腳板薯的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究

杜尚廣

摘要：為建立一套完整的腳板薯離體快速繁殖體系，以腳板薯莖段為試驗(yàn)材料，研究腳板薯莖段表面滅菌、叢生芽誘導(dǎo)、無(wú)菌苗增殖及移栽等。結(jié)果表明，腳板薯莖段叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭 1.2 g/L，誘導(dǎo)率為93.6%;叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 0.8 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.6 g/L+蔗糖40 g/L，增殖倍數(shù)為4.61，組培苗煉苗成活率達(dá)70%以上。本研究建立了腳板薯的離體快速繁殖技術(shù)體系，研究結(jié)果可為腳板薯的工業(yè)化育苗提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：腳板薯;快速繁殖;增殖;組織培養(yǎng)

腳板薯（Dioscorea batatas Decne）是薯蕷科薯蕷屬一年生或多年生藤本植物，因其地下塊莖呈不規(guī)則的扁塊形，形如腳掌而得名[1]，薯塊單塊質(zhì)量1～2 kg，顏色有紫紅色、白色2種。腳板薯以其肉質(zhì)紫紅、塊大味美，并具有健脾、養(yǎng)胃、補(bǔ)肝等功效而聞名[2]，現(xiàn)已廣泛種植于廣東省、廣西壯族自治區(qū)、福建省、江西省、湖南省等地。由于腳板薯塊莖中富含蛋白質(zhì)、淀粉、維生素、礦物質(zhì)、以及較多的皂苷等成分，目前已作為一種經(jīng)濟(jì)作物在全球范圍內(nèi)大面積種植[3-5]。腳板薯中所含皂苷具有降血脂、調(diào)節(jié)血壓和輔助治療癌癥的作用，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是一種具有很大開發(fā)價(jià)值的藥食同源產(chǎn)品[4-6]。

近年來，隨著對(duì)腳板薯化學(xué)成分及藥理作用的研究不斷深入，以及人們對(duì)健康飲食要求的逐漸提高，腳板薯的需求量進(jìn)一步增加[7-8]。傳統(tǒng)的無(wú)性繁殖方式出苗早、生長(zhǎng)快，但繁殖系數(shù)低，用種量較大;長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖導(dǎo)致品種嚴(yán)重退化，產(chǎn)量大幅降低，迫切需要對(duì)腳板薯栽培品種進(jìn)行脫毒改良，建立快速繁殖體系。傳統(tǒng)的種子繁殖方式易造成薯蕷科植物后代單株之間差異較大，難以穩(wěn)定保持優(yōu)良性狀。組織培養(yǎng)快繁技術(shù)是以優(yōu)良無(wú)性系為外植體，通過無(wú)菌培養(yǎng)快速得到組培苗;該技術(shù)具有產(chǎn)量高、易于生產(chǎn)管理且能保持原有品種的優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)，可以有效克服傳統(tǒng)無(wú)性繁殖和種子繁殖存在的問題[9-10]。

目前，有關(guān)薯蕷科組織培養(yǎng)方面的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道。Malaurie等對(duì)不同品種山藥進(jìn)行了增殖和生根培養(yǎng)[11]。Jasik等在培養(yǎng)基中添加茉莉酸對(duì)山藥進(jìn)行誘導(dǎo)[12]。Alizadeh等對(duì)菊葉薯蕷進(jìn)行體外增殖，表明適量外源激素對(duì)薯蕷科組織培養(yǎng)有較大促進(jìn)作用[13]。王應(yīng)想等對(duì)腳板薯試管苗的生長(zhǎng)、莖節(jié)產(chǎn)生和零余子誘導(dǎo)進(jìn)行研究，但尚未建立離體快繁技術(shù)體系[14]。目前，對(duì)腳板薯離體快繁的研究尚未見報(bào)道，本研究采用腳板薯的莖段為外植體，通過對(duì)腳板薯莖段表面滅菌、不定芽誘導(dǎo)、無(wú)菌苗增殖及移栽等，增殖過程同步壯苗和生根，省時(shí)省力且移栽成活率很高，無(wú)需專門進(jìn)行壯苗和生根培養(yǎng);本研究建立了離體快速繁殖體系，以期為腳板薯工廠化育苗及脫毒苗的培育提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腳板薯塊莖由江西省萬(wàn)載縣輝明有機(jī)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供。瓊脂、蔗糖等所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

ZY100型同時(shí)蒸餾萃取儀，上海銀澤儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn); LMQC型立式滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn);SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn);JY3002電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);艾柯DZG-303A超純水儀，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn); RDX型智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體的表面滅菌 選擇塊莖大、無(wú)病蟲害、肉質(zhì)紫紅色的腳板薯，將其切成小塊，每塊50～100 g，確保每小塊塊莖均帶有芽眼;然后，將每小塊的切面沾滿草木灰，放在太陽(yáng)下曬1～2 h，室內(nèi)晾1～3 d;待切面愈合后再播種，可防止切口腐爛，促使發(fā)芽整齊。當(dāng)芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，取1 cm莖段，每個(gè)莖段含有1個(gè)節(jié)點(diǎn)，洗衣粉浸泡10 min，流水沖洗30～60 min，在無(wú)菌工作臺(tái)上利用2步法脫毒，即75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，然后用0.1%氯化汞浸泡2～3 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。將處理好的外植體接種到MS培養(yǎng)基中。

1.3.2 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 為獲得最適叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，選用L16（45）設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素4水平的正交試驗(yàn)，14 d后，統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率;根據(jù)設(shè)計(jì)在每種培養(yǎng)基中接種40個(gè)莖段，每種20瓶，每瓶2個(gè)。

叢生芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出叢生芽的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)×100%。

1.3.3 叢生芽增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化 以MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.2 g/L+蔗糖40 g/L+瓊脂7 g/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)莖段20 d。選用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加1.6 g/L活性炭以防褐化，并選用L16（45）設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素4水平的正交試驗(yàn)。每種培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接40個(gè)上述含有叢生芽的莖段，培養(yǎng)20 d，觀察、統(tǒng)計(jì)每組的增殖倍數(shù)。

增殖倍數(shù)=叢生芽數(shù)÷接種的外植體數(shù)。

1.3.4 煉苗和移栽 將接種于叢生芽增殖培養(yǎng)基中的芽體培養(yǎng)60 d后，向組培瓶中加入?yún)采吭鲋车囊后w培養(yǎng)基，約1 cm 深，15 d之后進(jìn)行室外煉苗。將組培瓶從組培室中移至室外陰涼處放置5～7 d，然后開蓋保持5～7 d，在此過程中噴灑少量水，保持濕潤(rùn)環(huán)境。取出組培苗，用自來水洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，再用0.1% KMnO4浸泡30 s，最后用自來水清洗，將處理好的組培苗移栽至土壤 ∶ 珍珠巖（1 ∶ 3）的混合基質(zhì)中，組培苗長(zhǎng)出3片新葉即計(jì)為成活，統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.4 培養(yǎng)條件

組培室白天溫度（25±2） ℃，夜間溫度（20±2） ℃，光周期12 h/d，光照度3 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

激素是誘導(dǎo)叢生芽分化的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)叢生芽的生長(zhǎng)起到?jīng)Q定性的作用。接種5 d，腳板薯莖段節(jié)點(diǎn)處開始萌動(dòng)，然后芽不斷生長(zhǎng)膨大，葉片逐漸由紫紅色變成深紅色;14 d后，叢生芽生長(zhǎng)速度加快，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)探索不同激素組合對(duì)腳板薯叢生芽的影響（表1至表3）。

從表1可以看出，4個(gè)因素對(duì)腳板薯誘導(dǎo)的影響大小依次為活性炭>烯效唑>NAA>6-BA。分析結(jié)果表明，當(dāng)NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最高，較低濃度的NAA有助于芽的生長(zhǎng);當(dāng)6-BA濃度為3.2 mg/L時(shí)，腳板薯的叢生芽誘導(dǎo)效果最好，原因是不同濃度的6-BA具有促進(jìn)或抑制酶的活性，從而影響芽的生長(zhǎng);當(dāng)活性炭濃度為1.2 g/L時(shí)，誘導(dǎo)出的腋芽數(shù)最多，長(zhǎng)勢(shì)最好，隨著活性炭濃度的升高，腳板薯褐化情況顯著改善，但腋芽數(shù)目降低、長(zhǎng)勢(shì)較差;可能是活性炭吸附腳板薯切口處的酚類物質(zhì)，防止褐化的產(chǎn)生，同時(shí)也吸附培養(yǎng)基中叢生芽誘導(dǎo)所需的激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于誘導(dǎo)的進(jìn)行;當(dāng)烯效唑濃度為2.9 mg/L時(shí)，葉片濃綠、莖粗壯、長(zhǎng)勢(shì)最好，誘導(dǎo)率最高;隨著烯效唑濃度的增大誘導(dǎo)率先增大后減小，可能是高濃度的烯效唑活性較強(qiáng)，抑制芽的生長(zhǎng)。由極差分析可知，叢生芽誘導(dǎo)效果最佳的組合是A2B1C1D2，即：MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.2 g/L。在此條件下試驗(yàn)在正交表的16次試驗(yàn)中并沒有出現(xiàn)，通過做補(bǔ)充試驗(yàn)，結(jié)果得到叢生芽誘導(dǎo)率為93.6%、芽數(shù)達(dá)2.05個(gè)，大于正交試驗(yàn)結(jié)果中的誘導(dǎo)率最高值（90.0%）、芽數(shù)（1.97個(gè)），說明利用正交試驗(yàn)優(yōu)化叢生芽誘導(dǎo)是成功的。

2.2 叢生芽增殖培養(yǎng)

腳板薯組培苗在16種不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后，對(duì)叢生芽的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表4、表5。從表4可以看出，NAA、6-BA、烯效唑、蔗糖4個(gè)因素對(duì)腳板薯叢生芽增殖生長(zhǎng)影響差異較大，不同因素影響大小依次為NAA>烯效唑>蔗糖>6-BA。隨著NAA濃度增大，增殖倍數(shù)呈先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度為0.7 mg/L時(shí)增殖倍數(shù)最大;當(dāng)6-BA濃度為0.8 mg/L時(shí)增殖倍數(shù)最高;隨著蔗糖濃度的增加，增殖倍數(shù)先增大后減小，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)40 g/L時(shí)增殖倍數(shù)最高;烯效唑具有控制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)、縮短節(jié)間、矮化植株，促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)的作用，當(dāng)烯效唑濃度為3.1 mg/L時(shí)增殖倍數(shù)最大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基對(duì)叢生芽的增殖無(wú)顯著影響，最佳增殖效果的培養(yǎng)基為：MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 0.8 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+蔗糖 40 g/L+活性炭1.6 g/L，增殖倍數(shù)為4.61。

在培養(yǎng)的過程中，當(dāng)MS培養(yǎng)基中添加NAA 0.7 mg/L、活性炭1.6 g/L、烯效唑3.1 mg/L、6-BA 0.8 mg/L、蔗糖40 g/L 時(shí)，叢生芽生長(zhǎng)快、繁殖系數(shù)高;葉色濃綠、莖段粗壯，所以無(wú)需專門進(jìn)行壯苗培養(yǎng);同時(shí)，莖段節(jié)點(diǎn)處萌動(dòng)生根并形成發(fā)達(dá)的根系，有時(shí)根的生長(zhǎng)速度高于莖的生長(zhǎng) （圖1-B、圖1-C），煉苗和移栽環(huán)節(jié)成活率較高，可滿足生產(chǎn)的需要，所以無(wú)需再進(jìn)行生根培養(yǎng)。即，叢生芽增殖過程中壯苗和生根同步進(jìn)行，并取得很好的效果，所以，本試驗(yàn)無(wú)需專門進(jìn)行壯苗和生根培養(yǎng)。這大大縮短快繁體系所用時(shí)間、降低培養(yǎng)成本，建立更為有效的腳板薯快繁體系（圖1-D）。

2.3 煉苗和移栽

完整的再生植株煉苗之前（圖1-B），在組培瓶中加1 cm 深的液體增殖培養(yǎng)基，組培苗生長(zhǎng)更快、莖稈更加粗壯，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，加液體培養(yǎng)基比不加液體培養(yǎng)基的組培苗平均高約1.5 cm;并且在煉苗過程中，組培瓶?jī)?nèi)部環(huán)境濕潤(rùn)，能夠有效防止葉片枯萎，提高成活率。

處理后的組培苗（圖1-C），剪掉失水的葉片，可有效防止葉片細(xì)菌孳生，污染致死。組培苗較為脆弱，葉片易失水，移栽置于陰涼通風(fēng)的溫室大棚中，可提高成活率。研究發(fā)現(xiàn)，煉苗成活率達(dá)70%以上。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)得到了腳板薯莖段叢生芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 3.2 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.2 g/L，誘導(dǎo)率為936%;叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.7 mg/L+6-BA 0.8 mg/L+烯效唑2.9 mg/L+活性炭1.6 g/L+蔗糖40 g/L，增殖倍數(shù)為4.61;增殖過程同步進(jìn)行壯苗和生根，煉苗成活率可達(dá)70%以上。本研究建立了腳板薯脫毒快繁技術(shù)體系，為工廠化育苗提供技術(shù)支持。

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