產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑對(duì)水體生物絮團(tuán)形成和氮磷去除率的影響

周鳳鳴 繆禮鴻 劉蒲臨

摘要：氮磷含量超標(biāo)是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要原因，向水體中投加有機(jī)碳源能促進(jìn)生物絮團(tuán)的形成并凈化水質(zhì)。以產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑為研究對(duì)象，探究其對(duì)生物絮團(tuán)的形成、氨氮與總磷去除效果的影響。結(jié)果表明，以膨化玉米粉作為固態(tài)載體吸附產(chǎn)朊假絲酵母去除氨氮和總磷效果最佳;在試驗(yàn)水體中投加10 mg/L活性產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑與10 μL/L活性菌液，均有明顯降低水中氨氮、總磷含量的作用，其中投加活性固體菌劑效果最明顯，光照培養(yǎng)9 d后其氨氮與總磷的去除率分別為50.49%和38.24%，比空白對(duì)照組提高了67.63%和55.51%。通過(guò)相差顯微鏡觀察得出，投加固體菌劑后，在水體中能形成明顯的生物絮團(tuán)結(jié)構(gòu)，原生動(dòng)物與原生藻類數(shù)量明顯增加。比較室內(nèi)、室外2種培養(yǎng)條件下試驗(yàn)結(jié)果表明，室外培養(yǎng)條件下投加固體菌劑水樣氨氮和總磷去除率分別為69.52%和 53.69%，較空白對(duì)照組提高了17.99%和30.57%;室內(nèi)培養(yǎng)條件下，投加固體菌劑水樣氨氮和總磷去除率分別為 55.37% 和42.79%，較空白對(duì)照組提高了51.00%和41.13%。在人工接種銅綠微囊藻的水體中投加固體菌劑培養(yǎng) 10 d 后，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到明顯抑制，氨氮與總磷去除率分別達(dá)98.70%與40.48%，表明向水體中投加產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑具有調(diào)控水體生物群落的作用并能提高對(duì)氨氮和總磷的去除率。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)朊假絲酵母;固體菌劑;生物絮團(tuán);氨氮;總磷;銅綠微囊藻

中圖分類號(hào)：X172 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0295-05

水產(chǎn)高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)中存在的高污染、高發(fā)病率問(wèn)題已經(jīng)成為制約養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素。生物絮團(tuán)技術(shù)的發(fā)展為上述問(wèn)題的解決提供了新的方法[1-2]。生物絮團(tuán)是由水體中的細(xì)菌、藻類、浮游動(dòng)植物與有機(jī)碎屑等經(jīng)過(guò)生物絮凝而成的具有自我繁殖能力的團(tuán)聚物[3]，這種團(tuán)狀物質(zhì)能在凈化水質(zhì)的同時(shí)為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物提供優(yōu)質(zhì)生物餌料等[4-6]。有研究表明，向水體中投加一定量的碳源能促進(jìn)生物絮團(tuán)的形成，常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、稻殼、麥麩、玉米粉等，載體的選擇應(yīng)綜合考慮碳源的費(fèi)用、生物降解率以及載體分散性[7]。陳海兵將稻殼粉與益生菌混合添加到養(yǎng)殖水體中，不僅降低了養(yǎng)殖成本，而且有助于異養(yǎng)微生物有效吸收降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮等有害物質(zhì)并維持養(yǎng)殖水體的穩(wěn)定性[8]。葉建勇等研究發(fā)現(xiàn)，投加甘蔗渣懸浮顆粒和芽孢桿菌能有效促進(jìn)水體中生物絮團(tuán)的形成，提高氨氮、亞硝態(tài)氮等有害物質(zhì)的降解量，有效改善水質(zhì)[9]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，投加產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）液態(tài)菌劑能夠較好地去除水體中氨氮與總磷[10]。本研究將產(chǎn)朊假絲酵母與有機(jī)固體載體相結(jié)合，探究其投入水體后對(duì)生物絮團(tuán)形成和氮磷去除率的影響，以期為人工調(diào)控養(yǎng)殖水體微生物群落和富營(yíng)養(yǎng)化水體的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與材料 產(chǎn)朊假絲酵母SG607，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離并保存。銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）905，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種保藏中心。藻種經(jīng)活化后于光照度為2 000 lx、光—暗周期為14 h—10 h的 25 ℃ 人工氣候箱中培養(yǎng)。膨化玉米粉等固體載體均為市購(gòu)。

1.1.2 培養(yǎng)基 產(chǎn)朊假絲酵母采用醇母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基[11]和氨基酸廢液培養(yǎng)基[12]培養(yǎng)，銅綠微囊藻采用BG11培養(yǎng)基[13]培養(yǎng)。

1.1.3 試驗(yàn)水樣 以取自湖北省武漢市某中心公園的景觀池塘水作為本試驗(yàn)用的天然水樣。為比較投加菌液與固體菌劑對(duì)水中氨氮含量影響，模擬配制天然加富水樣，即在天然水樣中補(bǔ)加 8.0 mg/L NH4Cl和0.6 mg/L NaH2PO4。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)朊假絲酵母菌液及固體菌劑制備 將保存的產(chǎn)朊假絲酵母SG607菌株接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基平板上，30 ℃活化培養(yǎng) 2 d，取經(jīng)活化的菌種接入YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)20 h后，轉(zhuǎn)接到氨基酸廢液培養(yǎng)基中，于30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)18 h，制備成酵母菌液;將菌液與固體載體按質(zhì)量比1 ∶ 2混合均勻后，制備成固體菌劑，備用。

1.2.2 不同產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑對(duì)水樣中氨氮與總磷去除率的影響 取2 mg不同載體的固體菌劑分別加入到盛有200 mL天然加富水樣的三角瓶中，以不進(jìn)行任何處理的水樣為空白對(duì)照，以加入 2 μL 菌液的水樣為菌液空白對(duì)照，于人工氣候箱中光照培養(yǎng)7 d后，測(cè)定其氨氮、總磷質(zhì)量濃度，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 活性產(chǎn)朊假絲酵母及滅活產(chǎn)朊假絲酵母對(duì)水樣中生物絮團(tuán)形成及氨氮、總磷去除率的影響 取2 μL活性菌液、2 mg 活性固體菌劑分別加入到盛有200 mL天然加富水樣的三角瓶中，以添加等量的無(wú)菌水、滅活菌液、膨化玉米粉、滅活固體菌劑作為對(duì)照，于人工氣候箱中光照培養(yǎng)9 d，測(cè)定細(xì)菌活菌數(shù)及氨氮、總磷質(zhì)量濃度，并使用熒光相差顯微鏡觀察拍照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4 室內(nèi)外不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)朊假絲酵母菌劑對(duì)氨氮與總磷去除率的影響 室內(nèi)培養(yǎng)在人工氣候箱中進(jìn)行，分別取2 μL菌液、2 mg固體菌劑加入到盛有200 mL天然加富水樣的三角瓶中培養(yǎng)，空白對(duì)照瓶中添加2 μL無(wú)菌水。室外試驗(yàn)在60 cm×30 cm×50 cm的塑料箱中進(jìn)行，分別取650 μL菌液、650 mg固體菌劑投加至裝有65 L天然加富水樣的長(zhǎng)方形塑料箱中，空白對(duì)照組中加入650 μL無(wú)菌水，連續(xù)培養(yǎng)13 d后，測(cè)定水中細(xì)菌活菌數(shù)與氨氮、總磷質(zhì)量濃度，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5 產(chǎn)朊假絲酵母SG607菌液及固體菌劑對(duì)天然加富水樣中銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響 在200 mL天然加富水樣中接入藻細(xì)胞濃度為1.15×107 CFU/mL的銅綠微囊藻2 mL，然后分別加入2 μL菌液、2 mg固體菌劑，對(duì)照組采用2 μL無(wú)菌水、2 μL無(wú)菌載體分別替代2 μL菌液、2 mg固體菌劑，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定藻細(xì)胞數(shù)及氨氮、總磷質(zhì)量濃度。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.6 藻細(xì)胞數(shù)、細(xì)菌總數(shù)、氨氮質(zhì)量濃度和總磷質(zhì)量濃度的測(cè)定 藻細(xì)胞數(shù)的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，測(cè)定3次取平均值;水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定采用牛肉膏平板涂布法;藻液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后測(cè)定濾液中氨氮、總磷質(zhì)量濃度，氨氮質(zhì)量濃度的測(cè)定采用苯酚次氯酸鹽法，總磷質(zhì)量濃度的測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法，本研究涉及所有水體常規(guī)理化指標(biāo)的測(cè)定參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）[14]。

1.2.7 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn) 室外水樣試驗(yàn)于2016年9月8—30日在湖北省武漢市東西湖區(qū)常青公園進(jìn)行，當(dāng)時(shí)氣溫范圍為20～32 ℃;室內(nèi)水樣試驗(yàn)于2016年5—10月在武漢輕工大學(xué)資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)氣候箱中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體吸附產(chǎn)朊假絲酵母對(duì)水樣氨氮與總磷去除率的影響

為研究不同載體吸附產(chǎn)朊假絲酵母SG607對(duì)水中氨氮與總磷去除率的影響，分別將不同載體及其吸附后的固體菌劑投加至天然加富水樣（水質(zhì)參數(shù)見(jiàn)表1）中，光照培養(yǎng)1周后比較水樣中氮磷含量。結(jié)果（圖1）表明，相較于空白對(duì)照組，投加載體和固體菌劑的處理均具有一定降解氨氮與總磷的效果，其中投加固體菌劑的處理效果更好，且不同載體吸附產(chǎn)朊假絲酵母降解氨氮與總磷效果有明顯差異，其中膨化大米和膨化玉米粉吸附產(chǎn)朊假絲酵母投入天然加富水樣后的氨氮與總磷去除率較高，其氨氮去除率分別為46.7%和44.4%，分別較空白對(duì)照高179.64%和165.87%;總磷去除率分別為35.2%和37.5%，分別較空白對(duì)照高225.93%和247.22%。綜合考慮，后續(xù)試驗(yàn)均選用膨化玉米粉為載體。

2.2 產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑對(duì)生物絮團(tuán)形成及氨氮、總磷去除率的影響

各處理水樣的顯微觀察結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照（圖2-a）相比，添加固體載體及其固體菌劑的水樣中均能觀察到少量原生動(dòng)物和絲狀藻類。投加菌液的水樣中藻類長(zhǎng)勢(shì)良好、生物絮團(tuán)結(jié)構(gòu)明顯且在藻類周邊能觀察到少量酵母細(xì)胞（圖2-e）。投加載體、滅活固體菌劑與固體菌劑的水樣中均觀察到黑色固體顆粒（圖2-b、圖2-d、圖2-f），其中投加 10 mg/L 固體活性菌劑的水樣中生物絮團(tuán)形成良好，且該水樣中的藻類、原生動(dòng)物最豐富（圖2-f），氨氮及總磷去除率最高分別達(dá)50.49%和38.24%（圖3），與空白對(duì)照相比其氨氮和總磷的除率分別提高了67.63%和55.51%，與投加滅活固體菌劑的對(duì)照相比其氨氮與總磷去除率分別提高了21.45%和19.69%。

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑去除氨氮及總磷的影響

將產(chǎn)朊假絲酵母菌液與固體菌劑分別加入天然加富水樣中，比較在室內(nèi)和室外2種不同條件下對(duì)氨氮和總磷的去除效果。結(jié)果（圖4）表明，室外空白對(duì)照組氨氮與總磷去除率（分別為58.92%和41.12%）均高于室內(nèi)空白對(duì)照組（分別為36.67%和30.32%）;室外培養(yǎng)條件下，投加固體菌劑水樣氨氮及總磷去除率分別為69.52%和53.69%，較投加菌液水樣分別提高了9.98%和11.37%，比空白水樣提高了 17.99% 和30.57%。室內(nèi)培養(yǎng)條件下，投加固體菌劑水樣氨氮、總磷去除率分別為55.37%、42.79%，較投加菌液水樣去除率提高了11.72%、16.63%，比空白提高了51.00%、41.13%。

在2種不同的培養(yǎng)條件下，投加固體菌劑的水樣中細(xì)菌活菌數(shù)均高于投加菌液（圖5），室外培養(yǎng)時(shí)投加固體菌劑水樣的細(xì)菌活菌數(shù)最高為7.2×103 CFU/mL，比投加菌液與空白水樣分別增加了14.29%、46.94%;室內(nèi)培養(yǎng)13 d時(shí)投加固體菌劑細(xì)菌活菌數(shù)為4.2×103 CFU/mL，比較投加菌液與空白水樣增加了68%和320%，且室內(nèi)水樣細(xì)菌活菌數(shù)在第8天達(dá)到最高峰，而室外細(xì)菌活菌數(shù)在第13天仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明室外條件下細(xì)菌活菌數(shù)高于室內(nèi)培養(yǎng)，環(huán)境中微生物對(duì)試驗(yàn)水體中細(xì)菌活菌數(shù)有一定影響。

2.4 產(chǎn)朊假絲酵母SG607對(duì)天然加富水樣中銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由圖6可知，在培養(yǎng)第6天時(shí)，各水樣中的銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)均達(dá)到最大值。添加菌液、載體及其固體菌劑后，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)均受到明顯抑制;添加固體菌劑后水樣中的銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)第6天時(shí)高于加入載體水樣，但在第8天后均低于其他處理組。

如圖7所示，添加固體菌劑水樣氨氮去除率最高達(dá) 98.70%，與空白水樣相比提高38.96%，添加固體菌劑與投加菌液水樣中總磷去除率差異較小，最高分別為40.48%與 40.76%，與空白水樣相比分別提高了49.21%與50.24%。

3 討論

本研究比較測(cè)定了米糠、膨化玉米粉等不同含碳載體及其吸附產(chǎn)朊假絲酵母后制備的固體菌劑對(duì)水體中氨氮和總磷的去除率，得出膨化玉米粉作為載體吸附產(chǎn)朊假絲酵母的處理效果最佳。有研究表明，玉米經(jīng)膨化加工后，淀粉被充分糊化，具有很好的水溶性[15]。膨化玉米粉比表面積大，具有較好的吸附性，投加到水中后分散性和懸浮性好，能為細(xì)菌、藻類、原生動(dòng)物等微生物提供良好的附著基和有機(jī)碳源，有利于水體中的微生物生長(zhǎng)和生物絮團(tuán)的形成。

本研究表明，投加固體菌劑水樣中的氮磷去除效果明顯優(yōu)于只投加載體或菌液的處理，其水樣中的細(xì)菌活菌數(shù)與原生動(dòng)物數(shù)量均為最高。這可能是由于產(chǎn)朊假絲酵母菌劑具有促進(jìn)水體中多種微生物生長(zhǎng)的作用，使水體中有更多的氮磷營(yíng)養(yǎng)元素被吸收轉(zhuǎn)化成微生物的生物量。Cai等研究表明，當(dāng)藻類與酵母一起培養(yǎng)時(shí)，水中生物的多樣性與生物活性提高[16]。此外，人工投加碳源能在一定程度上促進(jìn)生物絮團(tuán)的形成和微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，從而降低水中氮磷含量[17-18]。

本研究結(jié)果表明，室外培養(yǎng)條件下投加固體菌劑及空白對(duì)照水體的氨氮及總磷去除率與細(xì)菌活菌數(shù)均明顯高于室內(nèi)人工氣候箱中培養(yǎng)的水體。從試驗(yàn)條件分析二者的區(qū)別主要在于光照、溫度和溶解氧含量。已有研究表明，隨著室外氣溫的升高，水體的溫度也逐漸升高，氨氮的降解系數(shù)逐漸增大[19-20]，且自然條件下光照與溶解氧更充足，水中耗氧與有機(jī)物分解速度快，更有利于水中浮游生物的生長(zhǎng)和氮磷的吸收轉(zhuǎn)化[21]。

投加產(chǎn)朊假絲酵母固體菌劑與菌液均能在一定程度上抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)并降低水中氮磷含量，可能是由載體及酵母菌劑的添加促進(jìn)了水體中其他原生藻類及異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)，與銅綠微囊藻競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)所致。有研究表明，天然加富水體中原生藻類與銅綠微囊藻之間具有一定競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，添加部分碳源后銅綠微囊藻可與異養(yǎng)微生物、原生動(dòng)物等形成生物絮團(tuán)，從而降低水中微囊藻生物量[22-24]。

4 結(jié)論

通過(guò)比較不同含碳載體及其吸附產(chǎn)朊假絲酵母后制備的固體菌劑對(duì)水體中氮磷去除率的影響，優(yōu)選出以膨化玉米粉為載體制備的固體菌劑對(duì)水中氮磷去除率和生物絮團(tuán)的形成效果最佳。

向天然加富水樣中投加活性固體菌劑和菌液，相比滅活試驗(yàn)組均有明顯降低水中氨氮、總磷含量的作用，其中投加活性固體菌劑效果最明顯，通過(guò)相差顯微鏡觀察可知，投加固體菌劑、菌液與滅活固體菌劑處理組水樣中的生物絮團(tuán)、原生藻類和原生動(dòng)物的數(shù)量均有所增加。

在室內(nèi)、室外培養(yǎng)條件下分別投加10 mg/L的固體菌劑培養(yǎng)14 d后，室外處理組水樣中氨氮與總磷去除率分別比室內(nèi)處理組高25.56%和25.47%。室外培養(yǎng)條件下水中細(xì)菌總數(shù)一直處于增長(zhǎng)階段并在培養(yǎng)第14天時(shí)達(dá)到最大值，為7.2×103 CFU/mL，而室內(nèi)培養(yǎng)條件下細(xì)菌總數(shù)在第8天達(dá)到最高值后開(kāi)始下降，最終細(xì)菌總數(shù)為4.2×103 CFU/mL。

在人工添加銅綠微囊藻的水樣中投加10 mg/L固體菌劑培養(yǎng)10 d后，銅綠微囊藻生長(zhǎng)受到明顯抑制，氨氮與總磷去除率分別達(dá)98.70%與40.48%。

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