液相色譜串聯(lián)質譜法測定不同茶葉中的氯噻啉

徐瀟穎 羅金文 劉柱 金紹強 朱炳祺

摘要[目的]建立茶葉中氯噻啉殘留量的液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法。[方法]茶葉樣品經乙腈提取，提取液通過TPT固相萃取柱凈化后進行儀器分析。對樣品提取、凈化及儀器條件參數(shù)進行優(yōu)化。[結果]氯噻啉在1 ～500 ng/mL線性關系良好（R2 >0.999）;檢出限為1.5 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg;在0.005、0.010、0.050和3.000 mg/kg條件下，回收率可達88.8%～109.1%，相對標準偏差（RSD）≤54%（n=6）。[結論]通過方法學考察和實驗室間驗證表明，該方法靈敏、準確，適用于各種茶葉中氯噻啉殘留量的定性和定量分析。

關鍵詞 氯噻啉;液相色譜-串聯(lián)質譜;茶葉;固相萃取

中圖分類號 TS207.5+3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0201-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.055

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Abstract[Objective]The research aimed to? establish a liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the determination of chlorothiazide residues in tea.[Method]Tea sample was extracted by acetonitrile and purified by TPT solid phase extraction before instrumental analysis. This study optimized extraction method， clean up method and instrumental parameters.[Result]The linear relationship of chlorothiazide in 1-500 ng/mL is good （R2 > 0.999）;the limit of detection （LOD） and limit of quantification （LOQ） were 1.5 μg/kg and 5.0 μg/kg， respectively. The recoveries were 88.8%-109.1% with relative standard deviations （RSD） lower than 5.4%（n=6）.[Conclusion]Based on the results of method validation and interlaboratory validation， this method has proven to be sensitive， accurate and suitable for the qualitative and quantitative determination of imidaclothiz residue in tea.

Key words Imidaclothiz;Liquid chromatographytandem mass spectrometry（LCMS/MS）;Tea;Solid phase extraction

基金項目 國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1603400）。

作者簡介 徐瀟穎（1989—），女，浙江金華人，工程師，碩士，從事食品質量安全研究。*通信作者，工程師，博士，從事食品質量安全控制研究。

收稿日期 2019-03-05

氯噻啉是我國自主研發(fā)的一種新型煙堿類殺蟲劑，它通過作用于煙酸乙酰膽堿酯酶受體以阻滯害蟲的中樞神經正常傳導，其不僅可用于防治吮吸式口器害蟲，同時對鞘翅目、雙翅目和鱗翅目害蟲也有效，尤其對水稻二化螟、三化螟毒力比其他煙堿類殺蟲劑高，可以廣泛用于水稻、小麥、蔬菜、煙草、棉花、果樹、茶樹等作物，具有高效、光譜、低毒等優(yōu)點[1-2]。由于氯噻啉對哺乳動物毒性較低，被國家工信部列為“十一五”高度農藥轉產和替代項目，具有一定的應用前景[3]。

我國最新修訂的GB 2763—2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規(guī)定了茶葉中氯噻啉的最大殘留量為3.0 mg/kg，但國內尚未制定關于茶葉中氯噻啉農藥殘留量檢測的標準方法。目前已報道的關于氯噻啉的檢測方法主要有液相色譜法[4]、酶聯(lián)免疫法[5]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[6]和氣相色譜-質譜法[7]。施海燕等[8]利用生物素-鏈霉親和素的高親和作用，研制了一種簡便、快速的氯噻啉膠體金增強免疫層析分析方法，但該方法靈敏度差，容易出現(xiàn)假陽性。賀敏等[4]用二氯甲烷提取水稻樣品中的氯噻啉，提取液濃縮后通過佛羅里硅土固相萃取柱進行凈化，使用液相色譜法檢測。楊東冬等[9]制備分子印跡固相萃取，使用液相色譜法測定大米中的氯噻啉，回收率在81.2%～97.5%。劉松南等[6]采用QuEChERS前處理方法，使用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定茶葉中氯噻啉。相較于其他檢測方法，液相色譜-串聯(lián)質譜法具有高選擇性、高靈敏度的特點，能有效檢測目標化合物。但是液相色譜-串聯(lián)質譜法在定量分析過程中容易受到基質的影響，不僅污染儀器，而且影響分析檢測的準確性。在日常檢測過程中，茶葉基質復雜，較谷物類食品和水果類食品含有更多的色素等基質干擾物，因此需要有效的前處理方法以保證檢驗結果的準確性。

針對在農業(yè)生產過程中氯噻啉使用的推廣和有效檢測方法缺失的矛盾，該研究對茶葉中氯噻啉的前處理方法及儀器測定條件進行優(yōu)化，并對建立的方法進行方法學考察和實驗室間驗證，建立準確可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-MS 8050液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）（日本Shimadzu公司）。Mettler XPE 205分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。Multi-Prep自動均質器（美國PRO Scientific公司）。離心機（美國Thermo Fisher公司）。旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA公司）。

1.2 試材

乙腈（質譜純）、二氯甲烷（色譜純）購自德國Merck公司;甲苯（色譜純）購自美國TEDIA公司;甲酸（質譜純）購自美國Fisher Scientific公司。氯化鈉（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司。氯噻啉標準品購自農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，濃度為100 μg/mL，CAS號為105843-36-5;Cleanert TPT固相萃取柱（1 g，6 mL）、N-丙基乙二胺（PSA）由天津博納艾杰爾公司提供;試驗用水均為經過Milli-Q系統(tǒng)凈化后的去離子水。

1.3 試驗條件

1.3.1 標準溶液的配制。

氯噻啉標準品用乙腈稀釋成濃度為5 μg/mL的標準品中間液。準確移取中間液，用經過前處理的空白基質溶液稀釋配制成濃度為1、20、50、100、200、500 ng/mL的基質標準曲線工作液。

1.3.2 液相色譜-串聯(lián)質譜方法。

離子源：電噴霧離子源（ESI）。掃描方式：正離子掃描。毛細管電壓4 kV。毛細管溫度300 ℃。霧化氣：氮氣，3 L/min。碰撞氣：氬氣。檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）。質譜參數(shù)見表1。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）;柱溫30 ℃;進樣量1 mL;流動相A：0.1%甲酸水，B：乙腈;流速0.25 mL/min;梯度洗脫程序：0～3.0 min，15% B;3.0～6.0 min，15% B～75% B;6.0～8.0 min 75% B;8.0～8.1 min，75% B～15% B;81～10.0 min，15% B。

1.3.3 樣品處理。

1.3.3.1 提取。

稱取2 g粉碎均勻樣品（精確至0.001 g），置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，渦旋振蕩0.5 min，在高速組織搗碎機上以15 000 r/min勻質1 min后4 000 r/min離心5 min，將上清液移入梨形燒瓶中。殘渣再用15 mL乙腈，重復上述提取過程一次，合并所有上清液，在40 ℃水浴中減壓旋轉濃縮至2～3 mL。

1.3.3.2 凈化。

在TPT固相萃取柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉并預先用5 mL乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）活化固相萃取柱。將濃縮提取液轉移至固相萃取柱上，再用20 mL乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）洗脫，收集洗脫液于梨形燒瓶中，在40 ℃水浴中減壓旋轉濃縮至近干，氮吹至干。用2.0 mL乙腈溶解殘渣，經0.22 μm濾膜過濾后，供液相色譜-質譜測定。對于含量較高的樣品，用空白基質溶液稀釋乙腈復溶液后，供儀器測定。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

在液相色譜串聯(lián)質譜儀上氯噻啉的檢測模式為正離子模式，在方法開發(fā)過程中，依次考察了甲酸銨、乙酸銨和是否含有甲酸等分別作為水相時氯噻啉的響應強弱，結果顯示，氯噻啉的響應由強到弱依次為水>0.1%甲酸水溶液>5 mmol/L甲酸銨水溶液>含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液>含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液>5 mmol/L乙酸銨水溶液。盡管添加甲酸會抑制化合物的響應，但是試驗結果顯示純水做流動相時容易產生峰前移并影響峰形。此外在乙腈中添加0.1%的甲酸對目標物的響應值未有顯著提高。因此最終選擇0.1%甲酸水-乙腈作為此次分析的流動相體系，采用梯度洗脫的方法可以將殘留在色譜柱上化合物充分洗脫。

在色譜柱的選擇中，分別考察了安捷倫Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、安捷倫Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）、安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Thermo Hypersil GOLD（2.1 mm×100 mm，3 μm）4種不同型號和規(guī)格的反相色譜柱，采用上述選定的流動相條件進行分離，結果表明絕大多數(shù)的C18色譜柱對氯噻啉均有保留，根據(jù)色譜柱長短適當調整流動相條件均可滿足試驗要求。該研究選擇安捷倫Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），色譜圖見圖1。

試驗過程中采用自動優(yōu)化功能對質譜系統(tǒng)各參數(shù)進行快速優(yōu)化，確定特征母離子和子離子。試驗得到母離子為m/z 262.0，二級碎片離子主要有m/z 181.05、122.10、123.05等。進一步優(yōu)化二級碎片離子的碰撞電壓等參數(shù)，根據(jù)響應強度和特異性，選取 m/z 262.00/181.05為定量離子，m/z 262.00/122.10為定性離子，優(yōu)化得到碰撞電壓分別為15和27 V。

2.2 提取條件的選擇

氯噻啉易溶于大部分有機溶劑，乙腈、二氯甲烷、甲醇、丙酮均為良好的提取溶劑，試驗結果顯示采用上述溶劑進行提取后，所得回收率均能達到80%以上。相比于丙酮、二氯甲烷等，乙腈作為提取溶劑時，保證較好的提取效果的同時可以減少基質干擾物的溶出[10]。此外在提取過程中，部分方法會采用加水對茶葉進行浸泡后再進行乙腈提取。如圖2所示，經過水浸泡后的茶葉樣品提取液在凈化后顏色明顯深于未經水浸泡的茶葉樣品。水的浸泡過程容易將茶葉的水溶性色素提取出來，從而帶來更多基質干擾[11]。因此，在此方法中選擇乙腈直接提取茶葉樣品。

在提取方式上，通常有超聲、渦旋、振搖和均質的方式，均質可將樣品基質中細胞等組織結構破壞并充分地混合均勻[12]，為了保證能有效地將樣品中的待測目標物提取到溶劑中，故采用均質方法進行提取。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

在檢測過程中，QuEChERS方法[13]有著操作便捷、適用范圍廣的特點，但多用于蔬菜水果的凈化。當基質變成茶葉、韭菜等樣品時，PSA吸附劑對色素凈化的效果有限，TPT固相萃取內填復合吸附材料，在去除色素等基質干擾物上有更好的效果。在研究中發(fā)現(xiàn)TPT固相萃取柱對氯噻啉有一定的吸附作用，使用乙腈不能有效地將目標物洗脫下來，導致回收率低于80%。因此凈化過程中采用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）作為洗脫液以有效洗脫目標物，此外試驗對比了乙腈-甲苯（體積比3∶1）混合溶液作為洗脫溶液時的洗脫效果。盡管試驗結果顯示使用2種洗脫液回收率均達到90%以上，但如圖2所示，使用乙腈-甲苯（體積比3∶1）作為洗脫液時得到的樣品溶液顏色深于使用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）作為洗脫液時得到的樣品。另一份試驗采用QuEChERS凈化方法，參考AOAC 2007.01，茶葉樣品定量加入10 mL乙腈提取液，在每毫升乙腈提取液中加入100 mg的PSA粉末進行凈化。圖2試驗結果顯示經過該QuEChERS方法得到的樣品溶液顏色明顯深于使用TPT固相萃取柱方法得到的樣品溶液。因此，在該方法中選擇使用TPT固相萃取柱凈化方法并使用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）作為洗脫溶劑，可以較好地去除色素雜質。

47卷15期 徐瀟穎等 液相色譜串聯(lián)質譜法測定不同茶葉中的氯噻啉

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線的建立。

依據(jù)“1.3.1”配制基質標準曲線工作液并上機測試，以響應值（Y）與目標物濃度（X）建立線性擬合方程。經驗證，在1～500 ng/mL以不同基質配制的標準曲線線性關系良好，決定系數(shù)R2不小于0.999（表2）。

2.4.2 精密度、回收率及檢出限。

在陰性茶葉樣品中加入低、中、高、限量值4個不同濃度的標準工作溶液進行加標回收與精密度測試，結果見表3。數(shù)據(jù)表明，4個加標水平下的回收率為88.8%～109.1%，6次平行測試的相對標準偏差為1.5%～5.4%。

在空白茶葉樣品中加標并進行檢測，當定量離子和定性離子色譜峰的信噪比（S/N）≥3時，樣品中對應的氯噻啉含量為1.5 μg/kg，為該方法的檢出限。當定量離子色譜峰S/N≥10時，樣品中氯噻啉的含量為 5.0 μg/kg，為該方法的定量限。

2.4.3 基質效應。

基質效應對質譜的離子化效果產生影響，從而對結果產生影響，因此為重要評價依據(jù)之一[14]。通常以基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線的斜率比值，作為基質效應（ME），當ME>1.1時為基質增強效應，而ME<0.9時為基質抑制效應[15]。分別將紅茶、綠茶、烏龍茶和茉莉花茶樣品基質匹配標準曲線與乙腈配制的校正曲線進行比較，試驗結果顯示在4種茶葉基質中，基質效應均為0.88～0.92。為保證結果準確性，試驗過程中采用基質校正曲線對樣品進行校正。

2.5 實驗室間方法驗證

實驗室之間不同儀器條件和不同實驗人員的操作會對試驗結果產生一定影響，為了保證方法的可重復性，選取紅茶、綠茶、茉莉花茶樣品在另外5家實驗室進行方法驗證，驗證內容包括靈敏度、校正曲線、線性范圍、回收率試驗。結果顯示，在1～500 ng/mL，不同基質標準曲線的線性關系良好，R2均不小于0.999。在1.5和5.0 μg/kg濃度下滿足S/N≥3和S/N≥10。在 0.005、0010、0.050 mg/kg 3個加標濃度下加標回收率均在70%～120%，RSD≤7.9%。

2.6 實際樣品測試

將該研究建立的方法，應用于市場上流通的預包裝茶葉的檢測，其中綠茶15批、紅茶9批、烏龍茶6批、花茶4批，均未檢出氯噻啉。

3 結論

該研究結合了TPT固相萃取的前處理方法和液相色譜串聯(lián)質譜儀器分析方法，建立了茶葉中靈敏、準確的氯噻啉測定方法。試驗結果顯示茶葉樣品直接使用乙腈提取，通過TPT固相萃取柱方法并使用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）為洗脫液，能保證回收率的同時達到較好的凈化效果。方法學驗證結果和實驗室間驗證結果均滿足GB/T 27404—2008 《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》的相關規(guī)定，為不同類型的茶葉樣品中氯噻啉殘留量的定性和定量分析提供有效的檢測手段。

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