DNA測序鑒定非結(jié)核分枝桿菌的研究進展

陳培幸

[摘要]非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染的患者數(shù)量逐年增加，同時，NTM新的亞種不斷被發(fā)現(xiàn)，這導致其檢測鑒定難度也隨之增加。迄今發(fā)現(xiàn)的菌種已有160余種，而傳統(tǒng)檢測方法（培養(yǎng)基培養(yǎng)后輔以生化試驗）不能準確、及時地為臨床診斷提供參考。隨著分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，利用NTM同源DNA序列中的特異性（如16S核糖體DNA、核糖體蛋白S1、轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列1、熱休克蛋白65、rpo B等）可以快速鑒定菌種。使用DNA序列進化樹聚類分析或DNA序列數(shù)據(jù)庫比對，能夠快速、準確鑒定NTM。單一的分子標識技術(shù)對NTM的鑒定不能達到種及亞種水平，采用多重的分子標識組合技術(shù)能在一定程度上完善單一分子標識鑒定菌種的不足之處，因此，可提高菌種鑒定水平的多重分子標識技術(shù)值得構(gòu)建。

[關(guān)鍵詞]非結(jié)核分枝桿菌;DNA測序;鑒定

[中圖分類號] R372? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）7（c）-0030-04

[Abstract] The number of patients with nontuberculous Mycobacteria （NTM） infection increased year by year. Meanwhile， new subspecies of NTM were continuously discovered， which led to the increased difficulty in detection and identification. So far， more than 160 species have been discovered. Traditional methods of testing （supplemented with biochemical tests ） can not provide accurate and timely reference for clinical diagnosis. With the rapid development of molecular biology techniques， the specificity of NTM homologous DNA sequences （such as 16S rDNA， rps A， ITS-1， heat shock protein 65， rpo B， etc.） can be used to rapidly identify bacterial species. Using DNA sequence evolutionary tree clustering analysis or DNA sequence database comparison can rapid and accurate identification of NTM. The identification of NTM by single molecular marker technology can′t reach the level of species or subspeciesl， and the application of multiple molecular combination technology can improve the shortcomings of single molecular marker identification to some extent. Therefore， it is worthwhile to construct? multiple molecular identification techniques that can improve the level of strain identification.

[Key words] Nontuberculous Mycobacteria; DNA sequence; Identification

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous Mycobacteria，NTM）系指除了結(jié)核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌外的一大類分枝桿菌的總稱。NTM種類繁多，迄今已發(fā)現(xiàn)160余種，通常采用Runyon分類法（NTM在試管內(nèi)的生長溫度、速度、菌落形態(tài)和色素產(chǎn)生與光反應關(guān)系）將NTM分為光產(chǎn)色菌、暗產(chǎn)色菌、不產(chǎn)色菌及快速生長分枝桿菌4組[1]。NTM廣泛存在于自然環(huán)境中，主要通過水和土壤傳播，極少數(shù)為致病菌，多數(shù)為條件致病菌，人通過環(huán)境接觸感染NTM而患病[2-3]。近期的研究顯示，NTM的分離率由4.3%（1979年統(tǒng)計）上升至11.1%（2000年統(tǒng)計），再到21.0%（2010年統(tǒng)計）[4]，這反映出我國的NTM病患者呈明顯增多趨勢。NTM病與結(jié)核病的臨床表現(xiàn)相似，多表現(xiàn)為全身中毒癥狀和局部損害，主要累及肺、淋巴結(jié)、皮膚及免疫受損患者，若能及時鑒定出菌種甚至亞種，可減少誤診，進而降低因誤診導致的不良后果[2，5]。不同種類NTM感染采用的治療方案亦不同，因此，明確NTM是否感染及鑒定出準確的亞種是擬定最佳診療方案的關(guān)鍵。

NTM的實驗室檢測方法主要是傳統(tǒng)細菌學檢測和分子生物學檢測，傳統(tǒng)檢測方法（培養(yǎng)基培養(yǎng)后輔以生化試驗）因簡單、試劑價格合理且易于推廣而被沿用至今，但其耗時長、陽性率低、污染大且缺乏可重復性，不能準確、及時地為臨床診斷提供參考[6]。隨著分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，利用NTM同源DNA序列中的特異性可以鑒定其菌種甚至亞種，這為臨床診斷提供了確切依據(jù)，其由于快速、高效、特異等優(yōu)點而受到青睞。本文對DNA測序鑒定NTM菌種的研究進展進行論述。

1同源DNA序列的菌種鑒定鑒定

DNA測序技術(shù)伴隨分子生物學技術(shù)的快速進步而日臻完善，已成為鑒定菌種的“主流技術(shù)”。其依據(jù)不同種NTM的DNA同源性片段的特異性將該分枝桿菌鑒定至種或亞種水平，分辨力較高，同時鑒定時間短。菌種鑒定的DNA序列既要滿足種內(nèi)高度保守，種間也要存在一定程度的序列差異。菌種與菌種之間的DNA序列差異越大則鑒別能力越強，而為了減少對鑒定結(jié)果的干擾，種內(nèi)DNA序列差異越小則保守程度越高。

1.1 16S核糖體DNA（16S ribosomal DNA，16S rDNA）

16S rDNA是細菌DNA序列，可編碼染色體上16S rRNA相對應的序列，是所有細菌染色體基因的固有序列，可用于菌種的鑒定。16S rDNA的序列由可變區(qū)（variable region）和恒定區(qū)（constant region）組成，恒定區(qū)體現(xiàn)物種間的親緣關(guān)系，可變區(qū)則呈現(xiàn)物種間的差異程度。16S rDNA種類少，含量大，分子大小適中，既能體現(xiàn)不同菌屬間的差異，又可通過測序技術(shù)較容易測出其序列，且DNA的提取較RNA容易，也比較穩(wěn)定，作為鑒定分枝桿菌的“金標準”能夠?qū)⒓毦b定至種甚至亞種水平;但由于某些分枝桿菌同源DNA序列一致性高、親緣性接近，16S rDNA序列組成完全一致，從而無法區(qū)分菌種，比如鳥和胞內(nèi)分枝桿菌、龜和膿腫分枝桿菌、堪薩斯和胃分枝桿菌、蘇加分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌[7]。

1.2核糖體蛋白S1（ribosomal protein S1 gene，rps A）基因

rps A基因是負責編碼核糖體蛋白S1的基因序列，完整的rps A基因長度為565-bp，可作為一個新穎的鑒定分枝桿菌菌種的生物學標志物。rps A基因序列可以區(qū)分16S rDNA基因無法鑒別的鳥和胞內(nèi)分枝桿菌、龜和膿腫分枝桿菌、堪薩斯和胃分枝桿菌、蘇加分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌。rps A基因鑒定臨床分離的分枝桿菌菌種準確率高，可以有效地進行分枝桿菌菌種的鑒定，能夠作為16S rDNA序列檢測的一個補充[8]。

1.3轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列1（16S rDNA-23S rDNA internal transcribed spacer 1，ITS-1）

ITS-1是存在于所有類型細菌基因組中的16S rDNA與23S rDNA之間的DNA序列，不具備編碼功能蛋白的功能，但參與形成pre-RNAs。NTM的ITS-1序列的種間變異度大于16S rDNA，是16S rDNA序列分析鑒定菌種方法的一種補充或是一個替代的DNA位點[9]。利用ITS-1序列進行限制片段位點多態(tài)性（RFLPs）擴增，鑒定分枝桿菌菌種從需要8～10周進行培養(yǎng)及生化檢測縮減至4～6周，若已明確痰培養(yǎng)陽性者，鑒定時長縮減至2 d[10]。ITS-1可區(qū)分某些16S rDNA序列無法區(qū)分的部分種類分枝桿菌，有研究顯示可以鑒定結(jié)核桿菌符合群、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰病分支桿菌、偶然分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分支桿菌及恥垢分枝桿菌[11]。由于不同種類的分枝桿菌ITS-1序列之間存在堿基的插入和缺失，且ITS-1序列擴增效率低和保存的ITS-1序列不全等因素制約了該方法在鑒定分枝桿菌菌種中的應用。

1.4熱休克蛋白65（hot shock protein 65，hsp65）基因

hsp65是NTM基因組中負責編碼hsp65，參與細胞內(nèi)蛋白組裝、轉(zhuǎn)運的單拷貝功能基因，同時也具有細菌抵抗外界環(huán)境的功能。hsp65基因有2個高可變區(qū)，被長度為441 bp大小的hsp65基因片段覆蓋，不采用全長的hsp65基因進行菌種鑒定比較[12]。研究顯示hsp65基因的鑒別能力高于16S rDNA序列，可鑒別16S rDNA序列無法鑒別的如膿腫、龜分枝桿菌等某些NTM。hsp65同源基因的種內(nèi)差異性比16S rDNA序列低，其鑒定菌種的準確性更高[13-14]，但該基因也存在序列相同一致的問題，例如不能區(qū)別Canettii分枝桿菌以外的結(jié)核分枝桿菌復合群中的其他成員。同時目前應用hsp65序列鑒定NTM菌種尚缺乏大規(guī)模的實驗驗證。

1.5 RNA聚合酶β亞基（RNA polymerase β，rpo B）基因

rpo是由α、β、β′和σ 4個亞單位形成的四聚體，而編碼α、β、β′和σ亞單位的基因分別稱為rpo A、rpo B、rpo C和rpo D基因。rpo B基因是編碼RNA聚合酶β亞單位的基因，高度保守，存在于所有分枝桿菌種屬中，可將菌種鑒定至屬及種水平。完整的rpo B基因長度約為3150 bp，其基因長度短但含有足夠的生物遺傳信息，通過直接測序可鑒定菌株至種屬水平;rpo B基因的鑒別能力優(yōu)于16S rDNA序列，能夠鑒別16 rDNA無法鑒別的菌種或菌株，如堪和胃分枝桿菌、蘇加和馬爾摩分枝桿菌;但是結(jié)核分枝桿菌復合物各成員具有相同的 rpo B基因序列，相互之間無法鑒別。有研究顯示，結(jié)核分枝桿菌耐利福平是由于rpo B基因突變所致，有70多種不同的rpo B突變與利福平耐藥有關(guān)[15]。目前，限制rpo B基因序列在鑒定NTM菌種中的應用主要是基因數(shù)據(jù)庫的不完善;另外，rpo B基因的多態(tài)性是否會影響鑒定NTM臨床菌株的準確性尚未確定，需調(diào)查更多的地區(qū)、檢測更多的臨床標本及測定全長rpo B基因序列來論證[16]。

1.6其他DNA序列

除了上面提到的5個常用的同源基因序列外，dna J、sod A、rec A等在鑒定NTM方面優(yōu)于16S rDNA[17]，但其目前公認度尚不及16S rDNA、ITS1、hsp65和rpo B，存在數(shù)據(jù)庫不完善，這限制了其應用于NTM菌種的鑒定。亦有報道顯示，分泌相關(guān)蛋白基因（sec A1）可鑒定29種分枝桿菌，包括潰瘍和海分枝桿菌，但不能鑒定結(jié)核分枝桿菌復合群（MTC）各成員[18]。

2 DNA序列比較法鑒定NTM

2.1 DNA序列進化樹聚類分析

將已知的所有的NTM某一同源DNA序列通過DNA序列分析軟件進行排序、比較，建立該DNA序列的進化樹，在進化樹中加入待鑒定的NTM的同源DNA序列進行聚類分析，最終鑒定出待檢測的菌種[19]。由于某些NTM不同DNA序列在遺傳進化樹中位置不完全一致，單個DNA序列攜帶的遺傳信息有限，因此單一DNA序列聚類分析增加結(jié)果的不確定性與不同同源序列的進化速度不一致有關(guān)。有學者應用多位點序列分析（multi locus sequence analysis，MLSA）進行人為的串聯(lián)重組，建立多位點DNA序列遺傳系統(tǒng)的進化樹進行聚類分析，使遺傳系統(tǒng)的進化樹聚類分析更可靠[20-22]。DNA序列數(shù)據(jù)庫的正確和完整對DNA序列進化樹聚類分析方法的優(yōu)劣關(guān)系密切。目前尚未建成一個完整的具備所有種類NTM DNA序列的數(shù)據(jù)庫，包括標準菌株和各種變異株。采用進化樹進行聚類分析操作的過程復雜，對操作人員要求較高等因素限制了該技術(shù)的廣泛應用。

2.2比對DNA序列數(shù)據(jù)庫

DNA序列數(shù)據(jù)庫的出現(xiàn)讓DNA序列對比鑒定NTM變得相對容易，在一些開放的公共數(shù)據(jù)庫平臺上，共享不同研究機構(gòu)的數(shù)據(jù)，增加了數(shù)據(jù)庫信息量及完整性，如美國的國家生物信息中心（NCBI）的基因銀行，可使用基本局部比對搜索工具（BLAST）對大部分DNA序列進行對比菌種鑒定[23]。對于普通的使用者，通過數(shù)據(jù)庫中的BLAST對比鑒定，結(jié)果可靠。然而NCBI存在一些鑒定長度不全的序列、錯誤的序列和部分未命名的序列，這些均會對鑒定結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，尤其是NCBI數(shù)據(jù)庫中部分菌種含有的序列信息有限時，錯誤序列將對鑒定結(jié)果造成較大影響。

高質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫對DNA序列比對鑒定結(jié)果的正確性意義重大，如可專一鑒定16S rDNA的MicroSeq數(shù)據(jù)庫[24]和針對ITS的MycoAlign數(shù)據(jù)庫[25]。此外，還有NCBI建立的針對hsp65的專用數(shù)據(jù)庫[26]以及針對16S rDNA與rpo B聯(lián)合分析的RipSeq數(shù)據(jù)軟件[27]。各種高質(zhì)量數(shù)據(jù)庫在減少碎片化序列與錯誤序列存在的同時，提高了鑒定的準確性，然而一些新增的NTM菌種和專一數(shù)據(jù)庫中菌株突變DNA序列對數(shù)據(jù)庫質(zhì)量帶來了很多困難。及時更新、完善新增菌種和種內(nèi)突變株的DNA序列是高質(zhì)量專一數(shù)據(jù)庫發(fā)展的關(guān)鍵。

3小結(jié)與展望

NTM感染的患者數(shù)量逐年增長，快速、準確的診斷有助于臨床治療選擇有效的治療方法。但是，NTM不同亞種存在高度相似的DNA同源性，導致單一標識技術(shù)不能將所有分枝桿菌鑒定至亞種水平，多重分子標識組合技術(shù)在一定程度彌補了單一標識技術(shù)鑒定的缺陷，因此，構(gòu)建多重分子標識組合的技術(shù)可提高鑒定亞種的水平。多個DNA序列聯(lián)合應用可提高對菌種的鑒別能力，但因技術(shù)復雜且目前相關(guān)研究較少，相應的基因數(shù)據(jù)庫不完善限制了其應用范圍。隨著基因數(shù)據(jù)庫的進一步完善，多重分子標識組合檢測技術(shù)的成熟，NTM感染將實現(xiàn)快速、準確的診斷，能夠盡早、有效地治療，最大限度地改善患者預后。

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（收稿日期：2019-01-02? 本文編輯：祁海文）