鎘脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物的影響

李磊 韓成 王宵宵

摘要：為了探究鎘脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物的影響，以抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號（HH1）及其親本非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63（MH63）為研究材料，設(shè)置不同Cd2+濃度（0、3.5、60.0、240.0 mg/kg）脅迫進行盆栽試驗。結(jié)果表明：與Cd0相比，Cd3.5處理對水稻農(nóng)藝性狀無顯著影響;Cd240.0處理顯著降低了株高、產(chǎn)量;與Cd0處理相比，Cd60.0和Cd240.0處理下HH1水稻根際土壤細菌群落組成中Proteobacteria（變形菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）的相對豐度顯著降低;MH63水稻中Acidobacteria的相對豐度顯著升高而Bacteroidetes（擬桿菌門）的相對豐度顯著降低。Cd脅迫顯著降低了水稻根際土壤細菌群落豐度及多樣性。環(huán)境因子分析顯示，Cd脅迫后水稻根際土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量的變化是影響根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的主要原因。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;細菌群落;根際土壤;鎘脅迫

中圖分類號： S154.3;Q938.1 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0282-06

近年來，鎘（Cd）污染愈加嚴(yán)重，使得農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展與人類的生態(tài)環(huán)境受到極大影響。Cd在土壤-植物系統(tǒng)中具有較強的遷移能力，可在作物中富集較高濃度的Cd，經(jīng)食物鏈傳遞進入人體危害人類健康[1]。調(diào)查顯示，廣西巖溶地區(qū)自然地理環(huán)境下土壤中的Cd濃度高達20 mg/kg，遠高于國家標(biāo)準(zhǔn)，且我國西南地區(qū)土壤中Cd含量普遍較高[2]。水稻是我國重要的糧食作物，同時也是極易富集Cd的作物。近年來，轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展，2017年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積高達1.9億hm2[3]。來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因是目前應(yīng)用最為廣泛的抗蟲基因。轉(zhuǎn)入Bt基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻，能夠殺死鱗翅類害蟲，大大降低化學(xué)殺蟲劑使用量[4]。在干旱、高鹽及重金屬等逆境脅迫下，與親本水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻具有生長優(yōu)勢[5-8]。如在Cd及高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗中抗氧化酶含量高于親本水稻[5-6];Li等研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度臭氧脅迫下，抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的光合作用、產(chǎn)量均高于親本水稻[7]，且能夠比親本水稻提前適應(yīng)低氮環(huán)境[8]。我國受重金屬污染較嚴(yán)重地區(qū)土壤Cd污染的平均值達到3.5 mg/kg，轉(zhuǎn)基因水稻在該濃度Cd脅迫下是否能正常生長、是否富集Cd目前尚不清楚;而在高Cd濃度脅迫下，與親本水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻是否具有更高的抗Cd能力也有待研究。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量循環(huán)的主要參與者，其活動是衡量生態(tài)系統(tǒng)各種功能是否正常的一個重要方面。土壤微生物群落與土壤重金屬污染之間的關(guān)系是國內(nèi)外環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點，重金屬污染能夠?qū)ν寥赖奈⑸锶郝洚a(chǎn)生影響，如降低土壤微生物量、可培養(yǎng)細菌菌落數(shù)量等[9]，同時重金屬污染能明顯改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[10]。轉(zhuǎn)基因作物能通過作物殘體、作物根系分泌物、作物花粉等方式改變根際土壤微環(huán)境，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)。關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落的影響，學(xué)者們展開了大量研究，但目前尚未有統(tǒng)一結(jié)論，有學(xué)者通過田間試驗監(jiān)測了轉(zhuǎn)基因水稻與其親本的多樣性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻對土壤根際微生物多樣性無顯著影響[11]，也有研究者比較了轉(zhuǎn)基因水稻和常規(guī)水稻根際細菌類群的數(shù)量和組成，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的根際土壤細菌數(shù)量少于非轉(zhuǎn)基因水稻，同時發(fā)現(xiàn)2個品種水稻土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不同[12]。根際土壤微生物是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評價的重要指標(biāo)之一，其群落豐度、組成易受根際微環(huán)境和水稻生長影響。但在Cd脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物的研究尚未見報道。

本研究以轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號（HH1）及其親本非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63（MH63）為研究對象，研究不同Cd濃度脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物的影響，為Cd污染地區(qū)水稻生長及環(huán)境安全評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與水稻種子

供試土壤為南京師范大學(xué)仙林校區(qū)（118°55′E、32°06′N）內(nèi)未經(jīng)人為干擾的自然生態(tài)系統(tǒng)土壤，去除表面植被、落葉及顆粒物后，采集0～15 cm深度土壤，室內(nèi)自然風(fēng)干后研磨過篩（2 mm），混勻后備用。土壤基本理化性質(zhì)如下：pH值為7.77，總氮含量為0.41 g/kg，總有機碳含量為2.7 g/kg，有機質(zhì)含量為4.65 g/kg，速效磷含量為3.53 mg/kg，銨態(tài)氮含量為0.28 mg/kg，該土壤中未檢測到Cd等重金屬污染。供試水稻為抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號（HH1）及其非轉(zhuǎn)基因親本水稻明恢63（MH63），水稻種子由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院提供。

1.2 盆栽試驗

盆栽試驗于2017年4—11月在南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進行。試驗選用高×直徑為15 cm×25 cm的聚氯乙烯（PVC）塑料桶作為水稻盆栽用桶，每桶稱取相當(dāng)于5.0 kg干土質(zhì)量的風(fēng)干土壤，添加自來水使得盆栽桶中淹水4～5 cm，并添加不同Cd濃度對土壤進行為期30 d的預(yù)處理，盆栽桶口覆膜以減少水分揮發(fā)，膜上有孔以維持通氣狀態(tài)。設(shè)置Cd0、Cd3.5、Cd60.0和Cd240.0共4個Cd濃度脅迫處理，Cd添加量分別為0、3.5、60.0、240.0 mg/kg，其中Cd3.5為我國受重金屬污染較嚴(yán)重地區(qū)土壤Cd污染的平均值，本研究具有實際意義;而Cd60.0和Cd240.0為土壤污染的極端值，擬研究在該高Cd脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻的抗Cd潛力。本研究中 Cd（Ⅱ） 的添加形態(tài)為CdCl2·2.5H2O，每個Cd濃度處理設(shè)置4個重復(fù)。重金屬預(yù)處理后，每桶施入N ∶ P ∶ K質(zhì)量比為 1 ∶ 1 ∶ 1 的復(fù)合肥作基肥，添加量為1.0 g/kg。將培養(yǎng)20 d后的HH1和MH63水稻幼苗分別移栽至桶中，每桶3株。水稻生長期間盆內(nèi)保持4～5 cm淹水層，于移栽后20 d追施尿素（0.05 g/kg），于移栽后30 d（水稻分蘗后期）進行曬田，其他管理措施與田間相同。成熟期破壞性采樣前，采用微電極分析儀（Unisense Microsensor Multimeter Version 2.01）測定各處理水稻盆栽水-土界面下3.8 cm處水稻根際土壤氧化還原電位值，測定方法參考文獻[13]。于移栽后112 d（水稻成熟期），對水稻植株進行破壞性采樣，并測定株高、生物量、籽粒重金屬含量等水稻農(nóng)藝性狀。采集土樣時，根據(jù)土壤在植物根系表面抖落和黏著程度來區(qū)分根際土和非根際土，具體采用抖落法收集[14]，將采集的水稻根際土壤的一部分立即裝入2 mL離心管中于 -80 ℃ 保存，用于微生物分子生態(tài)學(xué)分析;一部分根際土用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化指標(biāo)的測定 土壤pH值的測定采用蒸餾水浸提法，以2.5 mL ∶ 1 g的水土比浸提，振蕩10 min并靜置30 min，采用臺式pH計（Mettler-Toledo）測定懸濁液pH值。植物樣品使用HNO3+HClO4消煮后，采用火焰原子吸收分光光度法測定，土壤有效Cd含量采用土壤養(yǎng)分狀況系統(tǒng)研究法（ASI法）浸提后，采用火焰原子吸收分光光度法測定;土壤總有機碳（total soil organic，簡稱TOC）含量采用日本島津TOC儀測定;土壤有效磷（AP）含量采用氟化銨-鹽酸提取-鉬銻抗比色法測定;總氮含量采用凱氏蒸餾法測定，無機氮采用2 mol/L KCl按體積比5 ∶ 1水土比浸提，在20 ℃、200 r/min 條件下振蕩1 h后過濾，濾液無機氮含量用流動分析儀（Skalar San Plus，Netherlands）測定。檢測方法參考鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》[15]。

1.3.2 土壤總DNA的提取 土壤微生物群落與土壤微環(huán)境及營養(yǎng)水平密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，Cd3.5處理對根際土壤理化性質(zhì)幾乎無影響，因此僅選取Cd60.0和Cd240.0處理根際土壤，作為水稻根際土壤微生物的研究材料，并以Cd0處理為對照。土壤微生物總DNA采用FastDNA SPIN Kit for Soil（MP，Biomedicals，USA）試劑盒提取。稱取于-80 ℃保存的新鮮土壤樣品0.5 g，按試劑盒的試驗步驟提取土壤微生物總DNA。DNA溶液的濃度和純度采用NanoDrop 2000（Thermo，USA）進行測定，提取好的DNA樣品稀釋10倍后保存于 -20 ℃[16]。

1.3.3 實時熒光定量PCR分析 采用基于SYBR Green染料法的實時熒光定量PCR技術(shù)測定土壤細菌16S rRNA基因豐度來表征細菌群落豐度。測定儀器為Biorad CFX96 Real-time PCR system（Biorad，USA），SYBR Green試劑選用2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Japan），細菌16S rRNA基因擴增引物為515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）/907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）。反應(yīng)體系為20.0 μL，包括10.0 μL的2×SYBR Premix Ex Taq、上、下游引物（20 μmol/L）各0.3、1.0 μL樣品DNA模版（9.3～23.9 ng/μL）及8.4 μL滅菌超純水。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù);采用溶解曲線分析擴增產(chǎn)物的特異性，分析程序如下：溫度從65 ℃上升到95 ℃，每上升0.5 ℃采集1次熒光數(shù)據(jù)。以含有細菌16S rRNA基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA模版，根據(jù)質(zhì)粒濃度和阿伏伽德羅常數(shù)計算該基因的拷貝數(shù)，分別以10倍梯度稀釋各模板，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其濃度范圍為9.61×102～9.61×108 copies/μL。每個樣品做3個技術(shù)重復(fù)，擴增效率為99.6%（R2為0.992）。每輪反應(yīng)設(shè)置3個無模板陰性對照。

1.3.4 高通量測序分析 16S rRNA基因擴增與Illumina Hiseq高通量測序分析：16S rRNA基因擴增的引物采用515F/907R（V4～V5區(qū)）。高通量測序委托廣東美格基因有限公司執(zhí)行，測序平臺為Illumina Hiseq 2500。測序數(shù)據(jù)處理：采用FLASH（v1.2.7，https：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）軟件對每對PE reads進行拼接，將成對的reads拼成1條序列，最小的overlap（重疊）長度設(shè)置為10 bp，拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.1，過濾不符合的Tags（標(biāo)簽），獲得原始的拼接序列。利用Mothur軟件對拼接后的序列進行質(zhì)量控制及過濾，最終得到有效的拼接片段。利用USEARCH軟件（v8.0.1517，http：//www.drive5.com/usearch/）對所有樣品的全部Clean Tags進行聚類，將相似度≥97%的序列歸為同一類操作單元（OTUs），利用Qiime（http：//qiime.org/）從每個OTU所屬的序列中，選取OTU序列中排在第1位的序列作為OTU的代表序列，為避免測序深度不同導(dǎo)致的誤差，每個樣本隨機抽取17 998條序列參與統(tǒng)計分析，將代表序列與GreenGene數(shù)據(jù)庫進行對比完成對各OTU的注釋，得到每個OTU的分類學(xué)信息[17]。根據(jù)樣品中包含的物種信息，在門（Phylum）水平上將相對豐度<1%細菌類群以及無法分類的細菌類群合并在Others。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本研究采用SPSS 16.0（IBM，USA）對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法來比較不同Cd濃度脅迫處理間的差異性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對土壤理化性質(zhì)及水稻農(nóng)藝性狀的影響

由表1可知，不同Cd濃度脅迫下HH1水稻根際土壤理化性質(zhì)存在顯著不同。與Cd0處理相比，Cd3.5處理水稻根際土壤pH值、氧化還原電位（Eh）值顯著降低，Cd60.0處理Eh值顯著降低而總氮與銨態(tài)氮含量顯著升高，Cd240.0處理Eh值與總有機碳含量顯著降低而總氮與銨態(tài)氮含量顯著增加;與Cd3.5處理相比，Cd60.0與Cd240.0處理的pH值、銨態(tài)氮含量顯著增加，Cd240.0處理的總氮含量顯著增加，總有機碳含量顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理下總有機碳含量顯著降低而有效鎘含量顯著增加。

不同Cd濃度脅迫下MH63水稻根際土壤理化性質(zhì)也顯著不同。與Cd0處理相比，Cd3.5、Cd60.0處理水稻根際土壤的pH值顯著升高，Cd240.0處理水稻根際土壤的pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量均顯著升高;與Cd3.5處理相比，Cd240.0處理的總氮與銨態(tài)氮含量顯著增加;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理下有效鎘含量顯著升高。在Cd0處理下，HH1根際土壤pH值顯著高于MH63;在Cd3.5處理下，HH1根際土壤pH值、Eh值顯著低于MH63;在Cd60.0處理下，HH1的Eh值顯著低于MH63;在Cd240.0處理下，HH1的Eh值顯著低于MH63，總有機碳含量顯著低于MH63。雙因素方差分析顯示，水稻根際土壤Eh值顯著受Cd濃度脅迫及水稻品種的獨立影響及交互影響，而土壤pH值、總有機碳含量顯著受Cd濃度脅迫的獨立影響及Cd濃度與水稻品種的交互影響，水稻根際土壤總氮、銨態(tài)氮、有效鎘含量僅受Cd濃度脅迫影響?？梢姡珻d濃度增加了水稻根際土壤總氮、銨態(tài)氮、有效Cd含量而種植轉(zhuǎn)基因水稻降低了水稻根際土壤Eh值。

由表2可知，不同Cd濃度脅迫下HH1水稻成熟期農(nóng)藝性狀顯著不同。與Cd0、Cd3.5處理相比，Cd60.0處理生物量顯著降低，Cd240.0處理株高、生物量、產(chǎn)量顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理的株高與產(chǎn)量均顯著降低。不同Cd濃度脅迫下MH63水稻的農(nóng)藝性狀也顯著不同。與Cd0處理相比，Cd3.5處理農(nóng)藝性狀無顯著差異，Cd240.0處理下水稻株高、產(chǎn)量均顯著降低;與Cd3.5相比，Cd60.0處理株高與產(chǎn)量顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理下水稻株高、產(chǎn)量均顯著降低。雙因素方差分析顯示，水稻株高、生物量顯著受Cd濃度脅迫及水稻品種的獨立影響及兩者的交互影響，水稻產(chǎn)量顯著受Cd脅迫獨立影響及Cd脅迫與水稻品種的交互影響?？梢?，水稻農(nóng)藝性狀顯著受Cd脅迫抑制。

重金屬處理的成熟期水稻各器官中Cd顯著富集，無重金屬處理的各器官中未檢測到Cd。2個品種水稻根部Cd含量均隨Cd脅迫濃度增加而顯著上升。單因素方差分析結(jié)果顯示，在Cd3.5、Cd60、Cd240處理下，水稻根中的Cd含量在同一濃度的不同品種間無顯著差異，而同一品種的不同濃度處理間具有顯著差異;在Cd240處理下，HH1、MH63莖中的Cd含量具有顯著差異;在Cd60、Cd240處理下，水稻葉和谷粒中的Cd含量在同一濃度的不同品種間無顯著差異，而不同濃度的同一品種間具有顯著差異。雙因素方差分析顯示，水稻根、葉、谷粒Cd含量顯著受Cd濃度影響?？梢?，水稻根部比莖、葉、谷粒更易富集Cd。

2.2 Cd脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤細菌群落豐度及Alpha多樣性的影響

由圖1可知，土壤細菌16S rRNA基因數(shù)量可以反映土壤細菌群落豐度。隨著Cd濃度的增加，HH1和MH63水稻根際土壤細菌群落豐度呈下降趨勢。單因素方差分析顯示，部分Cd濃度脅迫下HH1水稻根際土壤細菌16S rRNA基因豐度顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0與Cd240.0處理根際土壤細菌群落豐度顯著降低。MH63水稻根際土壤細菌群落豐度間無顯著差異。雙因素方差分析結(jié)果顯示，根際土壤細菌16S rRNA基因豐度僅受Cd濃度脅迫顯著影響和親本水稻根際土壤細菌群落多樣性。

土壤16S rRNA基因在分類水平上的相對豐度能反映土壤中的細菌群落結(jié)構(gòu)和組成（圖2）。本研究中的3個處理共獲取16個相對豐度高于1%的門水平上的細菌類群。各處理中，Proteobacteria（變形菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）Bacteroidetes（擬桿菌門）共5個優(yōu)勢細菌群落，占總細菌群落的70%以上。其中，Proteobacteria的相對豐度最高，占總細菌群落的28.72%～46.63%;Chloroflexi其次，占9.57%～24.72%。

單因素方差分析顯示，HH1水稻根際土壤細菌群落組成顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0處理中Proteobacteria（變形菌門）、Acidobacteria、Actinobacteria、Firmicutes（厚壁菌門）的相對豐度顯著降低，Bacteroidetes、Fibrobacteres（纖維桿菌門）的相對豐度顯著升高;Cd240.0處理中Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Fibrobacteres、Nitrospirae（硝化螺旋菌門）的相對豐度顯著降低而Chloroflexi、Spirochaetes（螺旋體門）的相對豐度顯著升高;與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理中Chloroflexi、Bacteroidetes的相對豐度顯著升高而OP11、Spirochaetes、Fibrobacteres的相對豐度顯著降低。單因素方差分析顯示，MH63水稻根際土壤細菌群落組成也顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0處理中Acidobacteria、Firmicutes、Actinobacteria的相對豐度顯著升高而Fibrobacteres、Bacteroidetes、OP11的相對豐度顯著降低，Cd240.0處理中Proteobacteria、Acidobacteria、OP11、Nitrospirae、Actinobacteria、Fibrobacteres的相對豐度顯著升高而Bacteroidetes、Spirochaetes的相對豐度顯著降低;與Cd60.0處理相比，Cd240處理的Bacteroidetes、OD1的相對豐度顯著升高而Fibrobacteres、OP11的相對豐度顯著降低。雙因素方差分析顯示，水稻根際土壤中Acidobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi等11個細菌門的相對豐度受Cd濃度脅迫影響，水稻根際土壤中Other、OP11、Spirochaetes的相對豐度受水稻品種影響，Chloroflexi、OD1、OP11、Spirochaetes的相對豐度受水稻品種和Cd濃度的影響?？梢?，Cd濃度脅迫和水稻品種能顯著影響水稻根際土壤細菌群落組成。

2.3 Cd脅迫對轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的影響

基于細菌OTU相對豐度的CCA分析結(jié)果顯示，各處理細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化（圖3）。在各Cd濃度脅迫處理下，HH1和MH63根際土壤細菌群落分布明顯不同，ANOSIM相似度分析表明，各Cd濃度脅迫下根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。但在相同Cd濃度脅迫處理下，HH1和MH63水稻根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)無顯著差異。土壤環(huán)境因子分析顯示，根際土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量、總有機碳含量和Eh值影響了根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)（圖3），其中pH值、總氮含量和銨態(tài)氮含量顯著改變了水稻根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論與討論

3.1 Cd脅迫對水稻生長及土壤微生物的影響

本研究結(jié)果顯示，Cd脅迫能對水稻生長及土壤微生物產(chǎn)生顯著影響。Cd60、Cd240與Cd0處理相比，MH63品種水稻的株高、生物量、產(chǎn)量隨著Cd濃度的增加而降低。余飛宇通過對水稻添加60、180 mg/kg 2個Cd濃度脅迫，以不添加Cd脅迫為對照，結(jié)果顯示，低濃度Cd脅迫下產(chǎn)量比對照增加了6.71%，高濃度條件下，產(chǎn)量比對照下降了9.52%，具有顯著差異[18]。王錦文等的研究顯示，Cd脅迫顯著抑制水稻幼苗芽和根的生長，對根的生長影響最為顯著[19]。而龍思斯等的研究結(jié)果顯示，3種不同污染源中，Cd含量對水稻株高以及稻谷的質(zhì)量無顯著影響[20]。與本研究結(jié)果不一致，這可能與水稻品種、土壤理化性質(zhì)及水稻生長條件有關(guān)。已有研究顯示，Cd在低濃度時對植物有積極的“刺激作用”，在高濃度時則抑制植物生長[21-22]。有研究者表示，在重金屬作用下，一方面植物應(yīng)激產(chǎn)生保護作用，通過加速生理生化活動產(chǎn)生大量代謝物與重金屬締合以解毒;另一方面，激活的代謝系統(tǒng)也加速了重金屬的進入，進而抑制植物的代謝活動，對植物產(chǎn)生毒害作用[23]。

本研究結(jié)果顯示，隨著Cd濃度的增加，土壤細菌16S rRNA基因豐度沒有顯著變化，而不同Cd脅迫下MH63水稻根際土壤細菌Shannon指數(shù)顯著不同，與Cd0處理相比，Cd60.0與Cd240.0處理的Shannon指數(shù)顯著降低，與Cd60.0處理相比，Cd240.0處理的Shannon指數(shù)顯著降低，表明Cd濃度對土壤細菌群落多樣性有顯著影響。ANOSIM相似度分析表明，各Cd脅迫下根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Cd可減少土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量，Cd對土壤微生物三大菌的抑制效果是細菌>放線菌>真菌。王秀麗等研究發(fā)現(xiàn)，Cd對土壤微生物的毒害作用導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量和種群減少，說明Cd的加入導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd濃度是影響水稻株高、生物量、產(chǎn)量及根際土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)的主要因素，同時土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量顯著影響了水稻根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。

3.2 轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，與親本水稻MH63相比，HH1水稻的根際土壤細菌群落豐度、多樣性、群落組成與結(jié)構(gòu)均沒有顯著變化。而Dunfield等研究了在加拿大的4個不同田塊連續(xù)2年種植4種轉(zhuǎn)抗除草劑基因的油菜和4種常規(guī)油菜品種對根際微生物多樣性的影響，通過分析表明，轉(zhuǎn)基因油菜品種的根內(nèi)和根際細菌群落與常規(guī)品種有差異[25]。Heuer等研究了轉(zhuǎn)T4溶菌酶馬鈴薯，指出T4溶菌酶表達的馬鈴薯與對照相比沒有發(fā)現(xiàn)根際群落有偏差[26]。劉明等在溫室試驗中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CryIAb基因玉米（NK4640Bt）和非轉(zhuǎn)基因玉米根際土壤中或添加玉米組織的土壤可培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌數(shù)量沒有顯著差異[27-28]。此后，研究者通過SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）、CLPP（微生物群落生理代謝指紋）、PLFA（磷脂脂肪酸圖譜）技術(shù)均證實，轉(zhuǎn)Cry1Ab基因玉米系并未引起土壤微生物群落多樣性的顯著變化。Lin等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)抗黃瓜花葉病毒的番茄和野生型番茄對土壤微生物數(shù)量的影響沒有顯著差異，而且取樣位置比轉(zhuǎn)基因番茄的影響更大[29]。還有研究者發(fā)現(xiàn)，影響因素可能是季節(jié)、天氣、土壤類型、地理位置等環(huán)境因子[30]。環(huán)境因子也是根際微生物群落變化的重要驅(qū)動力。本研究發(fā)現(xiàn)，外源基因的轉(zhuǎn)入不會影響水稻根際土壤細菌群落豐度、多樣性及群落組成與結(jié)構(gòu)。同時Cd脅迫能顯著影響轉(zhuǎn)基因水稻的基因豐度、多樣性及群落組成與結(jié)構(gòu)。同時，根際土壤pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量顯著影響了轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)植物根際土壤微生物的變化是復(fù)雜且長期的過程，因此評估轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物的影響時，應(yīng)該同時監(jiān)測轉(zhuǎn)基因作物、親本非轉(zhuǎn)基因作物的長期效應(yīng)[31]。

綜上所述，本研究采用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)研究Cd脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物的影響，發(fā)現(xiàn)Cd脅迫對轉(zhuǎn)基因水稻和親本水稻農(nóng)藝性狀及根部Cd吸收富集有顯著影響，Cd60.0與Cd240.0脅迫能顯著降低轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤群落豐度和多樣性，同時對土壤細菌群落組成及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，該結(jié)果可為轉(zhuǎn)基因水稻環(huán)境安全評價提供試驗數(shù)據(jù)。

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