鴿新城疫HB株水佐劑滅活疫苗的制備及免疫特性

李珮瑤，高晶萍，田 勇，徐明舉，王存連，利 凱，李 軍，蘭金蘋，張瑞華，徐 彤,

(1.河北北方學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000)

鴿新城疫是由鴿Ⅰ型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus Ⅰ, PPMV-Ⅰ)引起的常流行于鴿群的高接觸性傳染病，臨床主要表現(xiàn)為鴿群腸炎、下痢及扭頭轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀[1]。不同品種、不同年齡階段的鴿子都易感，日齡越小對該病的易感性越高[2]。鴿新城疫在鴿群中的傳播十分迅速，發(fā)病率和死亡率都十分高。我國于1985年12月和1986年1月由深圳及珠海拱北動物檢疫局從進(jìn)口鴿中檢測到鴿Ⅰ型副黏病毒[3-4]。近年來，陜西、山西、甘肅、新疆、河南等地又陸續(xù)有該病的流行[5-6]，并且該病的流行情況隨著賽鴿養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)模化的發(fā)展愈演愈烈。

近年來，由于廣泛的群眾基礎(chǔ)使賽鴿運(yùn)動得到了快速發(fā)展，而因集鴿這一特殊養(yǎng)殖模式導(dǎo)致賽鴿在前期抵抗力低、容易感染疾病發(fā)病死亡[7-8]。在導(dǎo)致賽鴿發(fā)病死亡的諸多因素中，鴿新城疫病毒感染是重要原因之一。由于缺乏針對鴿新城疫的疫苗，所以臨床中賽鴿免疫接種主要采用雞新城疫疫苗。盡管鴿新城疫病毒與雞新城疫病毒是同一屬病毒，但因兩者基因型及病原特性存在差異[9]，故雞新城疫疫苗不能有效保護(hù)和控制鴿新城疫的感染和流行。因此，針對鴿新城疫疫苗的研究與開發(fā)成為防治鴿新城疫的當(dāng)務(wù)之急。

集鴿這一飼養(yǎng)模式要求在短時間內(nèi)產(chǎn)生較高的抗體水平，以提供迅速有效的保護(hù)作用。由于油佐劑疫苗吸收速度慢，抗體產(chǎn)生時間較長，并且肌肉注射常常會影響賽鴿胸肌發(fā)育，甚至?xí)斐裳装Y，影響飛翔能力，導(dǎo)致比賽成績不佳。與之相比，水佐劑疫苗抗體產(chǎn)生速度快，在短時間內(nèi)可產(chǎn)生高水平的抗體，更適合賽鴿使用。目前，關(guān)于鴿新城疫水佐劑疫苗的報道較少，鑒于此,采用分離的鴿新城疫病毒HB株制備水佐劑疫苗，并對其滅活條件、安全性、毒性、最佳免疫劑量和抗體產(chǎn)生時間、免疫持續(xù)期和保護(hù)效果等進(jìn)行了檢測，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中賽鴿新城疫的免疫防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與供試動物 鴿新城疫病毒河北毒株(HB株)由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，于-80 ℃保存；SPF種蛋購于山東省濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司；30～40日齡、未經(jīng)任何免疫的雛鴿購于張家口市某肉鴿養(yǎng)殖戶。

1.1.2 主要試劑 雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原和陽性血清購于北京中越科技有限公司；水佐劑GEL 02 PR購于賽彼科特殊化學(xué)品有限公司；雞新城疫疫苗(LaSota株)購于吉林和元生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種毒的增殖 將病毒原液(稀釋前滴度為9.0 log2)用滅菌生理鹽水按1∶10 000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種于9～11日齡SPF雞胚，0.1 mL/胚。96 h收獲上述雞胚尿囊液，根據(jù)常規(guī)血凝試驗(yàn)測HA滴度，將病毒滴度在8.0 log2及以上的含病毒尿囊液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒滅活條件的篩選 將病毒離心，取上清混合后再次檢測病毒滴度，然后分裝，用不同含量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.30%)的甲醛和不同含量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)的二乙烯亞胺(BEI)在4 ℃和37 ℃的條件下滅活病毒，BEI在滅活結(jié)束后用過量硫代硫酸鈉終止滅活。在滅活8、16、24 h時取樣，進(jìn)行HA滴度檢測及無菌檢測及滅活效果檢測，以確定病毒最佳滅活條件。

1.2.3 疫苗制備 將購買的水佐劑GEL 02 PR于30 ℃下無菌混勻，然后將水佐劑與滅活的病毒按照1∶9的比例混勻，并在混勻終止前加入0.01%的硫柳汞防腐，即制成水佐劑滅活疫苗，將其分裝，密封好。

1.2.4 疫苗效力評價

1.2.4.1 物理性狀 將制備的水佐劑疫苗在4 ℃和室溫條件下放置90 d觀察性狀有無變化、分層情況。

1.2.4.2 安全性試驗(yàn) 將制備的水佐劑疫苗注射30～40日齡未經(jīng)免疫的雛鴿，確定其安全性。將20只供試雛鴿隨機(jī)分為4組，分別注射0.2、0.3、0.5、1.0 mL疫苗，每個劑量5只。觀察疫苗吸收是否良好、有無炎性反應(yīng)，是否有其他副作用，觀察21 d。

1.2.4.3 毒性試驗(yàn) 將20只供試雛鴿分為2組，即水佐劑疫苗組和對照組，每組10只。水佐劑疫苗組頸部皮下注射0.3 mL水佐劑疫苗，對照組注射同等劑量生理鹽水，每天稱量雛鴿體質(zhì)量，觀察15 d，記錄體質(zhì)量并根據(jù)其變化繪制生長曲線。

1.2.4.4 疫苗的最佳免疫劑量和抗體產(chǎn)生時間 將30只新城疫抗體呈陰性的雛鴿分為3組，每組10只，分別注射不同劑量(0.2、0.3、0.5 mL)水佐劑疫苗進(jìn)行免疫，在免疫后7、14、21、28、40 d翅靜脈采集血液，收集血清，檢測抗體水平，結(jié)果以log2表示，確定疫苗的最佳免疫劑量以及免疫后抗體產(chǎn)生的規(guī)律。

1.2.4.5 免疫持續(xù)期和保護(hù)試驗(yàn) 將60只未經(jīng)免疫的雛鴿隨機(jī)分為2組，水佐劑疫苗組、對照組各30只。水佐劑疫苗組按最佳免疫劑量頸部皮下注射水佐劑疫苗，對照組注射同等劑量生理鹽水。在免疫后30、90、180 d從水佐劑疫苗組、對照組各抽取10只肌肉注射0.2 mL鴿新城疫病毒進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊，觀察21 d，并記錄發(fā)病率、死亡率，根據(jù)以下公式計算保護(hù)指數(shù)(PI)：

1.2.4.6 對比試驗(yàn) 將30只新城疫抗體檢測呈陰性的雛鴿隨機(jī)分為3組，水佐劑疫苗組、LaSota組、對照組，每組10只，水佐劑疫苗組皮下注射水佐劑疫苗0.3 mL，LaSota組注射雞新城疫疫苗(LaSota株)0.3 mL，對照組相同途徑注射0.3 mL生理鹽水。

以上3組在免疫后7、14、21、28 d時采血，檢測抗體水平。在免疫28 d后進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊，肌肉注射0.2 mL HB株新城疫病毒，觀察記錄3組發(fā)病情況。

1.2.4.7 保存期試驗(yàn) 將水佐劑滅活疫苗分別保存于4 ℃和室溫(20 ℃左右)條件下，在保存0、30、60、90、120、150、180 d時，免疫供試雛鴿，皮下注射0.3 mL，免疫后觀察有無不良反應(yīng)，并于免疫后28 d采血檢測抗體水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 HB株新城疫病毒滅活條件的篩選

根據(jù)表1和表2可知，病毒滅活后的效價下降程度與滅活劑的用量、滅活溫度、滅活時間有關(guān)。在甲醛含量為0.05%時，病毒滅活后效價降低幅度較小，但病毒幾乎都未完全滅活并且菌檢可檢查出細(xì)菌；甲醛含量為0.10%，滅活時間為16 h，4 ℃和37 ℃條件下的病毒都被完全滅活，但在37 ℃條件下無細(xì)菌生長，4 ℃條件下仍有細(xì)菌；采用1.0%的BEI在滅活16 h時未達(dá)到滅活要求，滅活時間為24 h時，病毒可被完全滅活。隨著2種滅活劑含量越來越高，滅活后的病毒效價受到的影響越來越大，故最終選用0.10%甲醛在37 ℃條件下滅活16 h為最佳滅活條件。

表1 不同含量甲醛滅活HB株新城疫病毒的效果Tab.1 Results of different levels of formaldehyde inactivated HB strain Newcastle disease virus

注：“B”表示細(xì)菌生長情況，“+”表示有細(xì)菌生長，“-”表示無細(xì)菌生長；“I”表示病毒滅活情況，“Y”表示徹底滅活，“N”表示未徹底滅活。下同。

Note:“B” indicates bacterial growth, “+” means bacterial growth,and “-” means no bacterial growth;“I” indicates virus inactivation, “Y” means complete inactivation, and “N” means not completely inactivated.The same below.

表2 不同含量BEI滅活HB株新城疫病毒的效果

2.2 水佐劑疫苗效力評價

2.2.1 物理性狀 制備的水佐劑疫苗在4 ℃和室溫條件下保存90 d均無分層現(xiàn)象；疫苗呈無色、透明狀液體，均勻度好，黏度低。

2.2.2 安全性試驗(yàn) 注射不同劑量水佐劑滅活疫苗后并未對雛鴿產(chǎn)生不良影響，注射后雛鴿精神狀態(tài)良好，注射部位無結(jié)塊、腫脹現(xiàn)象。

2.2.3 毒性試驗(yàn) 從圖1雛鴿的生長曲線可知，水佐劑疫苗組雛鴿的生長狀況與對照組無明顯差異，表明該滅活疫苗對雛鴿生長發(fā)育無影響，具有安全無毒性。

圖1 雛鴿生長曲線Fig.1 Growth curve of young pigeons

2.2.4 最佳免疫劑量和抗體產(chǎn)生時間 根據(jù)表3可知，制備的水佐劑疫苗免疫后7 d可以檢測到抗體產(chǎn)生，21 d抗體水平可達(dá)到8.7 log2，28 d時達(dá)到頂峰(9.2 log2)，40 d仍有穩(wěn)定良好的抗體水平。0.2 mL注射劑量產(chǎn)生的抗體水平低于0.3 mL和0.5 mL組，0.3 mL組與0.5 mL組水平大致相同。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本和免疫效果，最終將該疫苗的最佳免疫劑量定為0.3 mL。

表3 水佐劑疫苗的最佳免疫劑量和抗體產(chǎn)生時間(log2)Tab.3 Optimal immunization dose and antibody production time for water adjuvant vaccine(log2)

2.2.5 免疫持續(xù)期和保護(hù)試驗(yàn) 從表4可以看出，制備的水佐劑疫苗在免疫30 d后可以產(chǎn)生良好的抗體水平，抵擋強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)指數(shù)為100.0；在免疫90 d后，疫苗的保護(hù)指數(shù)仍在66.7。表明制備的水佐劑滅活疫苗的免疫持續(xù)期至少維持30 d，建議在首次免疫1個月后使用油佐劑疫苗進(jìn)行二免，以維持抗體水平。

表4 水佐劑疫苗的免疫持續(xù)期和保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of immune duration and protection test for water adjuvant vaccine

2.2.6 對比試驗(yàn) 從表5中可知，制備的水佐劑疫苗產(chǎn)生的抗體水平高于雞新城疫疫苗(LaSota株)，制備的水佐劑疫苗在強(qiáng)毒攻擊時的保護(hù)率為100%，雞新城疫疫苗(LaSota株)在抗體水平達(dá)到6.7 log2時的保護(hù)率僅為30%。對照組全部感染發(fā)病。

表5 水佐劑疫苗與雞新城疫疫苗(LaSota株)的對比試驗(yàn)結(jié)果(log2)Tab.5 Comparison test results between water adjuvant vaccine and chicken Newcastle disease vaccine(LaSota strain)(log2)

2.2.7 保存期試驗(yàn) 由表6可知，水佐劑疫苗在4 ℃條件下保存180 d仍可產(chǎn)生良好的免疫水平；在室溫(20 ℃)條件下保存90 d產(chǎn)生的免疫水平較為穩(wěn)定，保存120 d時免疫后抗體水平開始降低。所以，建議疫苗在4 ℃條件下的保存期為180 d，在室溫(20 ℃)條件下保存期為90 d，不超過120 d。

表6 水佐劑疫苗的保存期試驗(yàn)結(jié)果(log2)Tab.6 The water adjuvant vaccine shelf life test results(log2)

3 結(jié)論與討論

由于目前沒有篩選出鴿新城疫弱毒株，因此，用分離毒株制備滅活疫苗成為必然選擇。然而病毒的滅活受到滅活劑種類、濃度、滅活溫度、時間等影響。一般來說，隨著滅活劑濃度和滅活溫度增高，病毒所需滅活時間縮短；隨著滅活時間的延長、滅活劑濃度和滅活溫度增高，病毒滅活后的效價會降低。因此，在保證疫苗的安全性和免疫原性的情況下，應(yīng)盡量選擇低濃度、較低溫度、短時間的滅活條件。本研究采用甲醛和BEI兩種滅活劑以及不同的滅活劑量、溫度、滅活時間對該病毒的最佳滅活條件進(jìn)行了摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BEI對鴿新城疫病毒的滅活效果較差，低含量的BEI無法徹底滅活病毒。KING等[10]研究發(fā)現(xiàn)，0.01 mol/L的BEI可將病毒徹底滅活且對其效價影響不大，這與本研究結(jié)果差異較大，原因有待考證。而使用甲醛滅活既能保證病毒的免疫原性又能保證安全，最終確定該病毒的最佳滅活條件為使用0.10%的甲醛在37 ℃條件下滅活16 h。徐守振等[11]發(fā)現(xiàn)，采用0.10%～0.20%的甲醛在37 ℃條件下滅活22～24 h可將新城疫病毒徹底滅活，這與本研究的最佳滅活條件相近。

本研究將滅活后的病毒制備成水佐劑疫苗，并對該疫苗進(jìn)行了效力評價。物理性狀檢測合格后注射1日齡乳鴿，對其生長發(fā)育并無影響，并且免疫35日齡雛鴿后沒有不良反應(yīng)，表明制備的疫苗安全無毒副作用。然后對疫苗免疫后的抗體產(chǎn)生規(guī)律進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)免疫后7 d已經(jīng)有抗體產(chǎn)生，28 d達(dá)到頂峰，在短時間內(nèi)即可產(chǎn)生較高水平的抗體。王曉麗等[12]采用鴿新城疫NJ株制備相關(guān)油佐劑滅活疫苗，免疫后抗體產(chǎn)生規(guī)律與本試驗(yàn)的水佐劑疫苗相似，但在短時間內(nèi)本試驗(yàn)中的水佐劑滅活疫苗抗體水平更高，更適用于賽鴿使用。在免疫后30 d進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊時，制備的水佐劑疫苗的保護(hù)指數(shù)為100.0，免疫后90 d保護(hù)指數(shù)為66.7，表明制備的水佐劑疫苗免疫后可在短時間提供有效的抗體保護(hù)，并且至少可維持1個月。

與雞新城疫疫苗(LaSota株)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，制備的水佐劑疫苗產(chǎn)生的抗體水平高，在強(qiáng)毒攻擊時9.0 log2水平的鴿新城疫疫苗的保護(hù)率是100%，6.7 log2水平的雞新城疫疫苗保護(hù)率只有30%，表明鴿新城疫滅活疫苗較雞新城疫滅活疫苗更適宜用于鴿新城疫的防控，分析原因可能是雞新城疫與鴿新城疫雖然相似，但兩者在致病性和抗原性有差異[13-14]，導(dǎo)致相似的抗體水平無法提供相似的保護(hù)率。葉賀佳等[15]將鴿源新城疫病毒制備成滅活疫苗免疫后進(jìn)行交叉攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在受到鴿源新城疫強(qiáng)毒攻擊時，鴿新城疫疫苗保護(hù)率比雞新城疫疫苗高50%。張俊平等[16]也發(fā)現(xiàn)，雞新城疫疫苗和鴿新城疫疫苗免疫鴿后產(chǎn)生的抗體水平無明顯差異，但在后續(xù)的攻毒試驗(yàn)中，鴿新城疫疫苗的保護(hù)效果明顯優(yōu)于雞新城疫疫苗。盡管本研究的鴿新城疫水佐劑疫苗在一定群體試驗(yàn)中具有較好的免疫效果，但是仍需后期進(jìn)行大量的田間試驗(yàn)，以期能夠?yàn)榕R床賽鴿新城疫的防控提供參考。