多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在人顱內破裂與未破裂動脈瘤瘤壁中表達的差異

張頂頂 余波 李勁松 韋永祥 劉翔宇 杭春華

因顱內動脈瘤破裂導致的蛛網(wǎng)膜下腔出血具有較高的發(fā)生率、致殘率和致死率[1]，但對于顱內動脈瘤形成和破裂的機制尚不清楚，臨床上也缺乏有效的治療藥物以防止動脈瘤的形成和破裂[2]。越來越多的研究表明，炎性反應在顱內動脈瘤的形成和破裂中發(fā)揮了重要作用[3-4]，其中多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly adenosine diphosphate ribose polymerase 1，PARP-1)是調節(jié)炎性反應的重要核轉錄因子[5]。因此，筆者擬通過分析PARP-1在人體顱內破裂與未破裂動脈瘤瘤壁中的表達，以期探討顱內動脈瘤形成和破裂的組織病理學機制。

1 對象與方法

1.1 對象

回顧性連續(xù)納入2014年1月至2018年9月南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院(1例)和東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院(12例)接受開顱夾閉手術治療的顱內動脈瘤患者，其中男4例，女9例；年齡42～71歲，平均(55±8)歲。根據(jù)是否破裂，將13例患者分為破裂組(7例)和未破裂組(6例)。破裂組患者女4例，男3例；年齡47～71歲，平均(56±8)歲；大腦中動脈瘤5例，大腦前動脈和小腦上動脈瘤各1例；瘤體直徑6～41 mm；合并高血壓病1例。未破裂組患者女5例，男1例；年齡42～63歲，平均(53±9)歲；大腦中動脈瘤2例，前交通動脈瘤2例，右側頸內動脈床突上段動脈瘤1例，右側眼動脈段動脈瘤1例；瘤體直徑6～35 mm；合并高血壓病2例。兩組患者性別、年齡的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究方案經(jīng)南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院和東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審核批準，患者或其家屬于術前均簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：(1)術前均經(jīng)過CT血管成像和(或)DSA檢查證實為顱內動脈瘤；(2)術中切除組織于術后均經(jīng)蘇木素-伊紅染色證實為顱內動脈瘤瘤壁。排除標準：(1)合并煙霧病或動靜脈血管畸形；(2)既往有顱內動脈瘤介入栓塞史；(3)因頭部外傷發(fā)現(xiàn)顱內動脈瘤的患者，既往有開顱手術史；(4)有免疫系統(tǒng)疾病和(或)長期服用免疫抑制劑；(5)顱內多發(fā)動脈瘤；(6)長期服用阿司匹林藥物。

1.3 主要試劑與儀器

PARP-1抗體(sc-74470，美國santa cruz公司)；一抗稀釋液(P0103，上海碧云天生物技術有限公司)；免疫組織化學染色試劑盒(SPN-9001，北京中杉金橋生物有限公司)，包含生物素標記的羊抗鼠IgG二抗、磷酸鹽緩沖溶液(C0221A)和脫色搖床(E0016)。

1.4 標本處理

將術中切除的顱內動脈瘤瘤壁標本經(jīng)4%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱過夜后，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片，60 ℃烤片8 h備用。

1.5 免疫組織化學染色

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)法。將石蠟切片脫蠟和水化后，用磷酸鹽緩沖溶液在搖床上沖洗3次，3 min/次。蒸餾水浸泡后用乙二胺四乙酸二鈉緩沖液100 ℃下修復20 min，自然冷卻至室溫。蒸餾水沖洗2次，磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，3 min/次。滴加過氧化酶阻斷溶液，室溫條件下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次，5 min/次。滴加山羊非免疫血清，室溫孵育20 min，傾去。PARP-1與一抗稀釋液按1∶50稀釋，室溫條件下孵育60 min，陰性對照用磷酸鹽緩沖溶液代替。磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次，3 min/次。滴加生物素標記的二抗(羊抗鼠IgG)，室溫孵育10 min。磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次，3 min/次。滴加SP溶液，室溫孵育10 min。磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次，3 min/次。二氨基聯(lián)苯胺顯色劑顯色。自來水沖洗后，蘇木素復染，自來水沖洗返藍，用梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。晾干后，顯微鏡下拍片。

1.6 免疫組織化學染色結果判定

由兩名工作年限≥5年的病理科醫(yī)師采用雙盲法判讀。PARP-1免疫組織化學染色陽性結果為細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒，每張切片均在高倍鏡下(×400)計數(shù)10個視野，以10個視野下PARP-1陽性細胞個數(shù)的平均值計為每例患者最終的PARP-1陽性細胞個數(shù)[6]。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

兩組患者的性別、年齡及動脈瘤直徑的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。免疫組織化學染色結果顯示，PARP-1的陽性表達主要位于細胞核中，呈棕黃色；在未破裂動脈瘤瘤壁中，PARP-1陽性細胞個數(shù)較少，分布稀疏，且在動脈瘤壁全層均有表達(圖1a，1b)；在破裂動脈瘤瘤壁中，PARP-1陽性細胞密集分布于血管壁外膜，與未破裂動脈瘤相比，破裂動脈瘤瘤壁中PARP-1陽性細胞個數(shù)增多(圖1c，1d)。破裂組PARP-1的陽性表達高于未破裂組，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組接受開顱夾閉手術治療的顱內動脈瘤患者臨床資料及PARP-1陽性細胞數(shù)比較

注：PARP-1為多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1；a為Fisher確切概率法，b為t值，c為Z值；“-”表示無數(shù)據(jù)

3 討論

PARP-1是一種多功能的細胞核內蛋白，可被斷裂的DNA激活并參與DNA的損傷修復。研究表明，PARP-1在核轉錄因子κB(nuclear transcriptionfactor kappa B，NF-κB)的活性調節(jié)中具有重要作用[5]。PARP-1被激活后，與DNA結合可調節(jié)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)1β和環(huán)氧化酶2等炎性因子的表達[7]。與未破裂動脈瘤相比，NF-κB及炎性因子(TNF-α、IL-1β和環(huán)氧化酶2)在人體顱內破裂動脈瘤瘤壁中的表達明顯升高[8-9]。在顱內動脈瘤動物模型中，應用基因敲除或藥物下調TNF-α、IL-1β和環(huán)氧化酶2的表達，可明顯減少顱內動脈瘤的形成和破裂[10-11]；通過抑制NF-κB的活性可抑制TNF-α、IL-1β和環(huán)氧化酶2的表達，從而減少動脈瘤的破裂[12]。此外，在腹主動脈瘤動物模型中，PARP-1可通過激活NF-κB及其介導的炎性反應促進動脈瘤的形成[13]。本研究結果顯示，PARP-1在顱內破裂動脈瘤瘤壁中的表達高于未破裂動脈，其可能也通過調控NF-κB的活性及其介導的炎性反應參與了動脈瘤的形成和破裂。

本研究免疫組織化學結果顯示，PARP1在破裂動脈瘤瘤壁中的表達主要位于血管壁外膜。傳統(tǒng)觀點認為，血管病變起源于內膜，并向中膜發(fā)展，血管壁外膜僅發(fā)揮營養(yǎng)血管中膜和血管支撐的作用。然而，越來越多的研究結果表明，血管壁外膜不僅是血管壁的一層支持結構，其在血管炎性反應的發(fā)生發(fā)展階段及血管重構中均發(fā)揮重要作用[14-15]。在胸、腹主動脈瘤中，外膜中炎性細胞浸潤(巨噬細胞和T淋巴細胞等)和炎性因子的高表達是動脈瘤形成的重要原因[15]。在多種炎性疾病模型中，PARP-1的高表達常伴炎性細胞的浸潤和炎性因子的產生[5-16]。因此，PARP-1可能通過上調血管壁外膜的炎性反應，參與顱內動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展及破裂。

綜上所述，筆者對接受開顱夾閉手術治療的顱內破裂及未破裂動脈瘤患者進行觀察，其瘤壁的組織病理學結果及PARP-1陽性表達計數(shù)均表明PARP-1在顱內破裂動脈瘤瘤壁中的表達較未破裂動脈瘤瘤壁明顯升高，提示PARP-1有可能在顱內動脈瘤的破裂中發(fā)揮作用。但本研究納入的樣本量較少，且動脈瘤破裂的血液刺激是否對PARP-1的表達產生影響，尚需進一步探討。未來可進一步制作顱內動脈瘤的動物模型，用基因敲除或特異性抑制劑抑制PARP-1的表達，以進一步明確PARP-1在顱內動脈瘤破裂中的作用及機制。