Wnt10b與骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的關(guān)系

胡 瑩，廖云鵬，李福書，周 婭，李 沁，孫文娟，何百成

(重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphorgenetic protein 9，BMP9)作為BMP家族中研究較少的成員，是有效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)骨向分化的因子之一[1]。因此，BMP9可能具有良好的臨床應(yīng)用前景，用于治療骨質(zhì)疏松、骨缺損、骨不連接等骨相關(guān)疾病。迄今為止，BMP9誘導(dǎo)MSCs骨向分化的具體分子機(jī)制仍不十分清楚。

作為TGF-β家族的一員，BMP9本身參與多種生理過程，如調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元發(fā)育、鐵代謝與血管生成，以及促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞系定向分化[2]等。BMP9可以通過經(jīng)典BMP/Smad途徑發(fā)揮其生理功能，此外，BMP9也可以通過非經(jīng)典BMP/Smad途徑發(fā)揮作用，如p38 MAPK和PI3K/Akt途徑等[3]。研究報道，多種其他信號或因子能夠參與調(diào)節(jié)BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化，如生長激素(growth hormone，GH)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、維甲酸、Wnt/β-catenin及Notch信號[4]。BMP9雖能誘導(dǎo)MSCs骨向分化，但同時也伴有成脂分化[5]。因此，降低BMP9誘導(dǎo)MSCs的成脂分化可能是增強(qiáng)其誘導(dǎo)MSCs成骨分化的有效措施之一。

Wnt/β-catenin信號是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的重要信號之一[6]。據(jù)報道，BMP9在誘導(dǎo)MSCs成骨分化的過程中能增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號的活性，沉默β-catenin則減弱BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的能力[7]。但BMP9在誘導(dǎo)MSCs成骨分化過程中調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號的機(jī)制尚不清楚。Wnt10b是Wnt/β-catenin信號的一種配體，對前脂肪細(xì)胞的分化有抑制作用，但能促進(jìn)成骨分化[8]。因此，Wnt10b可能對BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化具有促進(jìn)作用，盡管兩者的關(guān)系目前還不清楚。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，分析Wnt10b在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化中的作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)所用NIH孕鼠(E12.5)，購自于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，并代養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)室內(nèi)。

1.1.2細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，從NIH小鼠12.5 d胚胎中提取獲得；人腎上皮細(xì)胞HEK293、間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2、成肌細(xì)胞C2C12及小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1，購自ATCC(Manassas，VA，USA)。采用高糖DMEM(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、0.1 g·L-1鏈霉素)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2及37 ℃。

1.1.3試劑 一抗Wnt10b(ab155332)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)(ab15191)、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB)(ab32096)，購自Abcam公司；一抗GAPDH(sc-32233)、骨橋素(osteopontin，OPN)(sc-10593)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)(sc-18319)、重組人CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα)(sc-61)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)(sc-1984)、Smad1/5/8(sc-6031-R)、p-Smad1/5/8(sc-12353)，購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.4儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)(Thermo公司)；超凈操作臺(安泰技術(shù)有限公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)；濕式轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳槽(六一儀器廠)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.2 重組腺病毒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染本實(shí)驗(yàn)所用重組腺病毒采用Ad-Easy系統(tǒng)進(jìn)行構(gòu)建[9]。利用PCR擴(kuò)增BMP9、Wnt10b、綠色熒光蛋白(GFP)的編碼序列，將所獲片段以及Wnt10b的小干擾RNA片段克隆到腺病毒穿梭載體中，然后將穿梭質(zhì)粒與AdEasy-1在BJ5183細(xì)菌中重組。最后，將重組好的質(zhì)粒線性化，并轉(zhuǎn)化到HEK293細(xì)胞中包裝重組腺病毒。所獲重組腺病毒載體分別命名為AdBMP9、AdWnt10b、AdGFP、AdsiWnt10b[10]，其中，GFP用于標(biāo)記腺病毒載體，AdGFP作為載體對照。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)周期分析將C3H10T1/2細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計要求，分別用不同的重組腺病毒(AdGFP、AdBMP9、AdWnt10b及AdBMP9合并AdWnt10b)處理細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，用冰PBS(4 ℃)重懸細(xì)胞并離心(800 r·min-1, 5 min×2次)。然后用預(yù)冷的70%、50%、30%乙醇固定，并用PBS洗滌。加入1 mL PI(20 g·L-1)溶液(含RNase，1 g·L-1)孵育30 min。最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)利用TRIzol試劑裂解細(xì)胞并提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。將所得cDNA稀釋5～10倍，作為模板用于定量PCR檢測。以GAPDH的表達(dá)水平對目的基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本實(shí)驗(yàn)所涉及到引物序列見Tab 1。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計利用重組腺病毒以及其他試劑處理。在預(yù)定的時間點(diǎn)，裂解細(xì)胞，并將裂解液煮沸10 min使裂解物變性。所得樣品在SDS-PAGE膠中分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以10%脫脂奶粉封閉，以相應(yīng)的一抗和二抗分別孵育。最后利用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑測定靶蛋白表達(dá)情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Tab 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.6 礦物質(zhì)沉積實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于24孔板中，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計用相應(yīng)重組腺病毒及其他試劑處理。21 d后，棄培養(yǎng)基并用PBS洗滌3次，室溫下加入0.05%戊二醛固定10 min，用蒸餾水洗滌。然后以0.4%茜素紅S溶液對細(xì)胞進(jìn)行染色5 min，用蒸餾水輕輕洗滌。觀察礦物質(zhì)沉淀。掃描平板，并在顯微鏡下采集圖像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 油紅O染色將細(xì)胞接種到24孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計用重組腺病毒及其他相應(yīng)試劑處理細(xì)胞。14 d后，先用10%福爾馬林固定細(xì)胞30 min，然后棄固定液并用PBS洗滌3次，最后用油紅O溶液染色，在顯微鏡下采集圖像。定量分析時，用異丙醇從細(xì)胞中提取油紅O，在570 nm處測定吸光度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 BMP9在干細(xì)胞中對Wnt10b表達(dá)的影響Wnt10b是經(jīng)典Wnt/β-cantein信號的一種配體。課題組前期研究表明，BMP9能夠促進(jìn)MSCs的成骨分化，但BMP9與Wnt10的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究旨在探討Wnt10b是否參與調(diào)節(jié)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的作用。首先檢測在MSCs中，BMP9對Wnt10b表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，BMP9在C3H10T1/2細(xì)胞及3T3-L1細(xì)胞中能上調(diào)Wnt10b的mRNA水平(Fig 1A、1B)，并且增加C3H10T1/2細(xì)胞中Wnt10b的蛋白表達(dá)水平(Fig 1C)。此外，Wnt10b在C3H10T1/2、C2C12、MEFs和MC3T3-E1等細(xì)胞中均有表達(dá)(Fig 1D)。以上結(jié)果提示，Wnt10b可能在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化過程中起重要調(diào)節(jié)作用。

2.2 Wnt10b對BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的影響B(tài)MP9可在C3H10T1/2細(xì)胞中上調(diào)Wnt10b表達(dá)。因此，本研究接下來分析Wnt10b是否可以增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的能力。定量PCR檢測結(jié)果顯示，BMP9能夠上調(diào)Dlx-5 mRNA的表達(dá)水平，Wnt10b也能增加Dlx-5 mRNA的表達(dá)水平，并明顯增強(qiáng)BMP9上調(diào)Dlx-5表達(dá)的能力(Fig 2A)。Western blot結(jié)果顯示，BMP9增加C3H10T1/2細(xì)胞中OPN和OCN的蛋白水平，Wnt10b對OPN和OCN的蛋白水平?jīng)]有明顯影響，但能明顯增強(qiáng)BMP9對OPN和OCN表達(dá)的促進(jìn)作用(Fig 2B)。同時，Wnt10b還能明顯增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCs礦物質(zhì)沉積的能力(Fig 2C)。沉默Wnt10b不僅降低Dlx-5 mRNA水平，也減弱BMP9上調(diào)Dlx-5表達(dá)的能力(Fig 2D)，沉默Wnt10b也減弱BMP9上調(diào)OPN和OCN蛋白水平的作用(Fig 2E)。礦化實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，沉默Wnt10b能減弱BMP9在C3H10T1/2細(xì)胞中礦化的能力(Fig 2F)。以上結(jié)果提示，Wnt10b可能是促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的重要調(diào)節(jié)因子。

2.3 BMP9及Wnt10b對C3H10T1/2細(xì)胞增殖的影響為分析Wnt10b促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化的機(jī)制，本研究分析了Wnt10b與BMP9對細(xì)胞周期的影響。流式分析結(jié)果顯示，BMP9及Wnt10b均不影響細(xì)胞的周期(Fig 3A)。 Western blot分析也顯示，BMP9及Wnt10b均不明顯影響PCNA的蛋白水平(Fig 3B)。以上結(jié)果提示，Wnt10b促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化可能與影響增殖能力無關(guān)。

Fig 1 Effect of BMP9 on expression of Wnt10b in stem cells

Fig 2 Effect of Wnt10b on BMP9-induced osteogenic markers in C3H10T1/2 cells

Fig 3 Effect of BMP9 and Wnt10b on cell cycle in C3H10T1/2 cells

2.4 Wnt10b對BMP9介導(dǎo)的BMP/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響B(tài)MP9可通過經(jīng)典BMP/Smad途徑或非經(jīng)典BMP/Smad途徑發(fā)揮其生理功能。因此，本研究進(jìn)一步檢測Wnt10b促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化，是否與影響B(tài)MP/Smad信號的活性有關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，BMP9對Smad1/5/8水平無明顯影響，但能明顯增加Smad1/5/8的磷酸化水平。Wnt10b對p-Smad1/5/8和Smad1/5/8的水平無明顯影響，但能明顯增強(qiáng)BMP9對Smad1/5/8磷酸化的促進(jìn)作用(Fig 4A、4B)。沉默Wnt10b對p-Smad1/5/8和Smad1/5/8的水平也無明顯影響，但能明顯降低BMP9對Smad1/5/8磷酸化的促進(jìn)作用(Fig 4C、4D)。以上結(jié)果提示，Wnt10b促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的作用可能與增強(qiáng)BMP/Smad信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)。

2.5 Wnt10b對BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化的影響干細(xì)胞的成骨分化和成脂分化是兩個相互影響的生理過程，脂肪生成增加可能導(dǎo)致骨形成減少。據(jù)報道，Wnt10b可以抑制前脂肪細(xì)胞分化。因此，我們推測Wnt10b也可能通過抑制BMP9介導(dǎo)的MSCs成脂分化，從而增強(qiáng)BMP9的成骨分化誘導(dǎo)能力。油紅O染色結(jié)果顯示，Wnt10b明顯降低BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化的能力(Fig 5A、5B)。Western blot結(jié)果顯示，BMP9上調(diào)C/EBPα和PPARγ的蛋白水平，但Wnt10b能明顯減弱BMP9增加C/EBPα和PPARγ水平的作用(Fig 5C)。沉默Wnt10b能促進(jìn)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，同時明顯增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的脂滴形成(Fig 5D、5E)，并且增強(qiáng)BMP9上調(diào)C/EBPα和PPARγ蛋白水平的能力(Fig 5F)。以上結(jié)果提示，Wnt10b對BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的作用可能部分與抑制BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成脂分化有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

Fig 4 Effect of Wnt10b on BMP9-induced BMP/Smad signaling n=3)

Fig 5 Effect of Wnt10b on BMP9-induced adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells

3 討論

本研究分析了Wnt10b對BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的影響，以及調(diào)節(jié)該過程的可能分子機(jī)制，首次提出Wnt10b增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)成骨分化的能力可能與增強(qiáng)BMP/Smad信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)，并且進(jìn)一步探索了其對BMP9成脂誘導(dǎo)分化能力的影響，為進(jìn)一步揭示W(wǎng)nt信號通路與BMP/Smad通路之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP9能上調(diào)Wnt10b的表達(dá)，Wnt10b能明顯促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的能力；Wnt10b的這種作用可能與增強(qiáng)BMP/Smad信號的傳導(dǎo)，同時抑制BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞的成脂分化有關(guān)。

BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員，是調(diào)節(jié)細(xì)胞多種重要生理過程的關(guān)鍵因子，如細(xì)胞的增殖和分化[4]。雖然BMP9(也稱為GDF2)最開始是從小鼠肝臟的cDNA文庫中鑒定，但其具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育、鐵代謝、血管生成，以及促使MSCs向成骨細(xì)胞系的定向分化等[1-2]。據(jù)報道，BMP9的成骨分化誘導(dǎo)能力可能強(qiáng)于BMP2和BMP7。因此，BMP9可能是最有效的誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的BMPs因子之一[1]。BMP9通常通過BMP/Smad途徑(即經(jīng)典BMP/Smad途徑)或非經(jīng)典BMP/Smad途徑(如p38 MAPKs和PI3K/Akt途徑)發(fā)揮其生理功能[3]。在經(jīng)典的BMP/Smad途徑中，BMP9與其膜受體結(jié)合，并激活Smad1/5/8(即p-Smad1/5/8)。然后，p-Smad1/5/8募集并磷酸化Smad4以形成復(fù)合物。最后，復(fù)合物易位到細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)。此外，有研究表明，多種其他因子或信號也參與調(diào)節(jié)BMP9誘導(dǎo)的干細(xì)胞成骨分化，如GH、IGF、維甲酸和Wnt/β-catenin信號[3-4]。但BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的具體分子機(jī)制尚不十分清楚。

成骨和成脂分化是兩個相互影響的過程[11]。MSCs通常以成脂分化的減少為代價，向成骨細(xì)胞譜系分化，反之亦然。盡管BMP9在MSCs中顯示出強(qiáng)大的誘導(dǎo)成骨分化的能力，但它也可誘導(dǎo)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[12]。因此，可以通過減弱MSCs中的成脂分化，來增強(qiáng)BMP9的促成骨能力。Wnt/β-catenin是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和存活的重要信號。研究表明，Wnt信號對骨骼系統(tǒng)和脂肪的形成也非常重要[13]。異常的Wnt/β-catenin信號與多種骨相關(guān)疾病有關(guān)，如骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、骨硬化癥等。據(jù)報道，BMP9在誘導(dǎo)MSCs成骨分化時可激活Wnt/β-catenin信號，沉默β-catenin或過表達(dá)DKK1均能降低BMP9的促成骨潛能，而過表達(dá)β-catenin則增強(qiáng)BMP9的促成骨能力[14]。因此，BMP9誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化作用與Wnt/β-catenin信號關(guān)系密切。

Wnt10b是Wnt/β-catenin信號的另一種經(jīng)典蛋白質(zhì)。有研究表明，Wnt10b與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[15]。此外，Wnt10b可以促進(jìn)成骨分化，并抑制前脂肪細(xì)胞的分化。因此，課題組推測，Wnt10b可能參與調(diào)節(jié)BMP9誘導(dǎo)的成骨分化。本研究結(jié)果顯示，BMP9可以上調(diào)C3H10T1/2細(xì)胞和其他幾種干細(xì)胞中Wnt10b的表達(dá)；Wnt10b能增加BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨指標(biāo)水平，但沉默Wnt10b則降低BMP9的這種作用。提示W(wǎng)nt10b對BMP9誘導(dǎo)MSCs的成骨分化具有重要促進(jìn)作用。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Wnt10b明顯增加由BMP9介導(dǎo)的Smad1/5/8磷酸化水平，而沉默Wnt10b減弱BMP9對p-Smad1/5/8的促進(jìn)作用。同時，Wnt10b可降低BMP9在C3H10T1/2細(xì)胞中上調(diào)PPARγ和C/EBPα水平的作用，并減少細(xì)胞中脂滴的形成；沉默Wnt10b增強(qiáng)BMP9在C3H10T1/2細(xì)胞中誘導(dǎo)的脂肪分化。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明，Wnt10b可以促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs的成骨分化，這種作用可能與增強(qiáng)BMP/Smad信號的傳導(dǎo)活性，以及抑制BMP9誘導(dǎo)MSCs成脂分化有關(guān)。

[致謝：本研究在重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝何通川教授(T. C. HE，芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心)為本實(shí)驗(yàn)饋贈所需的重組腺病毒載體。]