同時(shí)性結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因突變的一致性分析

林 奇，周鵬揚(yáng)，莊奧博，許劍民

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科，上海 200032

約25%的結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)患者在首診時(shí)即發(fā)現(xiàn)有同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移，15%～25%的患者會(huì)發(fā)生異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移[1-2]。無(wú)法手術(shù)切除的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(colorectal liver metastasis, CRLM)患者的中位生存時(shí)間僅為2.3～21.3個(gè)月[3]，而手術(shù)切除是患者獲得治愈的唯一途徑，約25%～50%的患者獲得手術(shù)切除后能存活超過(guò)5年[2, 4-5]。但是，即使獲得R0切除的患者也有超過(guò)2/3會(huì)在2年內(nèi)再次復(fù)發(fā)，從而無(wú)法獲得長(zhǎng)期生存[1, 6-7]。

轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)在臨床表現(xiàn)和生物學(xué)方面均存在高度異質(zhì)性[8]，因此需要對(duì)患者進(jìn)行分層治療。目前，包括肝轉(zhuǎn)移灶大小和數(shù)目、原發(fā)灶術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的間隔時(shí)間、糖類抗原(CEA)水平和原發(fā)灶分期在內(nèi)的臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(clinical risk score, CRS)已無(wú)法精確判斷術(shù)后mCRC復(fù)發(fā)率和決定手術(shù)選擇[9-11]。因此，有必要納入更多的分子標(biāo)志物，以提高療效預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

KRAS基因作為RAS基因家族(包括KRAS、NRAS和HRAS)的成員，在上皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)信號(hào)通路的下游發(fā)揮作用，促進(jìn)mCRC的發(fā)生和進(jìn)展[12-13]。32%～40%的mCRC腫瘤組織中存在KRAS突變，其中85%～90%的突變位于密碼子12和13，密碼子61和146各占5%[12]。目前KRAS突變已成為不能獲得抗EGFR治療療效的標(biāo)志[12-15]。同時(shí)，已有研究[9, 16-17]表明KRAS的突變還可以作為CRLM切除術(shù)后的預(yù)后因素。但是目前缺乏對(duì)于初始可切除同時(shí)性結(jié)直腸癌肝(synchronous colorectal liver metastases，SCRLM)轉(zhuǎn)移同期切除術(shù)后的預(yù)后研究。本研究比較了SCRLM患者原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因突變的差異，同時(shí)分析了KRAS突變對(duì)于初始可切除SCRLM患者同期切除術(shù)后預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 入組標(biāo)準(zhǔn) 收集2003年7月至2013年7月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行同期切除的139例同時(shí)性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的臨床資料。入組標(biāo)準(zhǔn)[18]：(1)原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶初始可以切除，肝外轉(zhuǎn)移灶可獲得R0切除；(2)術(shù)后肝容量≥ 50%；(3)保留肝臟解剖功能。術(shù)前接受過(guò)肝切除或者射頻消融治療的患者排除出組。所有患者術(shù)前均經(jīng)結(jié)直腸多學(xué)科團(tuán)隊(duì)根據(jù)患者的一般情況和檢查結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，決定具體治療方案。具體手術(shù)由固定的結(jié)直腸外科和肝外科手術(shù)小組共同完成。

1.2 數(shù)據(jù)收集及隨訪 患者的基本情況、臨床病理數(shù)據(jù)、手術(shù)過(guò)程、手術(shù)死亡率以及術(shù)后短期療效(術(shù)后并發(fā)癥)和長(zhǎng)期療效(術(shù)后生存情況)的數(shù)據(jù)和資料均錄入結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)庫(kù)。由專職人員負(fù)責(zé)隨訪，每半年隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2014年12月31日。隨訪采用門診、電話、書信形式。隨訪內(nèi)容包括腫瘤指標(biāo)、胸X線片、彩超、CT和MRI等，必要時(shí)行PET-CT檢查。無(wú)瘤生存時(shí)間(disease-free survival, DFS)是自手術(shù)切除至發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間；總生存時(shí)間(overall survival, OS)是自手術(shù)切除至最后1次隨訪或因該疾病死亡的時(shí)間。

1.3 基因突變檢測(cè) 選取結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶石蠟標(biāo)本，采用基因科技(上海)有限公司“GTpure FFPE組織DNA提取試劑盒”，從石蠟切片中抽提基因組，制備DNA模板，PCR擴(kuò)增后行Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序。檢測(cè)KRAS基因12、13、61和146密碼子突變情況[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)(或校正χ2檢驗(yàn))，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶突變率的差異采用配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon)。存活率采用壽命表法進(jìn)行推算,用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用log-rank法進(jìn)行比較。多因素分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 患者的臨床病理特征 139例行結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶同期切除患者中58.3%(81/139)的患者為男性，60.0%(89/139)的患者年齡小于60歲，69.8%(97/139)的患者腫瘤原發(fā)部位在結(jié)腸，肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目為1.0～7.0(1.85±1.14)個(gè)，最大轉(zhuǎn)移灶的直徑為(3.79±2.32) cm (0.5～15 cm，表1)。

2.2 手術(shù)方式及術(shù)后并發(fā)癥 139例患者均獲得了原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶R0切除，28.1%(39/139)的患者出現(xiàn)并發(fā)癥，發(fā)生率較高的是少量腹腔積液(7.2%，10/139)，膈下積液(5.8%，8/139)，胸腔積液(5.0%，7/139)，并發(fā)癥較重的為膽漏(1.4%，2/139)，以及吻合口漏(1.4%，2/139)，這些并發(fā)癥均經(jīng)胸腹腔引流、抗炎支持治療等非手術(shù)治療措施獲得治愈或明顯緩解。

表1 KRAS基因狀態(tài)和臨床病理特征的相關(guān)性

a因2例KRAS野生型患者未查CEA，僅納入137例分析

2.3 KRAS突變?cè)谠l(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的一致性分析及其與臨床病理因素的關(guān)系 139例患者的原發(fā)灶中，KRAS突變占28.8%(40/139)，其中22.3%(31/139)為密碼子12突變，6.5%(9/139)為密碼子13突變。原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶均完成KRAS突變檢測(cè)者有95例(44例患者因資料不全未完成相應(yīng)配對(duì)檢測(cè))，28例患者原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中均有突變，其突變位完全一致；均無(wú)突變者65例；僅有2例患者原發(fā)灶中無(wú)突變，而在轉(zhuǎn)移灶中檢測(cè)到了KRAS突變。采用配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶[29.5%(28/95)]和轉(zhuǎn)移灶[31.6%(30/95)]的突變率，差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.157)。

經(jīng)過(guò)χ2檢驗(yàn)，KRAS的突變和年齡、性別、原發(fā)灶位置、組織學(xué)類型、腫瘤分化、T分期、N分期、血管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)、肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目、肝轉(zhuǎn)移灶最大直徑以及CEA水平等臨床病理因素之間均無(wú)顯著相關(guān)性(表1)。

2.4 生存分析 截至隨訪日期，139例患者的5年OS為50.0%，5年DFS為36.0%。其中28.8%(40/139)的患者已經(jīng)死亡，49.6%(69/139)的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，35.3%(49/139)的患者僅有肝內(nèi)復(fù)發(fā)，6.5%(9/139)的患者僅有肺內(nèi)轉(zhuǎn)移。Kaplan-Meier曲線生存分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，KRAS突變野生型患者OS沒有顯著差異(P=0.213)，KRAS突變患者的DFS明顯短于野生型患者(P=0.041)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移灶數(shù)≥ 4(P=0.005)和KRAS突變(P=0.012)是短DFS的獨(dú)立預(yù)后因素(表2)。

表2 DFS相關(guān)因素分析

圖1 KRAS突變和OS及DFS的相關(guān)性

3 討 論

同期切除結(jié)直腸原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶曾被認(rèn)為會(huì)增加手術(shù)并發(fā)癥和圍手術(shù)期死亡率[19-20]，但是隨著手術(shù)、麻醉和重癥監(jiān)護(hù)等技術(shù)的進(jìn)步，近年來(lái)肝切除(包括半肝切除)的并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率逐漸下降，同期切除原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶逐漸得到了開展[4, 21-23]。和分期切除相比，同期切除后5年OS和DFS也無(wú)明顯差異[3-4, 24]。同期切除不僅能減少住院費(fèi)用和減輕患者二次手術(shù)的精神負(fù)擔(dān)，重要的是避免腫瘤進(jìn)展或化療導(dǎo)致的肝損傷貽誤手術(shù)時(shí)機(jī)[3]。本研究結(jié)果顯示：圍手術(shù)期死亡率為0%，雖然28.1%的患者出現(xiàn)了術(shù)后并發(fā)癥，但均經(jīng)非手術(shù)治療后獲得治愈或明顯緩解，充分說(shuō)明同期切除結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是安全可行的。同時(shí)，這些患者的5年OS達(dá)到了50.0%，5年DFS為36.0%，這些生存數(shù)據(jù)也從腫瘤學(xué)角度說(shuō)明同期切除的可行性。但是肝轉(zhuǎn)移灶術(shù)后的高復(fù)發(fā)率(本研究復(fù)發(fā)率為49.6%)仍然是外科醫(yī)生面臨的難題。既往的臨床病理因素評(píng)估體系已經(jīng)不能精確判斷預(yù)后，需要從分子水平尋找更多的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，用于篩選病例，避免不必要的手術(shù)。

目前KRAS突變已成為不能獲得抗EGFR治療療效的標(biāo)志[12-15]，臨床意義重大。但是因?yàn)槟[瘤的高異質(zhì)性，還不能確定原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間KRAS突變率是否存在差異。本研究結(jié)果顯示：原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間KRAS突變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)原發(fā)灶中基因突變的檢測(cè)可以代表轉(zhuǎn)移灶中基因突變情況，這和既往的一些研究[25-28]結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，2例患者原發(fā)灶中無(wú)突變，轉(zhuǎn)移灶中檢測(cè)到了KRAS突變。Vakiani等[27]研究表明僅有2.4%(2/84)的患者在原發(fā)灶中KRAS無(wú)突變，而在轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)突變，且研究者懷疑可能由多原發(fā)腫瘤導(dǎo)致；也有研究中多達(dá)6%(5/83)的患者原發(fā)灶中存在KRAS突變，而在轉(zhuǎn)移灶中未發(fā)現(xiàn)突變[25]。而研究[28]發(fā)現(xiàn)，11.3%的mCRC患者原發(fā)灶腫瘤為KRAS突變型，而轉(zhuǎn)移灶為野生型。這些研究充分說(shuō)明了原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性。另外靶向治療可導(dǎo)致KRAS基因型的改變[28]，這提醒臨床治療效果不佳時(shí)，需要考慮行病灶的重新穿刺活檢或液態(tài)活檢進(jìn)一步明確基因狀態(tài)，適時(shí)調(diào)整治療方案。本研究的缺陷為：對(duì)于存在多個(gè)轉(zhuǎn)移灶的患者，沒有檢測(cè)所有轉(zhuǎn)移灶的突變情況。

目前已有一些研究得出KRAS突變和肝臟轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)后短OS[16, 29-31]和DFS[16-17, 29, 31-34]相關(guān)，同時(shí)KRAS突變是短OS[16, 30, 35-36]和DFS[31, 33-35]的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)KRAS突變和短DFS相關(guān)，且是DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，表明KRAS突變的患者術(shù)后容易復(fù)發(fā)，在決定同期手術(shù)決策時(shí)需要考慮KRAS狀態(tài)。