• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乙型肝炎病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    2015-05-04 13:44:38顏彩玲彭仙娥吳云麗陳婉南
    關(guān)鍵詞:脂類細(xì)胞株脂質(zhì)

    顏彩玲,彭仙娥,吳云麗,林 旭,陳婉南

    乙型肝炎病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    顏彩玲,彭仙娥,吳云麗,林 旭,陳婉南

    目的 從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)對(duì)人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 方法 以HBV細(xì)胞株或以1.2倍體HBV基因組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法驗(yàn)證人肝癌細(xì)胞載脂蛋白AI(apolipoprotein A-I,ApoAI)、載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD 2)、NADPH脫氫酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1,NQO 1),以及肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein 1,F(xiàn)ABP 1)和乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT 2)等脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果 HBV細(xì)胞株或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV均使人肝癌細(xì)胞SOD 2、NQO 1基因的mRNA和蛋白表達(dá)量下調(diào),F(xiàn)ABP 1基因的mRNA和蛋白表達(dá)量上調(diào)。結(jié)論 HBV可影響人肝癌細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá),為HBV致肝細(xì)胞脂肪變機(jī)制的深入研究打下良好基礎(chǔ)。

    乙型肝炎病毒;脂類代謝;肝細(xì)胞

    近年來,乙型肝炎病毒感染與肝細(xì)胞脂肪變(hepatocellular steatosis)的關(guān)系引起了學(xué)者們的關(guān)注,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探討[1-2]。本課題組采用雙向電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)分析RHBV-3細(xì)胞株(含1.2倍體HBV基因組重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株)和RepSal-1細(xì)胞株(含對(duì)照空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株)蛋白表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn),HBV對(duì)HepG2細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響涉及一大類脂代謝相關(guān)蛋白的改變,包括兩種載脂蛋白:載脂蛋白AI(apolipoprotein A-I,ApoAI)、載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE),與兩種抗氧化蛋白:超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD 2)、NADPH脫氫酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1,NQO 1)表達(dá)減少;以及肝型脂肪酸結(jié)合蛋白1(fatty acid binding protein 1,F(xiàn)ABP 1)和乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT 2)表達(dá)增高[3]。現(xiàn)有研究表明脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的異常與肝細(xì)胞脂肪變存在一定的聯(lián)系[4]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證HBV對(duì)上述脂類相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,以探討其作為HBV致肝細(xì)胞脂肪變作用機(jī)制中分子標(biāo)志物的可能性,為HBV致肝細(xì)胞脂肪變作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供線索。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞 重組質(zhì)粒pRep-HBV為1.2倍體B基因型HBV基因組克隆于真核表達(dá)載體pRep10(Invitrogen公司),對(duì)照質(zhì)粒pRepSal為pRep10質(zhì)粒去除表達(dá)盒得到;RepSal-1與RHBV-3細(xì)胞株為pRepSal與pRep-HBV質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并經(jīng)潮霉素篩選獲得,后者能穩(wěn)定表達(dá)HBV表面抗原、e抗原,分泌病毒顆粒并在細(xì)胞中持續(xù)復(fù)制[5]。以上質(zhì)粒與細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存。肝癌細(xì)胞株Huh7、YY及HepG2購自上海細(xì)胞庫。

    1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清、Trizol試劑購自Invitrogen公司。實(shí)時(shí)定量PCR引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix試劑盒購自Stratagene公司。FuGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑、CDP-Star化學(xué)發(fā)光顯色底物購自Roche公司。RIPA 蛋白裂解液(強(qiáng))和BCA蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白購自江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所。兔抗人-FABP 1抗體購自Abcam公司;兔抗人-ApoAI抗體、羊抗人-ACAT 2抗體、羊抗人-SOD 2抗體、鼠抗人-NQO 1抗體、鼠抗人-ApoE抗體、鼠抗人-β-tubulin抗體、驢抗羊IgG-AP、羊抗鼠IgG-AP、羊抗兔 IgG-AP均購自Santa Cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞株復(fù)蘇后以含250 μg/mL Hygromycin B、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),使用前每株細(xì)胞各接種2.5×106個(gè)細(xì)胞到60 mm培養(yǎng)皿。HepG2、Huh7、YY細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前分別按6×105細(xì)胞/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,20 h后取3 μg pRep-HBV和相同分子數(shù)的pRepSal質(zhì)粒,以FuGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞,具體操作見說明書。

    1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用Trizol試劑,將接種后48 h的RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞,或轉(zhuǎn)染后48 h的HepG2、Huh7、YY細(xì)胞提取總RNA。RNA提取過程及總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA均按試劑盒操作說明進(jìn)行。熒光定量PCR的反應(yīng)體系如下:正、負(fù)引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ROX Reference Dye 0.375 μL ,Brilliant II SYBR Green QPCR master mix 12.5 μL,模板cDNA 2 μL,加水補(bǔ)至25 μL,每份樣品、每個(gè)目的基因做3個(gè)復(fù)孔;反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃,10 min;變性95 ℃,30 s;擴(kuò)增60 ℃,1 min;共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。各目的基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物序列見表1。對(duì)目的基因的差異表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量:每份模板、每個(gè)目的基因的3個(gè)復(fù)孔擴(kuò)增得到Ct值(熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)),取其平均值得到一個(gè)平均Ct值;每份模板的目的基因的平均Ct值減去該模板內(nèi)參基因(GAPDH)的平均Ct值,得到ΔCt值;將HBV表達(dá)細(xì)胞(RHBV-3或pRep-HBV瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞)的ΔCt值減去對(duì)照組(RepSal-1細(xì)胞或pRepSal瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞)的ΔCt值,得到ΔΔCt值;每個(gè)目的基因在該HBV表達(dá)的模板中的平均相對(duì)含量為2-ΔΔCt,相應(yīng)對(duì)照組該值為1。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,對(duì)提取的RNA分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值,并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

    表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

    1.2.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將接種后48 h的RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞,或轉(zhuǎn)染后48 h的HepG2、Huh7、YY細(xì)胞以冰預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞,加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑PMSF)裂解細(xì)胞,獲得細(xì)胞總蛋白并使用BCA蛋白定量試劑盒定量。取等量20 μg蛋白,15% SDS-PAGE電泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,以5% BSA封閉過夜。ApoAI抗體、ACAT2抗體、SOD2抗體、NQO1抗體、ApoE抗體分別以5% BSA作1∶200稀釋,F(xiàn)ABP1抗體以5% BSA作1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜,相應(yīng)的二抗分別以5% BSA作1∶1 000稀釋,室溫孵育2 h,CDP-Star化學(xué)發(fā)光法曝光并顯影于X光膠片。β-tubulin作為內(nèi)參照。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,將掃描獲得的灰度值取平均值,并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,針對(duì)同一目的基因,HBV表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照的比較分析采用單樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析目的基因mRNA水平變化 本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中通過雙向電泳測(cè)定RHBV-3和 RepSal-1兩株細(xì)胞總蛋白質(zhì)的差異表達(dá)情況,并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF質(zhì)譜)鑒定出50種差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中包含6種脂類代謝相關(guān)蛋白:ApoAI,ApoE,SOD 2,NQO 1表達(dá)降低,F(xiàn)ABP 1和ACAT 2表達(dá)增高。本研究首先以實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證上述6種基因轉(zhuǎn)錄水平差異情況,提取1.2倍體HBV基因組穩(wěn)定表達(dá)或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以特異性引物擴(kuò)增目的基因,相對(duì)定量目的基因的差異表達(dá)情況,結(jié)果顯示(圖1):與對(duì)照細(xì)胞株相比,RHBV-3細(xì)胞株中FABP1的表達(dá)量增高8.6倍,SOD 2、NQO 1及ApoE的表達(dá)量分別降低68%,60%和64%,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ApoAI和ACAT 2的表達(dá)量在RHBV-3細(xì)胞株與對(duì)照RepSal-1細(xì)胞株中的表達(dá)差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示(圖2),與pRepSal轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2、Huh7及YY細(xì)胞中,F(xiàn)ABP 1表達(dá)量分別升高7.3倍,7.2倍,6.3倍;ACAT 2的表達(dá)量分別升高7.8倍,5.5倍,8倍;SOD 2表達(dá)量分別降低72%,60%,48%;NQO 1表達(dá)量分別降低68%,60%,67%;ApoE表達(dá)量分別降低75%,10%,33%,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ApoAI的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    * Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

    圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞目的基因mRNA表達(dá)情況

    Fig.1 Relative expression level of different genes in RHBV-3 and RepSal-1 cells by real-time PCR

    * Compared to the cells transfected with pRepSal,P<0.05.

    圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、YY細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pRep-HBV和pRepSal后目的基因mRNA表達(dá)情況

    Fig.2 Relative expression level of target genes in HepG2, Huh7 and YY Cells transfected with pRep-HBV or pRepSal by Real-time PCR

    2.2 Western Blot驗(yàn)證脂類代謝相關(guān)蛋白差異表達(dá) 提取RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞總蛋白,以特異性抗體Western Blot檢測(cè)上述6種蛋白的差異表達(dá)情況,條帶經(jīng)灰度掃描后,用β-tubulin的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,分析結(jié)果顯示(圖3),與RepSal-1細(xì)胞相比,RHBV-3細(xì)胞ApoE蛋白表達(dá)量下調(diào)66%,NQO1蛋白表達(dá)量下調(diào)35%,ApoAI蛋白表達(dá)量下調(diào)72%,SOD 2蛋白表達(dá)量下調(diào)54%,F(xiàn)ABP 1蛋白表達(dá)量上調(diào)2.14倍,ACAT 2表達(dá)變化不明顯。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pRep-HBV、pRepSal的細(xì)胞提取蛋白,重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4):與pRepSal轉(zhuǎn)染組相比較,轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2、Huh7及YY 3株細(xì)胞中,NQO 1蛋白表達(dá)量均下調(diào),分別下調(diào)35%,50%,45%;轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2和Huh7細(xì)胞中ApoAI蛋白表達(dá)量下調(diào),分別下調(diào)33%和38%,但在YY細(xì)胞中的表達(dá)無明顯變化;SOD 2蛋白表達(dá)量在3株細(xì)胞均下調(diào),分別下調(diào)36%,60%,44%;FABP 1蛋白表達(dá)量均上調(diào),上調(diào)倍數(shù)分別為2.13、1.51和1.55倍;轉(zhuǎn)染pRep-HBV質(zhì)粒的HepG2、Huh7和YY細(xì)胞中ACAT 2和ApoE蛋白表達(dá)量均無明顯變化。

    * Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

    圖3 Western bolt檢測(cè)RHBV-3和RepSal-1細(xì)胞株ACAT 2、ApoE、NQO 1、ApoAI、SOD 2及FABP 1的表達(dá)

    Fig.3 Western blot analysis of ACAT 2, ApoE, NQO 1, ApoAI, SOD 2 and FABP 1 protein expression in RHBV-3 and RepSal-1 cell lines

    3 討 論

    本研究在前期雙向電泳結(jié)果的基礎(chǔ)上,通過1.2倍體HBV基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,HBV對(duì)ApoAI、ApoE、SOD 2、NQO 1、FABP 1、ACAT 2等6個(gè)脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,在6個(gè)脂類代謝相關(guān)蛋白中,SOD 2,NQO 1和FABP 1在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的分析結(jié)果與穩(wěn)定表達(dá)HBV蛋白的肝癌細(xì)胞株獲得的分析結(jié)果完全一致,其中SOD 2、NQO 1基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)下調(diào),F(xiàn)ABP 1基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)上調(diào),變化趨勢(shì)與雙向電泳分析結(jié)果一致[5]。提示SOD 2、NQO 1、FABP 1可能是HBV致肝細(xì)胞脂肪變分子機(jī)制中重要的標(biāo)志物,其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。本研究中HBV對(duì)ApoE、ApoAI和ACAT 2共3個(gè)基因表達(dá)水平的影響,在實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果不完全一致,可能原因?yàn)檗D(zhuǎn)錄水平和蛋白水平是基因表達(dá)調(diào)控的不同層次,蛋白表達(dá)水平受更多因素的影響,如mRNA的穩(wěn)定性,翻譯效率,修飾折疊和蛋白穩(wěn)定性等因素。

    氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1],SOD 2是線粒體中重要的抗氧化蛋白,是細(xì)胞內(nèi)清除反應(yīng)性氧化物(Reactive oxygen species,ROS)的主要物質(zhì)。有研究表明,NAFLD患者肝臟中的SOD活性降低、脂質(zhì)堆積,脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致丙二醛(malondialde-hyde,MDA)和4-羥基乙酸(4-hydroxyoneal,HNE)釋放,MDA和HNE通過共價(jià)鍵與蛋白結(jié)合可引起免疫性肝炎[6-7],SOD酶活性降低的ob/ob小鼠也更易發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎[8]。NQO 1是體內(nèi)一種重要的Ⅱ相反應(yīng)酶,以NAD(P)H為受體,可將NADH或NADPH的電子傳遞給已知或未知的內(nèi)源性底物及外源性的醌類及其衍生物,發(fā)生雙電子還原反應(yīng),生成低毒的氫醌類化合物[2]。有研究表明,與野生型小鼠相比,NQO 1基因剔除小鼠NAD(P)H在細(xì)胞內(nèi)堆積從而改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),表現(xiàn)為抑制磷酸戊糖途徑及加強(qiáng)外周組織脂肪動(dòng)員,從而導(dǎo)致其肝臟和血漿中甘油三酯含量增加,并出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象[3],胰島素抵抗與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)[9]。FABP 1可結(jié)合脂肪酸,對(duì)脂肪酸具有攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)功能,在肝臟的脂類轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演重要角色。有研究表明FABP 1基因剔除小鼠對(duì)脂肪酸攝入和利用能力缺陷,降低了生酮作用和脂蛋白的生成,減少了肝臟的脂肪變性[10]。在高脂飼養(yǎng)的小鼠非酒精性脂肪肝形成過程中則發(fā)現(xiàn)FABP 1的表達(dá)明顯增強(qiáng),并與肝臟脂肪變程度密切相關(guān)[11]。這些發(fā)現(xiàn)均提示,F(xiàn)ABP 1、NQO 1和SOD 2是參與肝臟脂質(zhì)代謝的重要基因,當(dāng)表達(dá)異常時(shí)可導(dǎo)致肝細(xì)胞某些功能的改變,如脂質(zhì)攝取增加、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙以及脂質(zhì)的β氧化受損,從而破壞了肝臟脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài),進(jìn)一步導(dǎo)致各種形式脂肪肝。

    本研究根據(jù)前期雙向電泳實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)了HBV對(duì)脂類代謝相關(guān)基因SOD 2、NQO 1、FABP 1的影響。而上述HBV對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響是由HBV編碼的表面抗原、核心抗原、e抗原及DNA聚合酶等蛋白共同作用的結(jié)果,或是由HBV中某個(gè)編碼蛋白引起的,以及其具體如何調(diào)節(jié)這些脂類代謝相關(guān)基因表達(dá),并導(dǎo)致最終的生物學(xué)效應(yīng)有待于進(jìn)一步的深入研究。

    [1]Zhong L, Liu F, Wang JC, et al. Experimental study on pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis[J]. Chin J Digest, 2006, 26(5): 324-326. DOI: 10.3760/j.issn:0254-1432.2006.05.010 (in Chinese) 鐘嵐,劉菲,王軍臣,等.非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制探討[J].中華消化雜志,2006,26(5): 324-326. DOI: 10.3760/j.issn:0254-1432.2006.05.010.

    [2]Day C. Non-alcoholic steatohepatitis (NASH): where are we now and where are we going?[J]. Gut, 2002, 50(5): 585-588. DOI: 10.1136/gut.50.5.585

    [3]Peng XE. The effect and possible mechanism of hepatitis B virus on nonalcoholic fatty liver disease[D]. Fuzhou: Fujian Medical University, 2009.(in Chinese) 彭仙娥.乙型肝炎病毒在非酒精脂肪肝發(fā)生中的作用及機(jī)制研究[D] .福州:福建醫(yī)科大學(xué),2009.

    [4]Gordon A, McLean CA, Pedersen JS, et al. Hepatic steatosis in chronic hepatitis B and C: predictors, distribution and effect on fibrosis[J]. J Hepatol, 2005, 43(1): 38-44. DOI: 10.1016/j.jhep.2005.01.031

    [5]Huang Q, Wang L, Bai S, et al. Global proteome analysis of hepatitis B virus expressing human hepatoblastoma cell line HepG2[J]. J Med Virol, 2009, 81(9): 1539-1550. DOI: 10.1002/jmv.21593

    [6]Varela NM, Quinones LA, Orellana M, et al. Study of cytochrome P450 2E1 and its allele variants in liver injury of nondiabetic, nonalcoholic steatohepatitis obese women[J]. Biol Res,2008, 41(1): 81-92.

    [7]Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes[J]. Free Radic Biol Med, 1991, 11(1): 81-128. DOI: 10.1016/0891-5849(91)90192-6

    [8]Laurent J, Paly E, Marche PN, et al. Early thymic T cell development in young transgenic mice overexpressing human Cu/Zn superoxide dismutase, a model of down syndrome[J]. Free Radic Biol Med, 2006, 40(11): 1971-1980. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2006.01.029

    [9]Oral EA, Simha V, Ruiz E, et al. Leptin-replacement therapy for lipodystrophy[J]. N Engl J Med, 2002, 346(8): 570-578. DOI: 10.1056/NEJMoa012437

    [10]Newberry EP, XieY, Kennedy S, et al. Protection against Western diet-induced obesity and hepatic steatosis in liver fatty acid-binding protein knockout mice[J]. Hepatology, 2006, 44(5): 1191-l205.DOI: 10.1002/hep.21369

    [11]Hajjou M, Norel R, Carver R, et al. cDNA microarray analysis of HBV transgenic mouse liver identifies genes in lipid biosynthetic and growth control pathways affected by HBV[J]. J Med Virol, 2005, 77(1): 57-65. DOI: 10.1002/jmv.20427

    Chen Wan-nan, Email: catherlin_2002@163.com

    Effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins in human hepatoma cell lines

    YAN Cai-ling,PENG Xian-e,WU Yun-li,LIN Xu,CHEN Wan-nan

    (KeyLaboratoryofMinistryofEducationforGastrointestinalCancer,KeyLaboratoryofFujianProvinceforTumorMicrobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China)

    In this study, we aimed to investigate the effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins both in mRNA and protein levels. To address these issues, six proteins, including apolipoprotein A-I (ApoAI), apolipoprotein E (ApoE), superoxide dismutase 2 (SOD2), NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 (NQO1), fatty acid binding protein 1 (FABP1) and acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2(ACAT2) in hepatoma cells either harboring HBV or transiently transfected with 1.2×length of HBV genome, were detected by real-time PCR or western blot analysis. Results revealed that HBV could down-regulate the expression of SOD2 and NQO1, while up-regulate the expression of FABP1, which suggested that HBV may interfere with the expression of lipid metabolism proteins, and attribute to hepatocellular steatosis.

    Hepatitis B virus; lipid metabolism; hepatocytes

    國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81271822);福建省教育廳科技項(xiàng)目(No. JK2009014);福建醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(No.2010BS004)聯(lián)合資助課題

    陳婉南,Email: catherlin_2002@163.com

    福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,“消化道惡性腫瘤”省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省腫瘤微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350108

    Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271822), the Science Project of the Education Department of Fujian Province (No. JK2009014), and the Research Fund for the Doctoral Program of Fujian Medical University (No. 2010BS004)

    10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.014

    R373.2

    A

    1002-2694(2015)06-0560-05

    2015-02-27;

    2015-05-27

    猜你喜歡
    脂類細(xì)胞株脂質(zhì)
    調(diào)脂類藥物治療冠心病研究進(jìn)展
    綠茶粉對(duì)清遠(yuǎn)麻雞血液脂類代謝的影響研究
    復(fù)方一枝蒿提取物固體脂質(zhì)納米粒的制備
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:36
    白楊素固體脂質(zhì)納米粒的制備及其藥動(dòng)學(xué)行為
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:19:53
    馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒在小鼠體內(nèi)的組織分布
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:26
    兩城鎮(zhèn)陶器的脂類殘留物分析
    東方考古(2016年0期)2016-07-31 17:45:44
    穩(wěn)定敲低MYH10基因細(xì)胞株的建立
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    穩(wěn)定抑制PAK2蛋白表達(dá)的HUH—7細(xì)胞株的建立
    成軍:從HCV入手,探索脂類代謝分子生物學(xué)新機(jī)制
    欧美 亚洲 国产 日韩一| 最近中文字幕2019免费版| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 99热网站在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人无遮挡网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 我要看黄色一级片免费的| 一区二区三区免费毛片| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | av专区在线播放| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日韩电影二区| 久久这里有精品视频免费| 插逼视频在线观看| 日日撸夜夜添| 美女内射精品一级片tv| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品.久久久| 国产亚洲5aaaaa淫片| 大码成人一级视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产免费福利视频在线观看| 色哟哟·www| 老司机影院成人| 国产色爽女视频免费观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩精品有码人妻一区| 午夜老司机福利剧场| 国产深夜福利视频在线观看| 九九在线视频观看精品| 亚洲国产精品专区欧美| 国产亚洲精品久久久com| av在线app专区| 亚洲经典国产精华液单| 少妇人妻 视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜老司机福利剧场| 美女福利国产在线| 免费观看性生交大片5| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美成人午夜免费资源| 成人美女网站在线观看视频| 男女无遮挡免费网站观看| 色5月婷婷丁香| 国产伦理片在线播放av一区| 九草在线视频观看| 午夜免费观看性视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品女同一区二区软件| av国产精品久久久久影院| 久久综合国产亚洲精品| 老司机影院成人| 日韩欧美精品免费久久| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品第二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品熟女久久久久浪| 国产成人精品久久久久久| av.在线天堂| 在线看a的网站| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久精品夜色国产| 少妇人妻精品综合一区二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| av在线观看视频网站免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品国产av蜜桃| www.av在线官网国产| 美女主播在线视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲av欧美aⅴ国产| 色哟哟·www| 亚洲精品第二区| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品久久久久久久久免| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 丰满人妻一区二区三区视频av| av卡一久久| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久久久久久久人人人人人人| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 五月天丁香电影| 在线观看免费视频网站a站| 久久免费观看电影| 中国三级夫妇交换| 爱豆传媒免费全集在线观看| 尾随美女入室| av天堂中文字幕网| 国产av精品麻豆| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 在线观看免费日韩欧美大片 | freevideosex欧美| 黄片无遮挡物在线观看| 赤兔流量卡办理| 久久狼人影院| 在线看a的网站| 丰满乱子伦码专区| 欧美日韩亚洲高清精品| av.在线天堂| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 观看免费一级毛片| 日日啪夜夜撸| 色视频在线一区二区三区| 久热久热在线精品观看| 日本免费在线观看一区| 国产视频首页在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 岛国毛片在线播放| 一本色道久久久久久精品综合| 女性被躁到高潮视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产极品粉嫩免费观看在线 | tube8黄色片| 妹子高潮喷水视频| 男女无遮挡免费网站观看| 国产男女超爽视频在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 人体艺术视频欧美日本| 久久99蜜桃精品久久| 成人国产麻豆网| 国产亚洲欧美精品永久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 日本午夜av视频| 高清av免费在线| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品一二三| 国产熟女午夜一区二区三区 | 丁香六月天网| 最新的欧美精品一区二区| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 好男人视频免费观看在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 天天操日日干夜夜撸| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品蜜桃在线观看| 91久久精品电影网| 日日爽夜夜爽网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 高清不卡的av网站| 日韩一区二区视频免费看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产探花极品一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 久久精品夜色国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产男女内射视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲av日韩在线播放| 欧美性感艳星| 又爽又黄a免费视频| 中文天堂在线官网| 视频中文字幕在线观看| 美女中出高潮动态图| 日韩av在线免费看完整版不卡| 色视频在线一区二区三区| 又爽又黄a免费视频| av网站免费在线观看视频| 青青草视频在线视频观看| 久久精品国产亚洲av天美| 人妻夜夜爽99麻豆av| 偷拍熟女少妇极品色| 97在线人人人人妻| 国产精品无大码| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 美女中出高潮动态图| 欧美日韩在线观看h| 精品国产国语对白av| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲怡红院男人天堂| 女性被躁到高潮视频| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲内射少妇av| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线观看免费视频网站a站| 精品久久久久久久久亚洲| 大香蕉97超碰在线| 国产欧美亚洲国产| av天堂久久9| 丝瓜视频免费看黄片| 男的添女的下面高潮视频| 日韩中字成人| 老司机亚洲免费影院| 在线播放无遮挡| 亚洲av成人精品一二三区| 乱系列少妇在线播放| 伦理电影大哥的女人| 2018国产大陆天天弄谢| 99久久人妻综合| 久久免费观看电影| av不卡在线播放| 亚洲无线观看免费| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 男女国产视频网站| 国产成人a∨麻豆精品| 国产乱来视频区| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲av二区三区四区| 国产真实伦视频高清在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 国产亚洲最大av| 免费观看的影片在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲无线观看免费| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品一二三区在线看| 99热这里只有是精品在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 午夜免费观看性视频| 免费大片黄手机在线观看| 免费观看在线日韩| 精品久久久久久电影网| 嫩草影院入口| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 老司机影院毛片| 多毛熟女@视频| 免费黄网站久久成人精品| 在线看a的网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 五月伊人婷婷丁香| 国产美女午夜福利| 人体艺术视频欧美日本| 成人漫画全彩无遮挡| 97在线人人人人妻| 国产av码专区亚洲av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲精品视频女| 777米奇影视久久| 嫩草影院新地址| 国产91av在线免费观看| 久久av网站| 少妇丰满av| 午夜福利视频精品| 免费黄频网站在线观看国产| 99视频精品全部免费 在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 卡戴珊不雅视频在线播放| 内地一区二区视频在线| 亚洲在久久综合| 日本wwww免费看| av国产精品久久久久影院| 在线观看www视频免费| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久久久久久大av| 久久午夜福利片| 国产高清三级在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 另类精品久久| 人人妻人人看人人澡| 午夜av观看不卡| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜免费观看性视频| 一级毛片 在线播放| 国产精品伦人一区二区| 日本与韩国留学比较| 国产淫片久久久久久久久| 女性生殖器流出的白浆| 久久青草综合色| 久久毛片免费看一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品久久久久久久久亚洲| 秋霞在线观看毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产在视频线精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 免费观看性生交大片5| 人人妻人人看人人澡| 国产男人的电影天堂91| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 嘟嘟电影网在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 插阴视频在线观看视频| 成年人免费黄色播放视频 | 成人美女网站在线观看视频| 亚洲综合色惰| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产综合精华液| 日韩一区二区视频免费看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 最新的欧美精品一区二区| 简卡轻食公司| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品酒店卫生间| 欧美性感艳星| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久久久大av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 美女中出高潮动态图| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 天堂8中文在线网| 日日啪夜夜爽| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产深夜福利视频在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 国产乱人偷精品视频| 大话2 男鬼变身卡| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久婷婷青草| av免费观看日本| 久久韩国三级中文字幕| 观看免费一级毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久这里有精品视频免费| 少妇人妻久久综合中文| 新久久久久国产一级毛片| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 久久人人爽人人片av| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 91久久精品电影网| 欧美xxxx性猛交bbbb| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av女优亚洲男人天堂| 男女免费视频国产| 国产淫片久久久久久久久| 国产免费福利视频在线观看| 曰老女人黄片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| a 毛片基地| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲av免费高清在线观看| 精品酒店卫生间| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久久久久成人| 嫩草影院新地址| 99re6热这里在线精品视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久欧美国产精品| 免费av中文字幕在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久视频综合| 亚洲色图综合在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产精品免费大片| 在线观看www视频免费| 色网站视频免费| 多毛熟女@视频| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲第一区二区三区不卡| 一二三四中文在线观看免费高清| 午夜福利,免费看| 久久久精品94久久精品| av在线老鸭窝| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产精品国产av在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩 亚洲 欧美在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 夫妻午夜视频| 中文字幕制服av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产精品熟女久久久久浪| 中国美白少妇内射xxxbb| 3wmmmm亚洲av在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区 | 男人狂女人下面高潮的视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产片特级美女逼逼视频| 我的老师免费观看完整版| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 最新的欧美精品一区二区| 99热全是精品| 69精品国产乱码久久久| 国产深夜福利视频在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美变态另类bdsm刘玥| 9色porny在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 国产成人a∨麻豆精品| 老司机影院毛片| 亚洲欧美清纯卡通| 成人毛片a级毛片在线播放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 这个男人来自地球电影免费观看 | 免费大片黄手机在线观看| 午夜福利视频精品| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 视频中文字幕在线观看| 黄色一级大片看看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日日啪夜夜撸| 亚洲国产成人一精品久久久| 我的女老师完整版在线观看| 精品视频人人做人人爽| 偷拍熟女少妇极品色| 黄色配什么色好看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 天堂中文最新版在线下载| av女优亚洲男人天堂| 这个男人来自地球电影免费观看 | 女人久久www免费人成看片| 好男人视频免费观看在线| 天堂中文最新版在线下载| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产91av在线免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 高清不卡的av网站| 日本-黄色视频高清免费观看| a 毛片基地| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲人成网站在线播| 国产成人免费观看mmmm| 免费人成在线观看视频色| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久国产精品麻豆| 午夜91福利影院| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲国产最新在线播放| 中文天堂在线官网| 一级av片app| 少妇人妻久久综合中文| 在线观看免费视频网站a站| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 下体分泌物呈黄色| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品免费大片| 亚洲欧美日韩东京热| 好男人视频免费观看在线| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲欧洲国产日韩| 国产免费又黄又爽又色| 18禁在线播放成人免费| 久久久久久久久久人人人人人人| 熟女人妻精品中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 少妇精品久久久久久久| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲av二区三区四区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99热这里只有精品一区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 欧美三级亚洲精品| 久久99热6这里只有精品| 亚洲av成人精品一二三区| 国产免费又黄又爽又色| 观看美女的网站| 欧美区成人在线视频| 国产精品一区www在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲国产色片| 免费观看a级毛片全部| 一个人免费看片子| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 麻豆成人午夜福利视频| 观看av在线不卡| tube8黄色片| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 久久免费观看电影| 久久久久久人妻| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线播放无遮挡| 精品卡一卡二卡四卡免费| 美女大奶头黄色视频| 麻豆乱淫一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日韩电影二区| 亚洲国产精品一区三区| 99视频精品全部免费 在线| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲av成人精品一二三区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 最近中文字幕高清免费大全6| 天堂中文最新版在线下载| 乱系列少妇在线播放| 最黄视频免费看| 日本欧美视频一区| 久久青草综合色| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品国产三级国产av玫瑰| h视频一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| 寂寞人妻少妇视频99o| 妹子高潮喷水视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲av免费高清在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久av网站| 最近手机中文字幕大全| av播播在线观看一区| 精品亚洲成a人片在线观看| 少妇的逼好多水| 精品一品国产午夜福利视频| 一级a做视频免费观看| 两个人免费观看高清视频 | 午夜影院在线不卡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 18禁动态无遮挡网站| 久久久久精品久久久久真实原创| 高清毛片免费看| 精品久久久久久电影网| 少妇精品久久久久久久| 午夜激情久久久久久久| av视频免费观看在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 偷拍熟女少妇极品色| 黄色配什么色好看| 99久久综合免费| 成人毛片60女人毛片免费| 久久久久久久国产电影| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美日韩综合久久久久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 少妇人妻久久综合中文| 美女中出高潮动态图| 国产亚洲最大av| 国内精品宾馆在线| 久久久久国产网址| videossex国产| .国产精品久久| 国内精品宾馆在线| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩一本色道免费dvd| 久久99热6这里只有精品| 国产一区二区三区av在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩伦理黄色片| 久热久热在线精品观看| 男人舔奶头视频| a 毛片基地| 伊人亚洲综合成人网| 久久人人爽人人片av| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久欧美国产精品| 在线观看国产h片| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av福利一区| 午夜视频国产福利| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品.久久久| 国产精品久久久久成人av| 日韩欧美 国产精品| 国产日韩欧美视频二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产色爽女视频免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产一区二区三区综合在线观看 | 黄片无遮挡物在线观看| 国产乱人偷精品视频| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久青草综合色| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| av不卡在线播放| 日日啪夜夜撸| 国产日韩欧美视频二区| 黄片无遮挡物在线观看| 国产在线一区二区三区精| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品国产成人久久av|