相容性。

2.4 不同載藥量DDP/PLA膜作用后CAL-27細胞的生存率

圖4為加入不同載藥量DDP/PLA膜作用不同時間CAL-27細胞的細胞活性情況，第1天DDP/PLA膜1組、DDP/PLA膜2組、DDP/PLA膜3組對細胞的抑制作用不明顯(P>0.05)；第3天以后，各組細胞生存率下降明顯(P<0.05),且細胞生存率的下降趨勢呈時間和藥物濃度依賴性，說明該載藥體系成功提高了DDP載藥量并增強了對CAL-27細胞的抑制作用。

2.5 兩種載藥體系載相同量DDP作用后CAL-27細胞的生存率

圖5為投入等量DDP的兩種載藥體系對CAL-27細胞的增殖抑制情況，第1天，兩種方法所制備的載藥膜對CAL-27細胞的抑制效果沒有明顯差異(P>0.05)，DDP/PLA(H2O)膜組細胞生存率為(89.36±3.10)%，略低于DDP/PLA(DMF)膜組(93.07±6.88)%；隨后的第3、5、7天，DDP/PLA(DMF)膜組細胞生存率均明顯低于DDP/PLA(H2O)膜(P<0.05)，這表明改進后的體系具有更高的藥物利用率和包封效果，使得等量的藥物發(fā)揮更強的作用。

a:PLA膜(5%wt);b:PLA膜(6%wt);c:PLA膜(7%wt);d:PLA膜(8%wt);e:PLA膜(9%wt);f:DDP/PLA膜(1×10-3:1);g:DDP/PLA膜(2×10-3:1);h:DDP/PLA膜(3×10-3:1)

圖1 SEM觀察PLA膜與DDP/PLA膜表面形態(tài)

圖2 BSA/PLA膜體外釋放曲線

圖3 加入空白PLA膜24 h后CAL-27細胞活性

3 討論

納米藥物是納米技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展起來的重要產(chǎn)品，其中納米纖維作為緩慢控制藥物釋放的載體，已被廣泛應(yīng)用于藥物轉(zhuǎn)運方面[3]。

圖4 加入不同載藥量DDP/PLA膜后CAL-27細胞活性

圖5 兩種載藥體系載相同量DDP作用后CAL-27細胞的生存率

靜電紡絲納米纖維膜是一種利用靜電紡絲技術(shù)制備的納米材料，單位質(zhì)量下表面積越大載藥率和包封率越高，柔軟無銳角可適應(yīng)各種創(chuàng)口的形狀，這些特性使其在傷口敷料、局部治療、組織工程應(yīng)用中均呈現(xiàn)良好效果[4]。在癌癥治療中，這種載體材料多用于局部化療以減少對周圍組織造成損害，實現(xiàn)高效安全的治療目的。

Xu等[5]在聚乙二醇-聚乳酸二聯(lián)支架中封裝抗腫瘤藥物卡莫司汀，作用于鼠惡性膠質(zhì)瘤細胞，取得了持續(xù)的生長抑制效果，顯示了電紡支架在化療中的價值；Zhang等[6]制備了多層載順鉑靜電紡絲膜用于防止肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)，結(jié)果顯示，與其他治療組相比，多層載順鉑靜電紡絲膜組能夠延長順鉑的釋放時間，推遲腫瘤復(fù)發(fā)時間，延長生存時間并具有更少的毒性；Liu等[7]針對繼發(fā)性肝癌(SHCC)研制了以PLA為載體包封抗癌藥物阿霉素的靜電紡絲載藥納米纖維，并對結(jié)節(jié)性、彌散性SHCC模型小鼠進行治療效果的研究。結(jié)節(jié)性SHCC小鼠體內(nèi)腫瘤生長受到顯著抑制，彌散性SHCC小鼠的中值生存時間從14天延長到38天。局部化療為預(yù)防SHCC及不能手術(shù)的患者提供了理想的選擇。

本課題組多年來致力于口腔癌的治療和發(fā)病機制的研究，制備了載順鉑聚乳酸靜電紡絲納米纖維膜(DDP/PLA膜)并進行表征，體外觀察了該載藥膜對口腔癌細胞CAL-27的抑制作用，結(jié)果顯示，與直接給藥相比，隨著時間的推移，DDP/PLA膜對CAL-27的抑制作用逐漸增強，顯示出緩釋的優(yōu)點[2]。但該載藥體系存在載藥量受限的問題，因DDP在H2O中溶解度低，每1gPLA最多搭載2 mg DDP；同時，紡絲液需要添加表面活性劑——十二烷基硫酸鈉(SDS)才可使互不相溶的PLA溶液與DDP水溶液乳化成為乳液，造成載藥體系不穩(wěn)定。因此，為了使載藥體系穩(wěn)定、增加DDP載藥量，本研究將DMF作為溶劑溶解DDP，結(jié)果表明：每 1 gPLA最多可搭載24 mgDDP，載藥量得到了極大的提升；另一方面，利用DMF溶解DDP不需要SDS的乳化作用，得到的紡絲液更為穩(wěn)定。掃描電鏡顯示順鉑較好的包裹在纖維中，靜電紡絲納米纖維微觀形貌變化表現(xiàn)隨著PLA濃度由5%增加到9%纖維趨向均勻平滑，納米纖維平均直徑由(181.58±66.22)nm增加到(1624.27±369.57)nm；載DDP后纖維直徑平均維持在(2186.61±568.2)nm；體外釋放速度測試顯示24 h時累計釋放量在35%左右，后期釋放平緩，持續(xù)釋放到18天左右。載DDP的納米纖維膜對CAL-27細胞增殖能力的抑制作用具有藥物濃度依賴性；改進后的體系表現(xiàn)出了更強的增殖抑制能力。

綜上，本研究保持了原體系優(yōu)良的生物相容性，以及緩慢釋放藥物的性能，但對DDP的搭載能力有了大幅度的提升，增強了對CAL-27細胞增殖抑制能力，并且提高了藥物的利用率，為口腔鱗狀細胞癌局部化學(xué)藥物治療奠定基礎(chǔ)。