乙酰肝素酶及新生血管在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達

徐斌 石祥恩 李敏 陳偉東 康更潔 杜鐵英 魏娟

頸動脈粥樣硬化易損斑塊的破裂是導(dǎo)致缺血性卒中的重要致病因素之一[1-2]。易損斑塊的破裂機制十分復(fù)雜，是斑塊內(nèi)部組織學特征及微環(huán)境下物理性、化學性、免疫性、缺氧或慢性感染等各種因素共同作用的結(jié)果[3]。病理學研究提示，斑塊內(nèi)新生血管的存在和程度與斑塊的破裂及臨床腦血管事件相關(guān)，其為不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化易損斑塊的預(yù)測指標之一[4]。我們前期采用超聲造影技術(shù)觀察41例頸動脈粥樣硬化患者斑塊內(nèi)新生血管，研究結(jié)果提示，不同性質(zhì)的斑塊內(nèi)均存在新生血管[5-7]。

動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)病理性新生血管產(chǎn)生的機制尚未明確。在對腫瘤及子宮內(nèi)膜異位癥等的研究中發(fā)現(xiàn)，乙酰肝素酶(Heparanase，Hpa)通過釋放血管活性因子參與血管新生[8-11]。實驗研究提示，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細胞可分泌Hpa，其與動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生和進展密切相關(guān)[12-13]。Hpa可通過降解內(nèi)皮細胞下的基底膜和細胞外基質(zhì)，促進內(nèi)皮細胞的遷移，同時釋放一系列血管生長因子，誘導(dǎo)血管生成及內(nèi)皮細胞的增殖，為血管生成創(chuàng)造條件[14-15]。Hpa參與人體動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生的研究較少，因此，本研究擬探討動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)Hpa及新生血管的表達。

1 對象與方法

1.1 對象

回顧性連續(xù)納入2014年12月至2017年12月首都醫(yī)科大學附屬復(fù)興醫(yī)院神經(jīng)外科接受頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)治療的頸內(nèi)動脈系統(tǒng)粥樣硬化性狹窄患者55例(動脈粥樣硬化組)，診斷符合頸動脈狹窄診治指南[16]，經(jīng)血管超聲、CT血管成像和(或)DSA等影像學方法證實。動脈粥樣硬化組中，男45例，女10例；年齡54～75歲，平均(65±9)歲；缺血性卒中47例，短暫性腦缺血發(fā)作8例；臨床表現(xiàn)為肢體無力18例、肢體麻木10例、吞咽困難5例、言語不清3例、視物模糊3例、口角歪斜3例、頭痛2例、頭暈19例、黑曚2例、失語2例；合并高血壓病20例，糖尿病13例，脂代謝異常18例。選擇同期北京大學醫(yī)學部病理學系行尸體解剖并明確無頸動脈粥樣硬化病變者15例(無動脈粥樣硬化組)，其中男12例，女3例；年齡16～58歲，中位年齡40(24，50)歲。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬復(fù)興醫(yī)院倫理委員會審查通過(2014FXHEC-KY069)，患者或其家屬均簽署了手術(shù)知情同意書。

1.2 納入及排除標準

1.2.1動脈粥樣硬化組納入標準：單側(cè)或雙側(cè)頸動脈粥樣硬化性狹窄；DSA結(jié)果示頸動脈狹窄率≥70%[16]；患者或家屬對頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)的風險知情并簽署了知情同意書。

1.2.2動脈粥樣硬化組排除標準：有嚴重的出血傾向；同側(cè)頸動脈系統(tǒng)多部位狹窄，遠端狹窄且手術(shù)無法達到；頸動脈支架術(shù)及切除術(shù)后再狹窄患者；合并顱內(nèi)動脈瘤并有破裂的可能；合并嚴重手術(shù)禁忌證；除外椎-基底動脈系統(tǒng)病變；合并其他惡性疾病，預(yù)期存活<1年者。

1.2.3無動脈粥樣硬化組納入標準：既往無動脈粥樣硬化病史；因車禍死亡，冰凍48 h～7 d行尸體解剖，死者家屬自愿同意采集死者頸動脈標本，并簽署了尸解知情同意書。

1.2.4無動脈粥樣硬化組排除標準：動脈粥樣硬化高危人群；死者家屬拒絕提供頸動脈標本者。

1.3 標本收集及判讀標準

頸動脈粥樣硬化斑塊剝離30 min內(nèi)進行取材。于動脈粥樣硬化病變最明顯處，根據(jù)斑塊形態(tài)及大小沿縱軸或橫軸方向切取0.2 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織，立即放入4%甲醛溶液中固定，固定24 h后進行石蠟包埋，以4 μm厚度切片，室溫保存。尸檢標本切片制作按常規(guī)方法進行石蠟包埋，以4 μm厚度切片，室溫保存。根據(jù)文獻[14-15]的組織病理學分型方法，篩選出結(jié)構(gòu)清楚的晚期動脈粥樣硬化斑塊(Ⅳ～Ⅵ型)作為動脈粥樣硬化組的研究石蠟組織樣本(共73個)。Ⅳ型指細胞外脂滴聚積成為較大的脂質(zhì)核心；Ⅴ型是在有較大脂質(zhì)核心的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)一個厚的纖維帽，纖維帽向管腔內(nèi)凸起，可細分為多種亞型，包括Ⅴa(存在多個脂質(zhì)核心和纖維結(jié)締組織)、Ⅴb(脂質(zhì)核心或病變的其他組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)鈣化)和Ⅴc(病變含有的脂質(zhì)很少，而含有纖維組織)；Ⅵ型是指上述病變出現(xiàn)出血、血腫等繼發(fā)性病理變化，其中Ⅵa為出現(xiàn)斑塊斷裂，Ⅵb為出現(xiàn)血腫，Ⅵc為出現(xiàn)血栓。根據(jù)Naghavi等[17]提出的形態(tài)學分型標準，在顯微鏡下，將動脈粥樣硬化斑塊組的73個石蠟組織樣本分為易損斑塊(42個)和移形斑塊(31個)；將顯微鏡下明確無動脈粥樣硬化病變者定義為正常動脈段標本(15個)。滿足以下1項以上特征即定義為易損斑塊，余為移形斑塊，無以下特征者為無動脈粥樣硬化病變。主要標準包括：(1)斑塊內(nèi)活動性炎性反應(yīng)；(2)脂質(zhì)核心超過斑塊體積的40%或脂質(zhì)核心較小但伴有纖維帽厚度在100 μm以下的斑塊；(3)內(nèi)皮細胞脫落伴表層血小板聚集；(4)裂隙斑塊與受損斑塊；(5)嚴重狹窄。次要標準包括：(1)淺表鈣化結(jié)節(jié)；(2)黃色斑塊；(3)斑塊內(nèi)出血；(4)內(nèi)皮功能異常；(5)正性重構(gòu)。

1.4 Hpa檢測試劑及方法

切片分別行常規(guī)蘇木素-伊紅、免疫組織化學(通用型二步法)及免疫熒光染色。兔抗人Hpa單克隆抗體 (sc-25825)購自美國Santa Cruz公司，小鼠抗人CD34單克隆抗體購自美國Abcam公司；山羊抗小鼠IgG抗體-辣根過氧化物酶多聚體二抗、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚熒光發(fā)光液、熒光二抗Cy5標記的山羊抗小鼠IgG(紅色熒光染料)、Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠IgG(綠色熒光染料)及封片劑均購自美國Life Technologies公司。熒光染料聚乙二醇辛基苯基醚購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

免疫組織化學采用通用型二步法，均嚴格按試劑盒操作步驟進行。Hpa、CD34單克隆抗體工作濃度分別為1∶200和1∶50，每次染色均設(shè)對照作為染色質(zhì)量控制標準，用已知陽性頸動脈粥樣硬化組織切片作陽性對照，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液取代一抗作陰性對照。通用型二步法染色，Hpa陽性表達為細胞質(zhì)及細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。光學顯微鏡下觀察所有樣本切片免疫組織化學染色情況，記錄各切片染色結(jié)果；分別統(tǒng)計易損斑塊、移形斑塊、無動脈粥樣硬化組樣本切片Hpa、CD34、免疫組織化學染色陽性例數(shù)。

免疫熒光染色均嚴格按試劑盒操作步驟進行，Hpa、CD34單克隆抗體工作濃度分別為1∶500和1∶50，每次染色均設(shè)對照作為染色質(zhì)量控制標準，熒光顯微鏡觀察。Hpa抗體免疫熒光染色陽性為細胞質(zhì)及細胞膜內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光物質(zhì)，CD34抗體免疫熒光染色陽性為在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見呈綠色熒光染色的新生微血管內(nèi)皮細胞。分別記錄易損斑塊、移形斑塊及正常頸動脈段樣本切片Hpa、CD34免疫熒光染色陽性例數(shù)。新生微血管判斷標準：單個或成叢陽性血管內(nèi)皮細胞，不管成腔與否均視為單個微血管，但管徑>8個紅細胞或有肌層的血管不記為新生微血管[14]。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Hpa在頸動脈斑塊組織及正常動脈組織中的表達

圖1為采集的頸動脈粥樣硬化斑塊大體標本。蘇木素-伊紅染色結(jié)果顯示，頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見巨噬細胞浸潤，其中有大量藍染的巨噬細胞核(圖2a)；免疫組織化學染色結(jié)果顯示，頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見Hpa呈陽性表達，棕色顆粒主要位于巨噬細胞細胞質(zhì)內(nèi)(圖2b)；抗體免疫熒光染色結(jié)果顯示，斑塊內(nèi)Hpa陽性表達呈紅色熒光物質(zhì)，細胞核呈藍色(圖2c，2d)，在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見呈綠色熒光染色的新生微血管內(nèi)皮細胞(圖2e)。正常動脈組織中無Hpa表達(圖3)。

2.2 不同形態(tài)頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)Hpa陽性表達率比較

頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)Hpa陽性表達率為64.4%(47/73)。易損斑塊內(nèi)Hpa陽性表達率高于移形斑塊，差異有統(tǒng)計學意義[92.9%(39/42)比25.8%(8/31)，χ2=34.968，P<0.01]。

2.3 不同形態(tài)頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管陽性表達率比較

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見數(shù)個黃染血管內(nèi)皮細胞(圖4a)，陰性表達如圖4b。易損斑塊內(nèi)新生血管陽性表達率高于移形斑塊，差異有統(tǒng)計學意義[95.2%(40/42)比22.6%(7/31)，χ2=41.060，P<0.01]。

2.4 頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)Hpa與新生血管表達的組織學定位分析結(jié)果

對73個頸動脈粥樣硬化斑塊組織標本分別進行蘇木素-伊紅和免疫組織化學染色，結(jié)果顯示，Hpa陽性表達主要位于頸動脈粥樣硬化斑塊的纖維帽及肩部(圖5a，5b)，并且Hpa分布多的區(qū)域，新生血管分布也較多(圖5c，5d)。

3 討論

研究證實，動脈粥樣硬化易損斑塊可導(dǎo)致臨床缺血和梗死事件[18]。關(guān)于動脈粥樣硬化動物模型及冠狀動脈粥樣硬化性狹窄尸檢的研究表明，Hpa與動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)[13，19]。

硫酸乙酰肝素蛋白多糖是細胞外基質(zhì)中重要的多聚糖成分[20]，其為內(nèi)皮細胞的衍生產(chǎn)物，可抑制血管平滑肌細胞增殖、損傷后內(nèi)膜新生反應(yīng)，其由一個核心蛋白和數(shù)個與之共價連接的線性硫酸乙酰肝素側(cè)鏈組成。Hpa能降解細胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖，特異性識別硫酸乙酰肝素側(cè)鏈上的特異性位點，將硫酸乙酰肝素裂解為10～20個糖單位大小的短糖鏈，并釋放結(jié)合在硫酸乙酰肝素側(cè)鏈上的生物活性分子進而發(fā)揮一系列病理生理作用[21-22]。

Hpa在正常組織中很少表達，主要限于胚胎、角蛋白細胞、血小板和活化的免疫細胞[23]。病理狀態(tài)下，尤其在腫瘤細胞中Hpa的表達顯著上調(diào)，其在腫瘤血管新生和轉(zhuǎn)移中具有多重重要作用[23-24]，但其在動脈粥樣硬化病變中的作用機制研究尚少[25-26]。

Baker等[19]對收集的豬冠狀動脈粥樣硬化斑塊進行免疫組織化學染色分析，結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化斑塊從輕度病變發(fā)展為薄纖維帽易損斑塊過程中，Hpa蛋白水平及其活性逐漸增加。Blich等[13]通過免疫組織化學染色方法檢測尸解人體冠狀動脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊、易損斑塊和正常對照動脈組中Hpa的表達，結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊和正常對照動脈中的Hpa染色較弱，而動脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)Hpa染色非常明顯。本研究中，我們采用頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)患者的頸動脈粥樣硬化斑塊為研究標本，以尸解獲得的正常動脈段作為對照，分析動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)Hpa的表達，免疫熒光染色結(jié)果顯示，Hpa陽性表達率為64.4%(47/73)，在正常動脈段內(nèi)未見Hpa表達；與移形斑塊相比，易損斑塊內(nèi)Hpa陽性表達率更高[92.9%(39/42)比25.8%(8/31)，P<0.01]，與文獻報道結(jié)果相符。

動脈粥樣硬化斑塊進展過程是從早期病理性內(nèi)膜增厚逐漸發(fā)展至薄纖維帽易損斑塊，該過程被認為是巨噬細胞浸潤的結(jié)果[12]。早期動脈粥樣硬化斑塊纖維帽較厚，當由巨噬細胞釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶和平滑肌細胞出現(xiàn)凋亡時，纖維帽開始變薄，動脈粥樣硬化斑塊進而轉(zhuǎn)變?yōu)橐讚p斑塊[27-29]，在該過程中炎性反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。本研究動脈粥樣硬化斑塊免疫組織化學染色結(jié)果顯示，Hpa陽性棕色顆粒主要位于巨噬細胞細胞質(zhì)內(nèi)，可見隨著炎性反應(yīng)的進展Hpa表達增多[30]。

病理組織學研究表明，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)病理性血管新生的存在和程度與斑塊的破裂及臨床腦血管事件相關(guān)，其在動脈粥樣硬化易損斑塊破裂的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。首先，病理性血管新生是在原有的毛細血管基礎(chǔ)上，通過血管內(nèi)皮細胞的分裂、增殖與遷移，從先前存在的血管處以芽生或套疊的方式擴展延伸形成新的毛細血管網(wǎng)[31]。血管新生過程中產(chǎn)生的幼稚血管極易破裂，進而導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血，而動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出血是導(dǎo)致其變?yōu)楦呶Ｒ讚p斑塊的重要原因[32]。其次，斑塊內(nèi)幼稚血管可向斑塊中心溢漏紅細胞和炎性介質(zhì)，而來自于紅細胞膜的游離膽固醇堆積可潛在性增加斑塊壞死中心的大小，并且觸發(fā)加速斑塊不穩(wěn)定發(fā)展的事件鏈。同時，紅細胞膜富含磷脂、游離膽固醇和游離血紅蛋白，其均為活性氧的主要來源，可致氧化損傷進而引起壞死中心擴大和炎性細胞浸潤。當斑塊增大，隨即出現(xiàn)缺氧及炎性細胞浸潤，活化的T細胞、巨噬細胞和肥大細胞可產(chǎn)生前血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和白細胞介素8，其均為斑塊內(nèi)病理性血管新生所需[30]。因此，隨著斑塊內(nèi)病理性新生血管的增多，進一步可使斑塊內(nèi)出血風險增加，高危易損斑塊形成，而致動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)不穩(wěn)定事件鏈循環(huán)往復(fù)地發(fā)展。也有研究表明，Hpa促進血管新生的作用是通過降解內(nèi)皮細胞下的基底膜和細胞外基質(zhì)，促進內(nèi)皮細胞的遷移，同時，釋放與硫酸乙酰肝素結(jié)合的堿性成纖維細胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子，誘導(dǎo)血管生成，而被剪切的硫酸乙酰肝素片斷又可促進堿性成纖維細胞生長因子與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[33]。Hpa調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子基因的表達是通過激活Src家族所介導(dǎo)[34]，還可加強蛋白激酶B信號傳導(dǎo)途徑，激活鄰近內(nèi)皮細胞，為血管生成創(chuàng)造條件[35]。

在我們前期的研究中，采用超聲造影技術(shù)在體觀察頸動脈血管壁外膜滋養(yǎng)血管及動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管情況，發(fā)現(xiàn)癥狀性腦梗死組患者頸動脈粥樣硬化斑塊的肩部新生血管密度較高[5-7]。本研究蘇木素-伊紅和免疫組織化學染色結(jié)果均顯示，新生血管主要位于動脈粥樣硬化斑塊的纖維帽及肩部，與我們前期的超聲造影結(jié)果相符。本研究動脈粥樣硬化斑塊免疫組織化學雙染色結(jié)果顯示，斑塊內(nèi)Hpa陽性表達部位與血管新生部位具有共區(qū)域性，提示二者可能存在一定的相關(guān)性。可見，Hpa直接或間接作用于上述生長因子，從而參與血管新生過程。本研究中，易損斑塊內(nèi)新生血管陽性表達率高于移形斑塊[95.2%(40/42)比22.6%(7/31)，P<0.01]，提示隨著斑塊內(nèi)Hpa表達增多，血管新生增強，促使斑塊從穩(wěn)定向不穩(wěn)定逐漸進展[36]。

綜述所述，頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見Hpa陽性表達，且易損斑塊內(nèi)Hpa陽性表達率高于移形斑塊，提示Hpa在動脈粥樣硬化病變進展過程中具有一定的作用；頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見新生血管，且易損斑塊新生血管表達高于移形斑塊，提示血管新生參與動脈粥樣硬化易損斑塊形成的過程；動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)Hpa表達與新生血管具有共區(qū)域性，提示二者關(guān)系密切。本研究為單中心研究，樣本量的積累有限，研究結(jié)果有待于大樣本數(shù)據(jù)進行驗證。由于動脈粥樣硬化斑塊形成和進展的具體作用機制非常復(fù)雜，Hpa的表達與動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管間相互作用、共同調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化斑塊從穩(wěn)定向不穩(wěn)定進展的具體機制尚有待于進一步探討。

志謝感謝首都醫(yī)科大學三博腦科醫(yī)院病理科齊雪玲醫(yī)師、北京門頭溝區(qū)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科朱倩倩醫(yī)師、首都醫(yī)科大學附屬復(fù)興醫(yī)院高壓氧科張文靜醫(yī)師的大力支持與幫助