三七不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)研究

張 鐵，楊本恒，楊永超

（1.文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，云南文山663099；2.文山州生物資源開發(fā)研究中心，云南文山663099；3.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南文山663099）

三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]為五加科人參屬植物，有“人參之王”、“南國神草”等美譽(yù)，栽培歷史悠久，為中國傳統(tǒng)名貴中藥材，主產(chǎn)于云南文山州和廣西等地[1]。三七以根莖、肉質(zhì)根和花入藥，具有清熱、止血、散淤、消炎、止痛、滋補(bǔ)等功效[2]。三七愈傷組織的獲得可以進(jìn)行三七組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、種苗繁育等，對三七種質(zhì)資源的保護(hù)與利用、優(yōu)質(zhì)種苗提供、次生代謝物質(zhì)獲取等方面具有重要意義。前人對三七愈傷組織誘導(dǎo)研究報(bào)道表明，2，4-D對三七愈傷組織誘導(dǎo)具有重要作用，但用量不一，而且不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的效率也不一樣[3]，為找出適合三七外植體材料和探明2，4-D最佳濃度，本研究以MS為基本培養(yǎng)基，輔以0.5 mg/L的6-BA，研究了不同濃度2，4-D對三七不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期為三七工廠化育苗、藥理研究等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

三七無菌組培苗由文山學(xué)院生物資源開發(fā)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

選用大小一致的三七組培苗，在無菌條件下分別從無菌組培苗的葉、葉柄、帶部分葉的葉柄、主根和毛根上切取大小為0.5 cm的組織，并接種于5種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基激素種類及濃度見表1，每瓶接種4塊。每處理接種10瓶，重復(fù)3次?；A(chǔ)培養(yǎng)基MS，蔗糖濃度3%，瓊脂濃度0.6%，pH值5.8，并在24～26℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，對照為鄭光植等[4]誘導(dǎo)三七愈傷組織的培養(yǎng)基。

表1 三七不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.3 愈傷組織發(fā)生率及生長狀況評價(jià)

接種40 d后觀察愈傷組織發(fā)生率及生長情況。在統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率時(shí)，只要有愈傷組織出現(xiàn)（包括污染者）即可計(jì)數(shù)。觀察記載不同外植體在不同培養(yǎng)基中的愈傷組織發(fā)生位置、質(zhì)地（致密、疏松）、顏色。

1.4 增殖率統(tǒng)計(jì)

增殖率統(tǒng)計(jì)方法參見許鴻源等[5]的方法，即培養(yǎng)40 d后，每重復(fù)隨機(jī)抽5瓶，重復(fù)3次。取出愈傷組織稱量鮮重，鮮重為5個(gè)培養(yǎng)瓶中三七愈傷組織鮮重（g）的平均值。

計(jì)算平均值以比較不同細(xì)胞分裂素對愈傷組織增殖量的影響，并使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。增殖率計(jì)算方式如下：

式中 ΔW：愈傷組織生長量（g）；W1：愈傷組織接種量（g）；W2：愈傷組織收獲量（g）；P：愈傷組織增殖速率（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率

三七的葉、帶部分葉的葉柄、葉柄、芽、主根、毛根均可以誘導(dǎo)出愈傷組織，而且在5種培養(yǎng)基上經(jīng)過40 d的培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率均達(dá)到了100%。

2.2 三七不同外植體愈傷組織發(fā)生情況

三七不同外植體接種5種培養(yǎng)基后，15 d左右出現(xiàn)明顯的愈傷組織，40 d后不同外植體愈傷組織發(fā)生位置、顏色、質(zhì)地等見表2。

表2 三七不同外植體愈傷組織的情況

2.3 不同濃度2，4-D對三七不同外植體增殖的影響

三七的葉、帶部分葉的葉柄、葉柄、芽、主根、毛根均可在5種培養(yǎng)基上被誘導(dǎo)出愈傷組織，不同培養(yǎng)基對不同三七外植體愈傷組織促進(jìn)作用不盡相同。以葉柄和芽為外植體時(shí)，愈傷組織的增殖效率較高，增殖率分別最高達(dá)到82.82%和80.61%，相對應(yīng)的培養(yǎng)基為4號培養(yǎng)基和5號培養(yǎng)基（CK）。以主根和毛根為外植體時(shí)，1號培養(yǎng)基對增殖具有較好的效果，增殖率分別達(dá)到了55.54%和60.00%。以葉和帶部分葉的葉柄作為外植體時(shí)，2號和3號培養(yǎng)基表現(xiàn)較佳，增殖率分別為49.27%和47.43%。部分三七外植體愈傷組織生長情況見圖1。

圖1 三七外植體愈傷組織生長情況

表3 不同濃度2，4-D對三七不同外植體增殖的影響

3 討論

三七的莖、塊根、葉、葉柄、幼嫩花蕾、花藥均可作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)[3]，本研究中采用帶部分葉的葉柄、主根、不定根及芽也能誘導(dǎo)出愈傷組織，這說明三七組織培養(yǎng)所用的外植體取材較為廣泛。以無菌苗為材料，可以提供較多的葉、葉柄，而主根、不定根及芽較少，相較于葉，以葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量較好，增殖效率較高，故葉柄是較佳的外植體材料。

使用植物激素是植物組織培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育的常用手段，三七愈傷組織誘導(dǎo)多采用2，4-D、6-BA、IAA、KT、ZT、靈發(fā)素等激素中的 2種或3種以不同濃度進(jìn)行組合[5～8]。本研究中6-BA濃度為 0.5 mg/L和 2，4-D濃度為 0.5～2.0 mg/L，均能誘導(dǎo)三七不同外植體愈傷組織，其中，葉柄隨2，4-D濃度增加，其增殖率隨之增加。最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，蔗糖濃度 3%，瓊脂濃度0.6%。另外，鄭光植等所用的激素組合2，4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L在芽和不定根作為外植體時(shí)表現(xiàn)較好，在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道[8]，是用于三七組織培養(yǎng)較為經(jīng)典的激素組合。