力達(dá)霉素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞周期、凋亡、自噬和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的影響

徐 珊，周 游，劉鈺妮，王世恩，楊建林，王艷林，曹春雨

(1. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2. 宜昌市疾病預(yù)防控制中心，健康管理服務(wù)中心，湖北 宜昌 443000)

力達(dá)霉素(lidamycin，LDM)是一種大分子烯二炔類抗腫瘤抗生素，它由我國科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)于湖北省潛江縣土壤中分離出的一株鏈霉菌(StreptomycesglobisporusC-1027)中。LDM對(duì)大多數(shù)革蘭陽性菌有抑菌作用，但對(duì)革蘭陰性菌和分枝桿菌無效。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LDM對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷作用，在腫瘤臨床治療中具有重要的應(yīng)用前景[1]。目前，已經(jīng)證實(shí)其在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷力，并且其殺傷力遠(yuǎn)高于常用化療藥[2]，但其對(duì)宮頸癌細(xì)胞作用的機(jī)制研究報(bào)道不多。本研究以宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對(duì)象，分析LDM對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響及其作用的分子機(jī)制，為將LDM用于宮頸癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株人宮頸癌Hela細(xì)胞株，購自武漢細(xì)胞典藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 試劑LDM，由北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)甄永蘇教授惠贈(zèng)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗，購自天津?yàn)笊?；BSA蛋白定量試劑盒、凋亡試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC、PI Staining Solution)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；ECL超敏顯影液，購自美國Thermo Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、RNase，購自日本TaKaRa寶生物公司；結(jié)晶紫、RIPA組織/細(xì)胞裂解液，購自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司；Dioc6購自美國Thermo Fisher公司；Cyclin B1、Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、Beclin-1抗體，均購自Proteintech公司；PARP、p62、LC3A/B、E-cadherin、MMP-9抗體，均購自Cell Signaling Technology公司；N-cadherin抗體，購自BD Transduction Lab公司；Vimentin抗體，購自Santa Cruz公司；MMP-2、LSD1抗體，均購自Abcam公司；β-actin抗體，購自北京科美博瑞公司。

1.3 儀器TE2000-S熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；凝膠電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIOSHine公司)；BDFACSVerse流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；NanoDrop 2000核酸分析儀(美國Thermo Fisher公司)；ABI StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

2 方法

2.1 MTT法分析細(xì)胞增殖收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3.5×107·L-1。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL(約3 500個(gè)細(xì)胞/孔)。將培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用DMEM完全培養(yǎng)基倍比稀釋藥物，按每孔100 μL的量將其加入相應(yīng)孔中(每個(gè)藥物濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。吸除培養(yǎng)基，加MTT試劑(終濃度0.2 g·L-1)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸除培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL, 低速振蕩15～30 min，待結(jié)晶物充分溶解后，在全波長酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)量各孔的OD490值。細(xì)胞生長抑制率計(jì)算公式：抑制率/%=[1-(藥物處理組OD值-試劑對(duì)照孔OD值)/(無藥物處理組OD值-試劑對(duì)照孔OD值)]×100%。藥物的IC50值經(jīng)由GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算得出。

2.2Transwell法分析細(xì)胞遷移分別收取不同濃度藥物處理的細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至4×108·L-1。向Transwell小室中加入無血清DMEM培養(yǎng)基(50 μL/小室)，37 ℃平衡5 min。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液垂直緩慢加入小室中(100 μL/小室)，并將小室置于加有600 μL DMEM完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)板下室中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS清洗小室2～3次。將小室置于800 μL固定液中，室溫固定30 min，PBS清洗小室2～3次。將小室置于800 μL結(jié)晶紫染色溶液中，室溫染色30 min，清水清洗3～4遍后，吸干小室內(nèi)液體，用蘸濕的棉棒輕輕擦去上室內(nèi)部細(xì)胞，PBS清洗小室2～3次。將小室小心放置于滴有PBS的干凈玻片上，顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

2.3 Transwell法分析細(xì)胞侵襲向Transwell小室加入無血清DMEM培養(yǎng)基(50 μL/小室)，37 ℃平衡5 min后棄去。將基質(zhì)膠原液用無血清DMEM培養(yǎng)基1∶8稀釋后，垂直加入小室中(80 μL/小室)，置37 ℃、4 h靜待其凝固。分別收取不同濃度藥物處理的細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×108·L-1。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液垂直緩慢加入小室中(100 μL/小室)，并將小室置于加有600 μL DMEM完全培養(yǎng)基(含12%小牛血清)的培養(yǎng)板下室中。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。余下操作同上述細(xì)胞遷移分析。

2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)分別收取經(jīng)不同濃度藥物處理的細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA液裂解細(xì)胞(100 μL/孔)后，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管。用BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白濃度，取適量上清液(含50 μg蛋白)，加入1/4體積的5×loading buffer，100 ℃保溫10 min。所得樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜用5%脫脂牛奶(TBST配制)室溫封閉2 h后，TBST洗膜10 min×3次。加一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次；再加二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并記錄結(jié)果。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分別收取不同濃度藥物處理的細(xì)胞，1×PBS洗滌細(xì)胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用4 ℃預(yù)冷的75%乙醇(1×PBS配制)重懸細(xì)胞，固定過夜。2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用1 mL 1×PBS重懸細(xì)胞，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清。細(xì)胞沉淀用500 μL 1×PBS(含50 mg·L-1RNase和0.1% TritonX-100)重懸，加20 μL 0.5 g·L-1PI，37 ℃水浴避光染色30 min。細(xì)胞樣本過濾后，上流式細(xì)胞儀分析。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡分別收集藥物處理后的細(xì)胞，PBS洗滌1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。參照試劑盒說明書，每個(gè)樣品用100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞后，分別加入Annexin Ⅴ-FITC(5 μL/管)和PI Staining Solution(5 μL/管)。充分混勻，避光靜置10 min。每管加入400 μL Binding Buffer，輕輕混勻，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)收集相應(yīng)處理后細(xì)胞于EP管中，用PBS洗洗滌細(xì)胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。預(yù)先將Dioc6儲(chǔ)存液用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至工作濃度(40 nmol·L-1)，每管用1 mL Dioc6工作液重懸細(xì)胞。避光37 ℃、20 min，中途彈懸1次。然后以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。每管用500 μL PBS重懸細(xì)胞后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

2.8 qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)用1 mL TRIzol試劑裂解培養(yǎng)于6孔板中的細(xì)胞，并將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，每管加入氯仿300 μL，渦旋震蕩15 s，冰置10 min，13 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，每管加入異丙醇300 μL，顛倒混勻。冰置15 min，13 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。棄上清，用75%的乙醇(DEPC水配制)600 μL洗滌沉淀，13 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。該步驟重復(fù)操作一遍。棄去上清液，在無菌臺(tái)內(nèi)靜置10 min待殘余乙醇揮發(fā)，每管加入20 μL DEPC-水溶解RNA沉淀。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將樣品中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后以β-actin為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of LSD1 and β-actin

3 結(jié)果

3.1 LDM能有效抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖LDM(0、5、10、20、40、80 μg·L-1)處理Hela細(xì)胞24、48、72 h，MTT法檢測(cè)分析LDM對(duì)細(xì)胞增殖的影響，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。Fig 1結(jié)果顯示，LDM對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖有明顯性抑制作用，且呈濃度與時(shí)間依賴性。經(jīng)GraphPad軟件統(tǒng)計(jì)分析，LDM對(duì)Hela細(xì)胞的IC50(95%可信區(qū)間)值為：24 h組，19.24 μg·L-1(7.684～48.16 μg·L-1)；48 h組，6.678 μg·L-1(3.494～12.76 μg·L-1)；72 h組，3.221 μg·L-1(1.397～7.429 μg·L-1)。

Fig 1 Proliferation of Hela cells inhibited by LDM

Fig 2 Hela cells arrested by LDM on G2/M stage

Fig 3 Effect of LDM on apoptosis of Hela cells

3.2 LDM誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生G2/M周期阻滯LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LDM處理組G1期、S期細(xì)胞比例降低，G2期細(xì)胞比例明顯性增加，提示LDM能將Hela細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并且呈濃度依賴性(Fig 2A)。Western blot結(jié)果也顯示, 與對(duì)照組相比，LDM處理組的細(xì)胞周期相關(guān)因子Cyclin B1與p21表達(dá)升高，而Cyclin D1表達(dá)降低，且呈濃度依賴性(Fig 2B)。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證LDM能通過對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白因子表達(dá)的影響，改變Hela細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞增殖。

Fig 4 Effect of LDM on expression of apoptosis-related proteins and change of MMP of Hela cells

3.3 LDM誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡LDM(0、5、10、20、40、80 μg·L-1)處理細(xì)胞24、48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果顯示，LDM能有效誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈濃度依賴性。與對(duì)照組相比，LDM處理24 h的細(xì)胞凋亡率從3.87%增加到11.38%；而LDM處理48 h的細(xì)胞凋亡率從4.27%增加到29.54%(Fig 3)。Western blot分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LDM處理組(24 h)的細(xì)胞中凋亡底物蛋白PARP的切割活化產(chǎn)物蛋白(c-PARP)與凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)增加，但凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)下降，Bax/Bcl-2的比值明顯升高，且以上變化均呈濃度依賴性(Fig 4A)。

線粒體膜通透性增加和膜電位下降是線粒體途徑細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期事件之一。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LDM對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，本實(shí)驗(yàn)用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并用Dioc6染色，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LDM處理組的細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度均值增加，峰頂值右偏，且高濃度組較低濃度組變化更明顯，提示LDM處理可導(dǎo)致線粒體膜通透性增加和膜電位降低(Fig 4B)。

3.4 LDM影響宮頸癌Hela細(xì)胞自噬用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細(xì)胞24 h后，制備細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低濃度LDM處理使自噬底物蛋白p62蛋白表達(dá)水平下降，而自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1和LC3B表達(dá)水平升高；但高濃度LDM處理時(shí)，p62蛋白表達(dá)水平無明顯改變，而Beclin-1和LC3B的表達(dá)水平明顯下降(Fig 5)。提示LDM在低濃度時(shí)可使Hela細(xì)胞自噬水平增加，而在高濃度時(shí)可降低Hela細(xì)胞的自噬水平。

3.5 LDM抑制宮頸癌Hela細(xì)胞遷移和侵襲分別用LDM(0、5、10、20、40、80 μg·L-1)處理對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞24 h，然后用Transwell法分析細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，LDM能明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性(Fig 6A、6C)。進(jìn)一步分析LDM對(duì)Hela細(xì)胞侵襲能力影響。用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞24 h后，基質(zhì)膠-Transwell法分析細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，LDM能夠有效抑制宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲，且呈濃度依賴性(Fig 6B、6D)。

隨后分析LDM對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)因子表達(dá)的影響。用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細(xì)胞24 h后，制備細(xì)胞裂解液，Western blot法分析細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LDM處理組細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)升高，間質(zhì)型細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin與Vimentin表達(dá)降低，且高濃度組較低濃度組變化更明顯；與對(duì)照組相比，LDM處理細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2與MMP-9表達(dá)降低，且高濃度組較低濃度組變化更明顯(Fig 7)。上述結(jié)果提示，LDM能夠抑制宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生EMT和抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

Fig 5 Effect of LDM on autophagy of Hela cells n=3)

3.6 LDM對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)LSD1表達(dá)水平無明顯影響用LDM(0、5、20 μg·L-1)處理細(xì)胞24 h后，分析細(xì)胞內(nèi)LSD1 mRNA和蛋白的表達(dá)。Fig 8結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，LDM處理組細(xì)胞的LSD1 mRNA及蛋白表達(dá)水平無明顯改變。

4 討論

腫瘤細(xì)胞對(duì)LDM處理的反應(yīng)，因其組織來源和遺傳背景不同而有所差異。目前報(bào)道的LDM抑制腫瘤細(xì)胞增殖和殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要包括：① 與腫瘤細(xì)胞DNA雙螺旋的小溝結(jié)合，引起DNA雙鏈斷裂和脫堿基化，從而抑制細(xì)胞增殖；② 抗腫瘤血管生成；③ 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、裂亡，以及出現(xiàn)衰老樣表型；④ 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生G1或G2/M細(xì)胞周期阻滯；⑤ 干擾與腫瘤生長相關(guān)信號(hào)通路的活性，如K-ras、Akt、NF-kB和MAPK信號(hào)通路等[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，LDM在低濃度下即能高效抑制Hela細(xì)胞的增殖，處理24、48、72 h的IC50值分別為19.24、6.678、3.221 μg·L-1。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，LDM能將Hela細(xì)胞阻滯于G2/M期，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin B1和p21，但下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)水平。在高濃度處理組(20 μg·L-1)細(xì)胞中，上述現(xiàn)象尤為明顯。這一結(jié)果提示，LDM導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控因子異常表達(dá)可能是其抑制細(xì)胞周期的重要分子基礎(chǔ)[2,3]。

Fig 6 Effect of LDM on migration and invasion abilities of Hela cells

細(xì)胞的凋亡與自噬分別被稱為細(xì)胞的I型程序性死亡和Ⅱ型程序性死亡[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，LDM可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為LDM可使細(xì)胞中凋亡底物蛋白PARP的切割活化產(chǎn)物c-PARP與凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)下降，Bax/Bcl-2的比值明顯升高，且以上變化均表現(xiàn)出濃度依賴性。進(jìn)一步對(duì)線粒體膜電位的分析提示，LDM能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴性的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。

Fig 7 Effect of LDM on EMT-related proteins in Hela cells

LDM對(duì)Hela細(xì)胞自噬的影響因藥物濃度的不同而有所差異，低濃度LDM(5 μg·L-1)能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬，這可能是藥物應(yīng)激條件下細(xì)胞的自我保護(hù)性反應(yīng)。但在高濃度(20 μg·L-1)時(shí)，LDM能明顯抑制Hela細(xì)胞的自噬能力，由此導(dǎo)致的應(yīng)激保護(hù)能力下降可能進(jìn)一步增強(qiáng)Hela細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，對(duì)自噬的抑制可能與高濃度LDM能更明顯地抑制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

侵襲和遷移是所有惡性腫瘤的特征性生物學(xué)行為，其過程機(jī)制復(fù)雜，密切關(guān)系著疾病的發(fā)展與預(yù)后。腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，即具有上皮表型的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型的腫瘤細(xì)胞，是上皮腫瘤獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力、以及藥物抗性的關(guān)鍵性步驟，由此成為抗癌治療的重要靶點(diǎn)[5-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，LDM對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲和遷移能力均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。LDM可上調(diào)Hela細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin，但抑制間質(zhì)型細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin與Vimentin的表達(dá)水平，同時(shí)使具有促侵襲轉(zhuǎn)移功能的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2與MMP-9表達(dá)降低，且高濃度藥物處理的細(xì)胞中上述變化更為明顯。上述結(jié)果提示，LDM能夠抑制宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生EMT和抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

Fig 8 Effect of LDM on expression of LSD1 mRNA(A)and protein(B, C) of Hela cells

有研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)能結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子上，并與HDAC1/2、PRC2、G9a、Suv39H1和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等因子協(xié)同作用，引起的該基因表達(dá)沉默[8-9]。這提示LSD1在介導(dǎo)E-cadherin基因表達(dá)沉默過程中發(fā)揮重要作用，而敲除LSD1基因能逆轉(zhuǎn)其對(duì)E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，進(jìn)而上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平[10-11]。

為探索LSD1是否也在LDM誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中發(fā)揮作用，本研究分析了LDM對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中LSD1表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LDM對(duì)Hela細(xì)胞中LSD1的表達(dá)水平無明顯影響。提示LDM對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞EMT的抑制作用與LSD1無關(guān)，LDM上調(diào)Hela細(xì)胞中E-cadherin基因表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果證明，LDM能夠有效抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與阻遏細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞自噬和抑制EMT密切相關(guān)。上述研究結(jié)果提示，LDM有用于宮頸癌臨床治療的潛在價(jià)值，該研究為LDM的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究支撐。