化合物DXL-A-22抗神經(jīng)病理性疼痛作用及機制研究

梁瑩瑩，王 欣，劉 芹，王 丁，杜小雷，李潤濤，蔣益民，葉 加

(北京大學(xué) 1. 藥學(xué)院分子與細(xì)胞藥理學(xué)系、 2. 藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系、 3. 醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心，北京 100191)

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病直接造成的疼痛，其基本特征為自發(fā)性疼痛、觸摸痛及痛覺過敏。流行病學(xué)研究顯示，神經(jīng)病理性疼痛的患病率約在6.9%～10%[1]。全世界數(shù)以百萬計的患者遭受神經(jīng)病理性疼痛的痛苦，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物是以季銨鹽類煙堿受體激動劑1，1二甲基4苯基哌嗪碘化物(1，1-dimethy1-4-phenylpiperazineiodide,DMPP)和抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺為基礎(chǔ)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成的一類具有知識產(chǎn)權(quán)的新型化合物，研究顯示[2-3]，其有明顯的緩解急性疼痛和炎癥作用。在此基礎(chǔ)上，對有效化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步優(yōu)化、改進(jìn)，得到螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22(Fig 1)。目前尚未有關(guān)于螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22抗神經(jīng)病理性疼痛作用及機制的報道。本文擬研究化合物DXL-A-22抗神經(jīng)病理性疼痛作用，探討其可能的抗神經(jīng)病理性疼痛作用機制，為研發(fā)高效低毒的抗神經(jīng)病理性疼痛藥物提供實驗依據(jù)。

Fig 1 Chemical structure of spirocyclopiperazinium salt compound DXL-A-22

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠，體質(zhì)量(200～250) g，♀♂各半，由北京大學(xué)實驗動物部提供，許可證號：SCXK(京)2016-0010；動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：溫度(22±0.5)℃，相對濕度(55±5)%，人工光照，12 h明暗周期，自由飲食、飲水。所有實驗符合國際疼痛研究協(xié)會研究與倫理問題委員會的標(biāo)準(zhǔn)，均采用盲法測定。

1.2 藥物與試劑螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22(純度95%以上，由李潤濤教授課題組合成提供)；加巴噴丁(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：20141028)；RIPA裂解液(P0013B，北京碧云天生物科技有限公司)；蛋白酶抑制劑(P1265-1)、蛋白磷酸酶抑制劑(P1260-1)、BCA蛋白檢測試劑盒(P1511-1)，均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液(ZS-20480)、β-actin抗體(TA-09)，購自北京中杉金橋生物科技有限公司；磷酸化鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱα(phospho-calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱα，p-CaMKⅡα)，(ab124880)、CaMKⅡα(ab92332)，購自美國Abcam公司；抗體磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phospho-cAMP response element-binding protein，p-CREB，9198S)、CREB(9197S)、磷酸化JAK2(phospho-Janus kinase 2，p-JAK2，3776S)、JAK2(3230S)、磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(phospho-signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3，9145S)、STAT3(4904S)，均購自美國Cell Signaling Technology；TRIzol試劑(MN012)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(4368814)、SYBR Select Master Mix(4472908)，均購自美國Invitrogen公司；Go Taq qPCR Master Mix(A6001，美國Promega)。

1.3 儀器IITC 2390型Von Frey電子測痛儀(美國IITC公司)；LE 7406熱痛反應(yīng)測量儀(西班牙Panlab公司)；3K15離心機(美國Sigma公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、iMark酶標(biāo)儀、ChemiDoc XRS System高靈敏化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；9700 PCR擴增儀(美國Applied Biosystem公司)；MX3005P熒光實時定量分析系統(tǒng)(美國安捷倫公司)。

1.4 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)模型坐骨神經(jīng)CCI模型參考Bennett等[4]1988年描述的模型稍作改動。具體操作如下：大鼠用戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1，i.p.)麻醉后，大腿右邊手術(shù)部位去毛，俯臥位固定，沿大鼠右后肢股骨中部縱向切口，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)分叉處近端用4-0絲線松結(jié)扎4次，每次間隔約1 mm，松緊程度以觀察到右后腿稍微抖動為宜。結(jié)扎后依次縫合肌肉和皮膚，假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，但不結(jié)扎。通過觀察術(shù)后大鼠術(shù)側(cè)后肢是否出現(xiàn)足趾并攏，輕微外翻，經(jīng)常處于騰空狀態(tài)，是否有舔、咬或激烈抖動手術(shù)側(cè)足跖，以及測定大鼠機械刺激縮足反應(yīng)閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱刺激縮足潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)，判斷造模是否成功。

術(shù)前測定大鼠機械刺激縮足反應(yīng)閾值和熱刺激縮足潛伏期，以此分組，每組8只：假手術(shù)組(雙蒸水，distilled water，DDW，i.g)，溶媒組(DDW，i.g.)，DXL-A-22組(2、1、0.5 mg·kg-1，i.g.)和加巴噴丁組(gabapetin，100 mg·kg-1，i.g.)，術(shù)后d 1給藥前測痛閾，剔除模型異常的動物，確認(rèn)造模成功后開始給藥[5]。從術(shù)后d 1開始每天灌胃給予大鼠DDW，DXL-A-22或加巴噴丁。陽性對照加巴噴丁是目前臨床常用的治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物，同時也是國內(nèi)外文獻(xiàn)常用的陽性對照藥物，劑量參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，并通過預(yù)實驗確認(rèn)[6]。

1.4.1大鼠MWT的測定 大鼠MWT用Von Frey電子測痛儀測定。術(shù)前1 d和術(shù)后1、3、5、7、9、11、14 d灌胃給予DDW、DXL-A-22或加巴噴丁后2 h測定。將大鼠置于透明有機玻璃箱(底部是空隙20 mm2的鐵絲網(wǎng))中適應(yīng)環(huán)境30 min，待大鼠無探索動作后，用Von Frey電子測痛儀探針刺激大鼠術(shù)側(cè)足跖位置，測痛儀自動記錄引起大鼠縮足反應(yīng)的最大作用力即MWT。大鼠機械刺激痛閾提高率%(the percentage of pain threshold elevation，PTE%)用下列公式計算：PTE/%=[(實驗組MWT-溶媒組MWT)/溶媒組MWT]×100。

1.4.2大鼠PWL的測定 用熱板法測定大鼠PWL。術(shù)前1 d和術(shù)后1、3、5、7、9、11、14 d灌胃給予DDW、DXL-A-22或加巴噴丁后2 h測定。熱板溫度為50.5 ℃，從大鼠置于熱板儀開始計時，到大鼠出現(xiàn)抖、舔足反應(yīng)停止計時，此時間即為大鼠PWL。熱板切斷時間為14 s，最大鎮(zhèn)痛百分率%(the percentage of maximal possible effect，MPE%)用下列公式計算：MPE/%=[(實驗組PWL-溶媒組PWL)/(切斷時間-溶媒組PWL)]×100。

1.5 Western blot大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(DDW，i.g)、溶媒組(DDW，i.g.)和DXL-A-22組(2 mg·kg-1，i.g.)，每組6只。坐骨神經(jīng)結(jié)扎后，每天給予DDW或化合物DXL-A-22。CCI術(shù)后d 7，給予DDW或化合物DXL-A-22 2 h后，大鼠用乙醚麻醉，脫頸處死，提取損傷側(cè)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)。提取的DRG組織用9倍體積的RIPA裂解液裂解，研磨后的溶解產(chǎn)物于4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清。用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。上清加loading buffer，95 ℃高溫變性5 min，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆?。采用SDS-PAGE膠分離蛋白樣品，恒壓電泳。以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，恒流電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜后將目的蛋白條帶用50 g·L-1脫脂奶粉封閉，搖床室溫1 h，然后孵育一抗p-CaMKⅡα、CaMKⅡα、p-CREB、CREB、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin，搖床4 ℃孵育過夜。PVDF膜在TBST封閉洗滌液中洗3次，每次10 min。用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST封閉洗滌液洗3次，每次10 min。加ECL發(fā)光劑，用高靈敏化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。以Quantity One軟件計算目的蛋白條帶的灰度值。化合物DXL-A-22對蛋白表達(dá)的抑制率%用下式計算：抑制率/%=[(溶媒組蛋白表達(dá)量-實驗組蛋白表達(dá)量)/溶媒組蛋白表達(dá)量]×100。

1.6 qPCR動物分組與組織提取同“1.5”。取DRG和脊髓加TRIzol試劑，充分研磨，勻漿后轉(zhuǎn)至EP管，室溫5 min。加氯仿，震蕩15 s，顛倒混勻10下，充分混勻后，室溫放置3 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。取上層水相于EP管中，加異丙醇，顛倒混勻，室溫10 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。棄上清，得白色沉淀。加乙醇，吹打混勻，4 ℃、7 500×g離心5 min。棄上清，重復(fù)上一步驟。得白色沉淀，干燥10 min，加無核酸酶的水，金屬浴，60 ℃，15 min，即得mRNA溶液。用紫外分光光度計法測溶液在260 nm處的吸光度，得mRNA溶液濃度。根據(jù)mRNA濃度，取2 μg mRNA。cDNA的合成使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，通過PCR擴增儀完成。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃，10 min；37 ℃，120 min ；85 ℃，5 min。得cDNA分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆?。實時定量PCR通過熒光實時定量分析系統(tǒng)完成反應(yīng)過程。實時定量PCR反應(yīng)條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；(95 ℃，15 s；58 ℃，15 s；72 ℃，1 min)40個循環(huán)。引物序列見Tab 1。通過循環(huán)擴增數(shù)(2-ΔΔCT)方法計算?；衔顳XL-A-22對TNF-α、c-Fos mRNA表達(dá)的抑制率按下式計算：抑制率/%=[(溶媒組2-ΔΔCT值-實驗組2-ΔΔCT值)/溶媒組2-ΔΔCT值]×100。

Tab 1 PCR primer sequence

1.7 急性毒性試驗急性毒性試驗根據(jù)經(jīng)濟合作和發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)指導(dǎo)方案第423條建立[7]。小鼠(n=10)灌胃給予化合物DXL-A-22(1 000 mg·kg-1，i.g.)，觀察小鼠在72 h內(nèi)(每3 h觀察1次)的行為，自主活動，任何致命性，殺傷力的狀態(tài)或死亡現(xiàn)象，共觀察14 d。

2 結(jié)果

2.1 化合物DXL-A-22抗大鼠神經(jīng)病理性疼痛作用

2.1.1化合物DXL-A-22對CCI大鼠MWT的影響 如Fig 2所示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后1～14 d，溶媒組大鼠術(shù)側(cè)MWT與假手術(shù)組比較明顯降低(P<0.01)?；衔顳XL-A-22(2、1、0.5 mg·kg-1，i.g.)劑量依賴性提高M(jìn)WT，與溶媒組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。術(shù)后1、3、5、7、9、11、14 d，DXL-A-22大劑量組痛閾提高率(PTE%)分別為58%、80%、95%、108%、91%、95%和97%，中劑量組PTE%分別為40%、59%、69%、86%、63%、60%和68%，小劑量組PTE%分別為35%、41%、57%、71%、54%、53%和58%，陽性對照加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)PTE%分別為66%、83%、98%、118%、95%、96%和103%。大劑量化合物DXL-A-22的痛閾提高率與加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)比較差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 2 Effect of DXL-A-22 on mechanical withdrawal threshold

2.1.2化合物DXL-A-22對CCI大鼠PWL的影響 如Fig 3所示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后1～14 d，溶媒組大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWL)與假手術(shù)組比較明顯降低(P<0.01)?；衔顳XL-A-22(2，1，0.5 mg·kg-1，i.g.)劑量依賴性提高大鼠PWL，與溶媒組比較有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。術(shù)后1、3、5、7、9、11、14 d，DXL-A-22大劑量組最大鎮(zhèn)痛百分率(MPE%)分別為38%、57%、62%、77%、68%、63%和65%，中劑量組MPE%分別為29%、44%、47%、56%、54%、53%和50%，小劑量組MPE%分別為24%、38%、40%、43%、42%、39%和38%，陽性對照加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)最大鎮(zhèn)痛百分率分別為41%、59%、65%、82%、75%、78%和79%。大劑量化合物DXL-A-22的最大鎮(zhèn)痛百分率與加巴噴丁(100 mg·kg-1，i.g.)比較差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 3 Effect of DXL-A-22 on paw withdrawal latency

2.2 化合物DXL-A-22抗神經(jīng)病理性疼痛作用機制

2.2.1化合物DXL-A-22對CCI大鼠DRG p-CaMKⅡα/p-CREB蛋白表達(dá)的影響 如Fig 4所示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)引起溶媒組大鼠DRG中p-CaMKⅡα和p-CREB蛋白表達(dá)明顯增加，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。術(shù)后次日連續(xù)給予化合物DXL-A-22(2 mg·kg-1，i.g.)7 d，p-CaMKⅡα和p-CREB蛋白表達(dá)與溶媒組比較明顯降低(P<0.05)，抑制率分別為37%和48%，與假手術(shù)組比較差異無顯著性(P>0.05)。各組間CaMKⅡα、CREB蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。

2.2.2化合物DXL-A-22對CCI大鼠DRG p-JAK2/ p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 如Fig 5所示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后，溶媒組大鼠DRG中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。連續(xù)給予化合物DXL-A-22(2 mg·kg-1，i.g.)7 d，明顯降低DRG中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)(P<0.05)，抑制率分別為35%和58%,與假手術(shù)組比較差異無顯著性(P<0.05)。各組間JAK2、STAT3蛋白表達(dá)保持穩(wěn)定(P<0.05)。

2.2.3化合物DXL-A-22對CCI大鼠DRG和脊髓中TNF-α mRNA、c-fos mRNA表達(dá)的影響 如Fig 6所示，CCI術(shù)后，溶媒組大鼠DRG和脊髓TNF-α、c-Fos mRNA表達(dá)明顯增加，與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.01)。給予化合物DXL-A-22(2 mg·kg-1，i.g.)7 d可明顯降低TNF-α、c-Fos mRNA表達(dá)(P<0.01)，在DRG的抑制率分別為39%和32%，在脊髓的抑制率分別為47%和72%，與假手術(shù)組比較差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 4 Effect of DXL-A-22 on expression of pCaMKⅡα and pCREB in DRG

Fig 5 Effect of DXL-A-22 on expression of pJAK2 and pSTAT3 in DRG

Fig 6 Effect of DXL-A-22 on expression of TNF-α and c-fos mRNA in DRG and spinal cord

2.3 急性毒性小鼠灌胃給予化合物DXL-A-22(1 000 mg·kg-1，相當(dāng)于小鼠劑量的1 000倍)后，72 h內(nèi)，其行為和自主活動正常，觀察的14 d內(nèi)沒有任何死亡或其他致命性損傷現(xiàn)象。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是臨床上最常見的慢性疼痛，由疾病或軀體感覺系統(tǒng)的損傷引起。神經(jīng)病理性疼痛的治療是醫(yī)學(xué)上公認(rèn)的難題。治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物主要包括抗驚厥藥(加巴噴丁、普瑞巴林)、抗抑郁藥(阿米替林)、阿片類鎮(zhèn)痛藥(嗎啡)、NMDA受體拮抗劑(氯胺酮)及非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物(氟比洛芬酯)等，這些藥物治療效果并不明顯，臨床上僅有不超過一半的病人得到有意義的緩解，且長期服用這些藥物會引起一系列的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、內(nèi)分泌改變、心臟毒性、呼吸抑制、成癮性、耐藥性等[8]。因此，有效治療神經(jīng)病理性疼痛且無明顯毒副作用的藥物有待進(jìn)一步研發(fā)。

前期研究顯示，螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎作用，對動物的自主活動、體溫、心率等無明顯影響[3]。DXL-A-22為螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物，本研究采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型，評價其抗神經(jīng)病理性疼痛作用。實驗結(jié)果顯示，化合物DXL-A-22可抑制坐骨神經(jīng)損傷引發(fā)的機械刺激過敏和熱刺激痛覺過敏，表明DXL-A-22有明顯的抗神經(jīng)病理性疼痛作用。DXL-A-22對CCI大鼠的機械刺激痛閾提高率和熱刺激最大鎮(zhèn)痛百分率與陽性對照加巴噴丁相當(dāng)，而劑量小50倍，安全性提高。

CaMKⅡ為絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β、γ、δ四種基因編碼，分布于外周和中樞神經(jīng)元。CaMKⅡα主要分布于疼痛產(chǎn)生區(qū)背根神經(jīng)節(jié)和脊髓。當(dāng)受到傷害性刺激時，Ca2+流增加，CaMKⅡα通過與增加的Ca2+結(jié)合而在Thr286位點自動磷酸化。磷酸化的CaMKⅡα促使CREB在Ser133位點自動磷酸化，從而活化CREB。p-CREB與啟動子結(jié)合，使TNF-α、c-Fos表達(dá)增加，從而引發(fā)疼痛反應(yīng)[9]。CaMKⅡα/CREB信號通路在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)損傷后脊髓中p-CaMKⅡα與p-CREB表達(dá)明顯增加，阻斷p-CaMKⅡα能抑制p-CREB表達(dá)，明顯減輕小鼠痛覺過敏[10]。JAK2是酪氨酸激酶，當(dāng)受到特定刺激時，JAK2被活化，磷酸化后的JAK2活化轉(zhuǎn)錄因子STAT3，STAT3磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，引發(fā)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，促使炎癥細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生[11]。c-Fos為STAT3的靶基因，STAT3通過磷酸化活化后,引起靶基因c-Fos的激活和表達(dá)[12]。JAK2/STAT3信號通路與神經(jīng)痛相關(guān)，神經(jīng)損傷后，脊髓p-JAK2和p-STAT3表達(dá)增加，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示，化合物DXL-A-22明顯抑制CCI大鼠DRG中p-CaMKⅡα、p-CREB、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)，提示DXL-A-22的抗神經(jīng)病理性疼痛作用與抑制CaMKⅡα/CREB和JAK2/STAT3信號通路相關(guān)。

在外周神經(jīng)傷害中，前炎癥細(xì)胞因子TNF-α是早期退行性變化的主要調(diào)節(jié)者，在神經(jīng)病理性疼痛中扮演重要角色。神經(jīng)傷害可使DRG和脊髓中TNF-α表達(dá)增加，抑制TNF-α可以減輕神經(jīng)傷害引起的機械刺激[14]。c-Fos，即刻早期基因，常作為激活疼痛神經(jīng)元的標(biāo)志。當(dāng)機體接受外界刺激時，c-Fos被快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，翻譯出的Fos迅速進(jìn)入核內(nèi)，組成二聚體，與蛋白激活子結(jié)合，刺激轉(zhuǎn)錄。抑制神經(jīng)系統(tǒng)c-Fos表達(dá)，可減輕神經(jīng)病理性痛大鼠的疼痛行為[15]。本研究結(jié)果顯示，化合物DXL-A-22明顯抑制CCI大鼠DRG和脊髓TNF-α、c-Fos mRNA的表達(dá)，表明DXL-A-22通過抑制TNF-α、c-Fos mRNA表達(dá)，緩解神經(jīng)病理性疼痛。

本文首次研究螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物DXL-A-22的抗神經(jīng)病理性疼痛作用，探討其抗神經(jīng)病理性疼痛的機制與抑制背根神經(jīng)節(jié)CaMKⅡα/CREB、JAK2/STAT3信號通路，降低背根神經(jīng)節(jié)及脊髓中TNF-α和c-Fos表達(dá)相關(guān)。該研究為螺環(huán)哌嗪季銨鹽化合物的結(jié)構(gòu)改造和研發(fā)高效低毒的抗神經(jīng)病理性疼痛藥物提供實驗依據(jù)。

(致謝：本實驗在北京大學(xué)藥學(xué)院分子與細(xì)胞藥理學(xué)實驗室和天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室完成，對所有提供技術(shù)平臺和技術(shù)協(xié)作的老師同學(xué)表示感謝。)