茄根多糖的提取分離及含量測(cè)定*

鄧欣鑫 張瑤瑤 虞麗娜 朱霞琳 趙 瑩

藥學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

1 儀器與試劑

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)：N-1300V型，生產(chǎn)廠(chǎng)家：東京理化器械株式會(huì)社)；循環(huán)水式多用真空泵(型號(hào)：SHZ-DⅢ，生產(chǎn)廠(chǎng)家：上海科興儀器有限公司)；電子分析天平(型號(hào)：XS205DU型，生產(chǎn)廠(chǎng)家：上海梅特勒-托利多有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(型號(hào)：Gold S54，生產(chǎn)廠(chǎng)家：上海棱光技術(shù)有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)：KQ5200DE型，生產(chǎn)廠(chǎng)家：昆山市超聲儀器有限公司)；臺(tái)式電熱干燥箱(型號(hào)：202-2AB型，生產(chǎn)廠(chǎng)家：天津市泰斯特儀器有限公司)；水浴鍋(型號(hào)：HH.S11-Ni2型，生產(chǎn)廠(chǎng)家：北京三二八科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(型號(hào)：TD4型，生產(chǎn)廠(chǎng)家：常州金勝儀器制造有限公司)；純水儀(生產(chǎn)廠(chǎng)家：MILLIPORE)。

1.2 試劑

茄根采自山東省泰安市泰山區(qū)上高街道辦事處上高村，由山東省泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心中藥科的刁興斌老師鑒定為茄科(Solanaceae)茄屬植物(SolanumL.)茄的干燥根莖部位；水：超純水(自制)；石油醚、無(wú)水乙醇、濃硫酸、正丁醇、葡萄糖、苯酚、氯仿、丙酮等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1茄根多糖的提取與精制工藝

樣品處理→脫脂→浸提→抽濾除渣→減壓濃縮→離心→乙醇沉淀多糖→靜止離心→粗多糖→復(fù)溶→脫蛋白→醇沉→干燥→精制多糖。

2.1.2工藝要點(diǎn)說(shuō)明

樣品處理：將茄根除去雜質(zhì)，置于恒溫干燥箱中烘干，粉碎備用。

基于草原絲路文物資源的鄉(xiāng)村旅游產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)缺乏統(tǒng)一部署，具有文物資源地區(qū)各行其是，未用系統(tǒng)眼光看待問(wèn)題，解決問(wèn)題，開(kāi)發(fā)模式分散。無(wú)論是從橫向上看還是從縱向上看，鄉(xiāng)村旅游產(chǎn)業(yè)與相關(guān)產(chǎn)業(yè)融合度都比較低，導(dǎo)致相關(guān)產(chǎn)品附加值低，宣傳力度不夠。產(chǎn)品部門(mén)間協(xié)作不強(qiáng)，產(chǎn)業(yè)鏈條較短，產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)效果不顯著。產(chǎn)業(yè)處于起步階段，發(fā)展機(jī)制仍需完善。

脫脂：稱(chēng)取藥材5.0 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL石油醚，密塞后，振搖，超聲(40℃，頻率40 kHz)提取30 min，脫去其表面脂類(lèi)物質(zhì)，抽濾，晾干，重復(fù)脫脂1次。

浸提：脫脂晾干后試樣，以1∶20的料液比加入蒸餾水，在40℃水浴中超聲浸提30 min，過(guò)濾后，在相同條件下重復(fù)提取1次。

抽濾除渣：將2次提取液合并，減壓抽濾。

減壓濃縮：利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，約至20 mL，冷卻至室溫。

離心和醇沉：將濃縮液離心5 min(5000 r/min),棄去沉淀后，緩慢加入無(wú)水乙醇(約3倍量)，不斷用玻璃棒攪拌，使多糖充分析出。

靜置離心：將上述溶液靜置1 d后，在離心機(jī)上離心得粗多糖沉淀。

復(fù)溶和脫蛋白：粗多糖復(fù)溶，利用Sevage試劑除蛋白，連續(xù)操作到脫除蛋白質(zhì)完全。

醇沉：在除去蛋白后的溶液中加入無(wú)水乙醇(3倍量)沉淀，依次用石油醚、丙酮、乙醇反復(fù)洗滌，離心，干燥，得精制多糖。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取一定量的葡萄糖對(duì)照品于105℃干燥至恒重，精密稱(chēng)取10 mg，置于250 mL容量瓶中，加超純水溶解，稀釋至刻度，搖勻，配制成40 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

苯酚溶液的配制[9]：稱(chēng)取苯酚30 g，常壓蒸餾收集182℃的餾分，取餾出液6.0 g，加入超純水100 mL，配制6%的苯酚溶液，置棕色瓶中備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制:分別精密吸取0.0、0.8、1.2、1.6、3.2 mL的40 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL具塞刻度試管中，分別在各試管中加入超純水至體積為2.0 mL，空白試管中加入2.0 mL超純水作對(duì)照，各管分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，滴加濃硫酸5.0 mL，振搖，放置5 min，置沸水浴中加熱25 min，迅速冷卻，至室溫，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.1.4樣品中多糖的含量測(cè)定[10]

精密稱(chēng)取茄根粉末5.0 g，利用石油醚于超聲條件下脫脂2次，抽濾，將濾渣風(fēng)干后加超純水超聲提取2次后，抽濾，合并2次濾液，濃縮后加3倍量無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，離心，沉淀復(fù)溶，定容至100 mL，搖勻，作為樣品溶液。吸取1.0 mL，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)操作步驟，測(cè)其吸光度。多糖含量(%)=樣品液中葡萄糖的濃度(mg/mL)×樣品液的稀釋倍數(shù)×測(cè)定液總體積(mL)/樣品的重量(mg)。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程建立

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制方法，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定溶液吸光度，參比為空白試劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得到線(xiàn)性回歸方程：A=0.0572C+0.0030，r2=0.9993，相關(guān)系數(shù)r=0.9986，表明葡萄糖在4.0～16.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值

2.2.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取試樣2.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定的方法配制，室溫放置120 min，每隔30 min測(cè)1次吸光度，考察溶液的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在顯色后90 min內(nèi)的穩(wěn)定性最好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3精密度實(shí)驗(yàn)

吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定的方法進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行6次測(cè)定其吸光度，得RSD(%)=2.35，表明精密度良好。

2.2.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精確吸取來(lái)自于同一批原料的試樣，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定的方法，分別測(cè)定其吸光度，檢驗(yàn)該測(cè)定方法的重現(xiàn)性，得RSD(%)=1.50，表明重復(fù)性較好。

2.2.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取已配制的35 μg/mL 粗多糖溶液1.0 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的40 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，稀釋后按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定的方法分別測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算加標(biāo)回收率，見(jiàn)表2，結(jié)果表明樣品加標(biāo)回收率均在95%～105%之間，說(shuō)明本法可行。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.6樣品中多糖含量測(cè)定結(jié)果

按上述測(cè)定方法，同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，經(jīng)測(cè)定吸光度值分別為0.237、0.235、0.234，由公式計(jì)算的茄根多糖平均含量為4.5%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助法對(duì)茄根中的多糖進(jìn)行提取，用苯酚-硫酸法測(cè)其含量。在苯酚-硫酸法的條件下，測(cè)得茄根多糖含量平均為4.5%。該實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好，多糖含量測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，回收率高，說(shuō)明苯酚-硫酸法可以用于測(cè)定茄根中多糖含量，具有一定的推廣和參考價(jià)值，同時(shí)也為茄根藥材的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。