國內(nèi)外小麥種質抗條銹病評價及相關基因分子檢測

陳向東,吳曉軍，胡鐵柱，李笑慧，李 淦，侯開心，茹振鋼

(河南科技學院 小麥中心/河南省雜交小麥重點實驗室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

小麥是一種適應性強、分布廣泛的世界性糧食作物，為人類提供的熱量和蛋白質分別約占食物總熱量和總蛋白質的21%和20%[1]。小麥條銹病是由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的世界范圍內(nèi)嚴重發(fā)生的小麥病害之一，也是我國小麥生產(chǎn)上最重要的病害，嚴重威脅我國的糧食生產(chǎn)，一般情況下會造成小麥減產(chǎn)10%～30%，嚴重時導致小麥絕產(chǎn)。

近年來，條銹菌生理小種CYR32、CYR33(水源11)逐漸發(fā)展為優(yōu)勢小種，另外，新出現(xiàn)了強毒性生理小種CYR34(貴農(nóng)22)，導致現(xiàn)有大部分小麥主栽品種喪失條銹病抗性[2]。目前，利用抗條銹病品種是防治該病最經(jīng)濟、有效、易行且對環(huán)境安全的措施。條銹病抗性育種的效率主要取決于高效、多樣化抗源的挖掘和快速、準確的選擇鑒定手段。目前，正式公布的小麥抗條銹病基因有Yr1(Yellow rust 1)—Yr79，大部分表現(xiàn)出小種?；蚚3-4]。這些基因中對我國小麥條銹病菌主要流行生理小種CYR32和CYR33有抗性的主效基因為Yr5、Yr8、Yr10、Yr15、Yr17、Yr24、Yr26等，有潛在的利用價值[5-6]。

小麥1BS 染色體臂上含有豐富的抗條銹病基因，如已被定位的Yr10、Yr15、Yr24(YrCH42或Yr26)等，對我國當前條銹病流行生理小種具有較強的抗性[7-9]。快速、準確鑒定小麥種質資源中這些抗條銹病基因的分布情況，對于小麥安全生產(chǎn)、實現(xiàn)抗源合理布局、延緩品種抗條銹病性喪失具有重要意義。目前，研究者對國內(nèi)的小麥栽培品種或農(nóng)家品種中的Yr5、Yr9(1BL/1RS)、Yr10、Yr15、Yr18、Yr24、Yr26基因進行了分子檢測及抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)我國小麥主產(chǎn)區(qū)的小麥品種(系)對當前條銹菌流行小種的抗性水平普遍較低[10-12]。李峰奇等[13]對黃淮麥區(qū)126個小麥品種(系)中的Yr5、Yr9、Yr10、Yr15基因進行分子檢測發(fā)現(xiàn)，僅有11個品種(系)對CYR32和CYR33表現(xiàn)免疫或近免疫，占8.73%；董淑靜等[14]對河南省43個主推品種中的Yr5、Yr9、Yr10、Yr24、Yr26等基因進行檢測發(fā)現(xiàn)，Yr10和Yr24基因均對當前生理小種CYR32和CYR33 具有良好的抗性，而Yr9基因已喪失抗性。董娜等[15]對外引39份小麥種質進行分子檢測發(fā)現(xiàn)，含有Yr5、Yr10、Yr18基因的種質分別為21、2、6份。綜上，目前的研究較少涉及對國內(nèi)和國外小麥種質同時進行田間條銹病抗性鑒定及分子檢測，尤其是在黃淮麥區(qū)。為此，在黃淮麥區(qū)，利用與抗條銹病基因Yr10、Yr15、Yr24共分離或緊密連鎖的STS或SSR標記對124份國內(nèi)外小麥種質進行分子檢測和4 a的抗條銹病鑒定，擴大條銹病抗性遺傳基礎，以期為黃淮麥區(qū)小麥品種布局及抗條銹病品種改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試124份國內(nèi)外小麥種質見表1。

1.2 小麥抗條銹病調(diào)查

所有小麥種質均種植于新鄉(xiāng)市輝縣的種質圃中,每份種質播種2行,畦埂上種誘發(fā)行(石家莊8號),常規(guī)田間管理，于2011—2012年、2012—2013年、2016—2017年和2017—2018年接種條銹菌混合小種(CYR32、CYR33)。于小麥拔節(jié)期(3月中下旬),采用孢子懸液注射法進行接種,每行接種1個分蘗。灌漿初期，調(diào)查條銹病發(fā)病情況。病級劃分采用0～4級法。0(免疫型):葉上無可見癥狀；0;(近免疫型):葉上產(chǎn)生小枯斑,無孢子堆；1(高抗型):夏孢子堆小,周圍有枯斑；2(中抗型):夏孢子堆小到中等大小,生在綠色組織上,周圍有枯斑；3(中感型):夏孢子堆較大,周圍組織有褪綠現(xiàn)象；4(高感型):夏孢子堆大,周圍不褪綠。

表1 國內(nèi)外124份小麥種質的來源

續(xù)表1 國內(nèi)外124份小麥種質的來源

1.3 基因組DNA的提取及分子標記檢測

小麥三葉期，取小麥幼葉，采用CTAB法提取基因組DNA[16]。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果。

選用目前生產(chǎn)上抗性較好且已開發(fā)分子標記的抗條銹病基因Yr10、Yr15和Yr24進行分子檢測。分子標記引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成，序列信息見表2。PCR擴增于ABI Gene Amp PCR System 9700型PCR儀上進行。PCR擴增反應體系為10 μL,包括2×TaqMaster Mix 9(購自北京康為世紀生物科技有限公司)5 μL，10 μmol/L上、下游特異引物各1 μL，模板DNA 50～100 ng，其余用ddH2O補足。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物于170 V下用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳約1 h，經(jīng)銀染和顯影后，利用凝膠成像儀觀察電泳結果并拍照保存。

表2 抗病基因、分子標記及其引物序列Tab.2 Disease-resistant genes,markers and their sequences used in this research

2 結果與分析

2.1 小麥種質中抗條銹病基因Yr10的檢測分析

利用與Yr10基因共分離的STS分子標記S26M47對124份小麥種質進行檢測(圖1、表3)發(fā)現(xiàn)，32份小麥種質可擴增出目的條帶,說明這些材料含有Yr10基因；其他92份材料均沒有擴增出目的條帶，說明這些材料不含Yr10基因，檢出率為 25.81%。

1—34為小麥種質，名稱見表1。M為DNA Marker，從上到下分別為1 000、750、500、250、100 bp。下同

種質名稱GermplasmnameYr10Yr15Yr24病級Diseasegrade種質名稱GermplasmnameYr10Yr15Yr24病級Diseasegrade濟麥22Jimai22-?+0;川農(nóng)19Chuannong19-?+1～2濟南17Ji’nan17-?+4川育40109Chuanyu40109---4鄭麥366Zhengmai366-++4內(nèi)麥9號NeimaiNo.9-++3～4周麥16Zhoumai16-??4綿陽33Mianyang33+?+4周麥18Zhoumai18--?2～3安麥6號AnmaiNo.6-?+1～2周麥22Zhoumai22---1～2資麥1號ZimaiNo.1+?+1～2溫麥6號WenmaiNo.6-?+4豐優(yōu)7號FengyouNo.7+??4矮早781Aizao781-??4寧春38Ningchun38-?+3～4偃師4110Yanzhan4110-??4寧冬11Ningdong11+?+4內(nèi)鄉(xiāng)188Neixiang188---4新春9號XinchunNo.9+??4新寶豐7228Xinbaofeng7228-??4山前麥2號ShanqianmaiNo.2---4百農(nóng)64Bainong64-?+0;張掖冬麥-1Zhangyedongmai-1-?+4百農(nóng)矮抗58Bainongaikang58---1～2揚00-126Yang00-126-++4高優(yōu)503Gaoyou503-?+4揚麥16Yangmai16-++4小偃22-10Xiaoyan22-10+?+4生選4號ShengxuanNo.4-++3～4山東055525Shandong055525+?+4南農(nóng)9918Nannong9918-++3～4中優(yōu)9507Zhongyou9507+++3～4南05Y628Nan05Y628-++4新麥26Xinmai26-++2～3南農(nóng)02Y393Nannong02Y393-+?4百泉3039Baiquan3039-++4鄂麥19號EmaiNo.19---1～2師欒02-1Shiluan02-1-?+4襄麥55Xiangmai55-?+4鄭育麥9987Zhengyumai9987+??2漢北麥Hanbeimai-?+4鄭麥004Zhengmai004---2～3武漢麥Wuhanmai-?+3洛麥23Luomai23-?+4攀道拉Pandaola+++2蘭考198Lankao198-??3～4智矮早Zhiaizao---4豫農(nóng)201Yunong201---4硬質博萊特Yingzhibolaite-?+2～3浚麥99-7Xunmai99-7-++4CL0401-?+2～3新麥208Xinmai208---4CL0407(早)CL0407(Early)+?+1新麥18Xinmai18-++4OTTO(CL0419)+?+2～3荔高6號LigaoNo.6-++3～4CL0438+?+1～2西農(nóng)2208Xinong2208-?+3～4CL0442+?+3～4小偃81-54Xiaoyan81-54-++4HUAYUN--?0;鄭麥9023Zhengmai9023-++4PANDORA++?3濟麥20號JimaiNo.20+?+4TAMOI-++1～2濟麥21號JimaiNo.21+?+4CIKO+?+2～3邯6172Han6172---3～409智引1號09ZhiyinNo.1+?+0;邯4589Han4589---409智引2號09ZhiyinNo.2+?+1～2科農(nóng)199Kenong199---409智引3號09ZhiyinNo.3-?+1～2魯麥14Lumai14-??4CARMEN+?+0

續(xù)表3 小麥種質抗條銹病基因分布及抗病性鑒定

注：+.存在；-.不存在；?.不確定，只檢測到1個標記。發(fā)病病級為4個年份綜合結果。

Note:+. Present;-. Absent;?. Unknown，only one marker is detected.The disease grade in Tab.3 is a comprehensive result of four years.

2.2 小麥種質中抗條銹病基因Yr15的檢測分析

利用與Yr15基因兩翼緊密連鎖的STS標記Xbarc8和SSR標記Xgwm413對124份小麥種質進行檢測。結果(圖2、表3)發(fā)現(xiàn)，Xbarc8標記檢測出95份種質可擴增出260 bp的目的條帶，占76.61%；Xgwm413標記檢出31份種質可擴增出115 bp的目的條帶,占25.00%。Xbarc8和Xgwm413標記同時檢測到目的條帶的種質有28份，占22.58%，說明這些種質攜帶Yr15基因。

圖2 部分小麥種質中Yr15基因分子標記Xbarc8(A)和Xgwm413(B)的檢測

2.3 小麥種質中抗條銹病基因Yr24的檢測分析

利用與Yr24連鎖的兩側SSR標記Xbarc187和Xgwm498檢測124份小麥種質。結果(圖3、表3)發(fā)現(xiàn)，Xbarc187標記檢測出85份種質可擴增出目的條帶，占68.55%；Xgwm498標記檢測出97份種質可擴增出目的條帶，占78.23%。Xbarc187和Xgwm498標記同時檢測到目的條帶的種質有80份,占64.52%，說明這些種質攜帶Yr24基因。

圖3 部分小麥種質中Yr24基因分子標記Xbarc187(A)和Xgwm498(B)的檢測

2.4 小麥種質中抗條銹病基因的分布及其抗病性評價

由表3可知，124份小麥種質中共有29份對CYR32和CYR33混合菌表現(xiàn)中抗及以上水平，其中，9份表現(xiàn)免疫或近免疫，2份表現(xiàn)高抗，16份表現(xiàn)中抗到高抗，2份表現(xiàn)中抗；83份種質表現(xiàn)感病，占總鑒定材料的66.94%，其中，4份表現(xiàn)中感，17份表現(xiàn)中感到高感，62份表現(xiàn)高感；12份種質表現(xiàn)中感到中抗，占總鑒定材料的9.68%。本研究中鑒定的抗性新種質尤其是外引種質將為我國抗條銹品種改良提供重要的種質資源。

經(jīng)分子標記檢測發(fā)現(xiàn)，攜帶Yr10、Yr15、Yr24基因的小麥種質分別有32、28、80份，分別占供試材料的25.81%、22.58%、64.52%。其中，29份表現(xiàn)中抗及以上水平的種質中，12份含有Yr10基因，包括鄭育麥9987、農(nóng)大189、資麥1號、攀道拉、CL0407(早)、CL0438、09智引1號、09智引2號、CARMEN、墨S139、莫斯科39和澳阿優(yōu)1號；3份含有Yr15基因，包括TAMOI、攀道拉和澳阿優(yōu)1號；22份含有Yr24基因，其中，濟麥22、百農(nóng)64、農(nóng)大189、內(nèi)麥836、云麥57、09智引1號、CARMEN和法國財富麥等8份達到免疫或近免疫水平；同時含有Yr10、Yr15、Yr24基因且表現(xiàn)抗病的資源有攀道拉和澳阿優(yōu)1號。周麥22、百農(nóng)矮抗58、新麥19、鄂麥19號、HUAYUN和MRYC等6份材料未檢測到上述基因(分子標記)的存在，其抗性可能受其他基因控制。

3 結論與討論

利用現(xiàn)有與Yr基因共分離或緊密連鎖的SCAR、STS和SSR等分子標記快速、準確鑒定生產(chǎn)品種對條銹病的抗性水平及其攜帶Yr基因種類，對于小麥安全生產(chǎn)、實現(xiàn)抗源合理布局及品種抗性改良具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，92份國內(nèi)小麥種質中有13份、32份國外小麥種質中有16份種質對條銹菌混合小種(CYR32、CYR33)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定抗性，共占供試材料的23.39%；攜帶Yr10、Yr15、Yr24基因的小麥種質分別有32、28、80份，分別占供試材料的25.81%、22.58%、64.52%。李峰奇等[13]對126份中國黃淮麥區(qū)重要的小麥品種(系)進行抗條銹病基因分子檢測發(fā)現(xiàn) ，攜帶Yr9基因的小麥材料所占比例最高(占41.6%)，Yr5、Yr10、Yr15和Yr26基因的分布頻率較低，而Yr9基因已喪失對生理小種CYR32和CYR33的抗性。韓德俊等[19]以Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26等已知抗條銹病基因的分子標記對1 980份小麥地方品種和國外種質進行分子檢測及抗條銹病性鑒定，發(fā)現(xiàn)50份抗病材料中僅有2份材料可能攜帶Yr10基因，未發(fā)現(xiàn)攜帶Yr5、Yr15和Yr26的材料。說明我國主產(chǎn)區(qū)小麥品種及地方品種抗條銹病優(yōu)勢生理小種CYR32和CYR33的水平依然較低，今后需要加大力度篩選、利用國外優(yōu)異抗源改良現(xiàn)有品種抗性。

抗病育種策略是使生產(chǎn)品種具有盡可能廣泛而穩(wěn)定的抗病遺傳基礎，抗病基因的有效組合，將會提高品種抗病性水平，使抗病性表現(xiàn)更加持久[12]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，含有2個或3個抗性基因(Yr10、Yr15、Yr24)的種質，如農(nóng)大189、資麥1號、攀道拉和澳阿優(yōu)1號等，可用于條銹病抗性改良，這對提高黃海麥區(qū)抗病品種抗性的持久性將具有較好的借鑒作用。另外，含Yr26基因的種質在育種中被廣泛而單一地利用及CRY34新小種的出現(xiàn)，導致Yr24/Yr26抗性逐漸喪失，而Yr10和Yr15對新生理小種CRY34具有較好的免疫效果，具有較大的應用潛力[20]。建議利用Yr10、Yr15和Yr24/Yr26及其他新的有效的全生育期抗病基因開展多基因聚合育種，以提高當?shù)匦←溒贩N的抗條銹病性。近期研究發(fā)現(xiàn)，同時攜帶Yr15和Yr64基因的重組自交系有更好的抗性效果[21]。因此，下一步開發(fā)1BS上的Yr64分子標記,并結合Yr15、Yr10、Yr24/Yr26等基因的分子標記，對于輔助篩選新的種質資源和新生理小種抗性分子標記輔助育種具有重要意義。

利用田間表現(xiàn)穩(wěn)定抗病性的材料鑒定新的抗病基因及分子標記對持續(xù)穩(wěn)定分子標記輔助育種具有重要意義。周麥22、百農(nóng)矮抗58、新麥19、鄂麥19號、MRYC和HUAYUN等種質不含Yr10、Yr15、Yr24基因，但田間表現(xiàn)較好的抗病性，它們可能存在其他抗條銹病基因。周麥22和矮抗58的抗病性可能來自染色體7BL上的YrZH84基因[14]；鄂麥19號采用多親本近緣種復合雜交育種，其抗性可能來自近緣種；新麥19的檢測結果與前人[14]一致，不含Yr10、Yr15、Yr24基因，但在成株期對生理小種CRY32和CRY33表現(xiàn)較高抗性[14]，可能存在其他抗條銹基因。