活性免疫球蛋白蛋黃粉增強(qiáng)小鼠抗疲勞性能的實(shí)驗(yàn)研究*

戶茗珈 彭 雨 李 棟 劉毓婉 李 穎 翟 靜 劉永慶 王 濤

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271000；2.濰坊康奧思生物技術(shù)有限公司，山東 濰坊 261000

隨著社會高速的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快、工作壓力的增大,人們的機(jī)體與心理往往處于高度緊張的狀態(tài)，因此疲勞越來越成為影響人們生活質(zhì)量的重要因素[1]。疲勞作為一種在腦力或體力活動到達(dá)一定階段時出現(xiàn)的正常的生理現(xiàn)象，是指機(jī)體生理過程不能持續(xù)其機(jī)能在特定水平或整體不能維持預(yù)定的運(yùn)動強(qiáng)度而出現(xiàn)的一種狀態(tài)[2]，可以引起機(jī)體運(yùn)動能力降低、差錯事故增多、工作效率降低、戰(zhàn)斗力減退、反應(yīng)遲鈍、動作協(xié)調(diào)性降低[3]。疲勞發(fā)生后如果長時間沒有得到消除，就會逐漸積累,還會導(dǎo)致“過勞”、“慢性過疲勞綜合征”和“過度訓(xùn)練綜合癥”等癥狀出現(xiàn)，使機(jī)體內(nèi)分泌發(fā)生紊亂、免疫力出現(xiàn)下降,甚至還有器質(zhì)性疾病的改變,威脅人類身心健康[4]。因此如何有效的緩解機(jī)體疲勞和促進(jìn)疲勞的恢復(fù)也成為社會上越來越關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前研究認(rèn)為，免疫球蛋白主要是在抵抗細(xì)菌、病毒等病原體入侵,增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，以及殺傷靶細(xì)胞、中和毒素、殺死腫瘤細(xì)胞等方面發(fā)揮著重要作用。但關(guān)于免疫球蛋白在動物體內(nèi)發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)功能、增強(qiáng)抗疲勞功效尚未見報道。

本實(shí)驗(yàn)利用研究團(tuán)隊(duì)前期從免疫雞蛋黃中經(jīng)低溫制備的活性免疫球蛋白蛋黃粉，進(jìn)一步探索活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠抗疲勞作用的影響，為抗疲勞新產(chǎn)品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成年雄性昆明種小鼠96只，平均體重(24±2)g(泰邦生物科技公司提供)?；钚悦庖咔虻鞍椎包S粉(注:低溫制備的免疫球蛋白蛋黃粉)和缺乏活性免疫球蛋白的蛋黃粉(普通蛋黃粉)(注:常規(guī)180°C以上高溫瞬間噴霧干燥方法制備的蛋黃粉)均由濰坊康奧思生物技術(shù)有限公司提供。血尿素氮(BUN)測試盒、全血乳酸(LD)測試盒、糖元測試盒、丙二醛(MDA)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。UV754分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)，DK-8D型電熱恒溫水槽，有機(jī)玻璃材質(zhì)的50 cm×50 cm×50 cm游泳箱。

1.2 方法

1.2.1活性免疫球蛋白的效價測定 分別對活性免疫球蛋白蛋黃粉、普通蛋黃粉和生理鹽水進(jìn)行抗雞新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)血清型H9抗原血凝抑制抗體(HI)效價的測定[5]。取活性免疫球蛋白蛋黃粉和普通蛋黃粉各1 g，充分溶解到10 mL生理鹽水中，然后分別取50 μL在96孔V型版上做遞倍稀釋，每孔再加入同體積的4單位抗原，混勻，置37℃中和1 h。抽取公雞血液，2 000 r/min離心5 min，去上清及表層白細(xì)胞，生理鹽水沖洗紅細(xì)胞，繼續(xù)以上述條件離心，如此反復(fù)洗滌紅細(xì)胞3～5次收集紅細(xì)胞，以生理鹽水制成1%的紅細(xì)胞懸液?？乖c樣品中和后加入1%的紅細(xì)胞懸液，置37℃ 40 min后觀察結(jié)果。

1.2.2小鼠分組及飼喂方法 將96只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按體重隨機(jī)分為4組，設(shè)低濃度組(活性免疫球蛋白蛋黃粉)、高濃度組(活性免疫球蛋白蛋黃粉)，蛋黃粉對照組(普通蛋黃粉)和空白對照組 (蒸餾水)，每組24只，每次實(shí)驗(yàn)從對應(yīng)分組中隨機(jī)抽取8只。組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察5 d后灌胃相應(yīng)受試物，低、高濃度組分別以50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)的活性免疫球蛋白蛋黃粉溶液灌胃，蛋黃粉對照組以100 mg/(kg·d)的缺乏活性免疫球蛋白的蛋黃粉溶液灌胃，空白對照組以同體積蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水及攝食，連續(xù)灌胃15 d后進(jìn)行各項(xiàng)抗疲勞指標(biāo)的測定。實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束時用電子秤稱量小鼠體重。

1.2.3小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn) 末次灌胃30 min后，各組隨機(jī)抽取8只小鼠，于鼠尾根部固定其體重5%鉛皮，放入水溫為(30.0±2.0)℃、水深30 cm的恒溫游泳箱中，每個水箱1次放入4只小鼠。將小鼠頭部沉入水中10 s內(nèi)不返回水面視為力竭，用秒表記錄自游泳開始至力竭死亡的時間，即小鼠的游泳時間[6-7]。

1.2.4小鼠全血乳酸測定 末次灌胃30 min后，各組隨機(jī)抽取8只小鼠，眼眶采血0.1 mL，然后負(fù)重游泳(負(fù)體重的4%)10 min，休息30 min后再次眼眶采血0.1 mL。試管編號，各管加入0.6 mL蛋白沉淀劑混勻，3 500～4 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定，具體步驟按相應(yīng)試劑盒說明書操作。

1.2.5小鼠血清尿素氮測定 末次灌胃30 min后，各組隨機(jī)抽取8只小鼠，于30℃的水中無負(fù)重游泳90 min，撈出小鼠擦干，休息30 min后拔眼球采血約0.5 mL(不加抗凝劑)。放入4℃冰箱中約3 h，全血凝固后2 000 r/min離心15 min，取血清備用。血清中的尿素氮與二乙酰肟反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，根據(jù)色澤深淺來計(jì)算尿素氮含量，具體步驟按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6小鼠運(yùn)動后肝糖原測定 末次灌胃30 min后，各組隨機(jī)抽取8只小鼠，于30℃的水中無負(fù)重游泳90 min，撈出擦干休息30 min后立即脫頸處死小鼠，取新鮮肝臟標(biāo)本經(jīng)生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱重；按樣本重量(mg)∶堿液體積(μL)=1∶3，一起加入試管中，沸水浴煮20 min，流水冷卻；將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測液，具體步驟按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7小鼠肝臟丙二醛測定 末次灌胃30 min后,各組隨機(jī)抽取8只小鼠，脫頸處死小鼠，取新鮮肝臟標(biāo)本經(jīng)生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱重；加入9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，去上清液進(jìn)行測定，具體步驟按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 活性免疫球蛋白的效價測定

抗NDV和AIV血清型H9抗原血凝抑制抗體(HI)效價的測定(log2)如表1，結(jié)果顯示：活性免疫球蛋白蛋黃粉對NDV和AIV血清型H9兩種抗原的血凝抑制抗體(HI)效價均很高，分別為達(dá)到log2的7和9，但在普通蛋黃粉和生理鹽水對照組均未檢測到抗體(表1)。

表1 抗NDV和AIV血清型H9兩種抗原的血凝抑制抗體(HI)效價的測定(log2)

2.2 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠體重的影響

比較空白對照組與實(shí)驗(yàn)組小白鼠實(shí)驗(yàn)前后(14 d)體重增長的情況，實(shí)驗(yàn)組和空白對照組小白鼠體重都呈現(xiàn)出增長的態(tài)勢，且各組之間沒有顯著性差異(P>0.05)，說明活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠體重沒有顯著影響(見表2)。

表2 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠體重的影響

2.3 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠負(fù)重游泳的影響

空白對照組、蛋黃粉對照組、低濃度組和高濃度組小鼠負(fù)重游泳時間分別為(450.38±44.48)、(482.10±72.16)、(519.25±109.99)、(3059±885.41)s，實(shí)驗(yàn)組與空白對照組比較，小白鼠負(fù)重游泳時間明顯延長，高濃度組尤為顯著，各實(shí)驗(yàn)組與空白對照組對比差異顯著(P<0.05或P<0.01)。表明活性免疫球蛋白蛋黃粉可以明顯延長實(shí)驗(yàn)小白鼠的負(fù)重游泳時間，即能夠有效提高小白鼠的運(yùn)動耐受能力。

2.4 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動前后全血乳酸的影響

在運(yùn)動前，空白對照組、蛋黃粉對照組、低濃度組和高濃度組4個組的乳酸含量無明顯差異。運(yùn)動后空白對照組、蛋黃粉對照組、低濃度組和高濃度組全血乳酸分別升高了103.1%、116.9%、90.4%、73.2%。實(shí)驗(yàn)組與空白對照組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。由結(jié)果表明，活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后乳酸的消除有明顯作用，可以消除疲勞(見表3)。

表3 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動前后全血乳酸的影響(mmol/L)

2.5 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后血清尿素氮的影響

蛋黃粉對照組、低濃度組和高濃度組血清尿素氮均低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。其中蛋黃粉對照組、低濃度組、高濃度組血清尿素氮含量比空白對照組下降18.7%、13.8%、34.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，普通蛋黃粉和活性免疫球蛋白蛋黃粉均可以降低小鼠運(yùn)動后所產(chǎn)生的血清尿素氮，抗疲勞作用明顯(見表4和圖1)。

表4 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后血清尿素氮的影響(mmol/L)

圖1 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后血清尿素氮的影響

2.6 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后肝糖原的影響

實(shí)驗(yàn)組肝糖原含量明顯高于空白對照組，蛋黃粉對照組、低濃度組、高濃度組與空白對照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，蛋黃粉對照組、低濃度組、高濃度組分別比空白對照組肝糖原濃度提高43%、78%、45%。結(jié)果表明，普通蛋黃粉和活性免疫球蛋白蛋黃粉均可提高小鼠肝糖原儲備，延緩疲勞發(fā)生；低濃度活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后肝糖原下降具有更明顯的抑制作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究(見表5和圖2)。

表5 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后肝糖原的影響(mg/g)

圖2 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠運(yùn)動后肝糖原的影響

2.7活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠肝臟丙二醛含量的影響

與空白對照組比較，蛋黃粉對照組及低劑量組丙二醛增高顯著(P<0.05或P<0.01)，高劑量組丙二醛水平與空白對照組沒有明顯變化。由結(jié)果表明，活性免疫球蛋白蛋黃粉對防止小鼠丙二醛堆積，減輕細(xì)胞氧化受損有一定的意義(見表6和圖3)。

表6 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠肝臟丙二醛含量的影響(mmol/L)

圖3 活性免疫球蛋白蛋黃粉對小鼠肝臟丙二醛含量的影響

3 討 論

疲勞是涉及多種生理生化因素的綜合過程，是體力或腦力活動到一定程度時機(jī)體必然會產(chǎn)生的一種正常生理現(xiàn)象，抗疲勞效果包含延緩疲勞的產(chǎn)生和加快疲勞的消除。運(yùn)動、生活、工作過程中，疲勞的發(fā)生不可避免，針對疲勞問題，傳統(tǒng)的藥物干預(yù)，可能對機(jī)體造成毒副作用。補(bǔ)充營養(yǎng)元素對疲勞進(jìn)行干預(yù)，是一種安全無毒副作用的有效措施。運(yùn)動過程中合理改善飲食，增加營養(yǎng)素的攝入，如蛋白質(zhì)、碳水化合物或脂肪酸等，可產(chǎn)生一定的抗疲勞效果。

本實(shí)驗(yàn)采用成年雄性昆明種小鼠作為運(yùn)動疲勞模型，利用免疫雞蛋黃制備的活性免疫球蛋白蛋黃粉和常規(guī)提取方法提取的蛋黃粉作為對照，進(jìn)行灌胃干預(yù)，測定小鼠負(fù)重游泳力竭時間，檢測血乳酸、尿素氮、肝糖原、丙二醛等生化指標(biāo)的變化，探討從免疫雞蛋黃中制備的活性免疫球蛋白蛋黃粉對游泳小鼠的抗疲勞作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃活性免疫球蛋白蛋黃粉組小鼠比灌胃普通蛋黃粉小鼠能夠大幅度延長游泳力竭時間，減少血清中乳酸、肝臟丙二醛和尿素氮含量，提升肝糖原含量，這有利于延緩小鼠的疲勞發(fā)生，提高其運(yùn)動耐力，發(fā)揮抗疲勞的作用。

運(yùn)動耐力的提升是抗疲勞能力增強(qiáng)最直接、客觀的指標(biāo)，負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)裝置簡單，并能夠直觀地獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，被認(rèn)為是重要的抗疲勞實(shí)驗(yàn)指標(biāo)之一[8-9]。本研究顯示：低濃度和高濃度2個劑量，能夠提高小鼠的運(yùn)動能力，改變小鼠運(yùn)動過程中的代謝狀態(tài)，改善運(yùn)動過程中的能量供給，特別是高濃度組能顯著延長小鼠的游泳力竭時間，即能夠有效提高小鼠的運(yùn)動耐受能力。高濃度組小鼠大幅度延長游泳力竭時間的機(jī)制是否存在活性免疫球蛋白蛋黃粉對代謝環(huán)節(jié)的特殊調(diào)節(jié)或其他生理功能的調(diào)節(jié)，有待進(jìn)一步研究。

組織缺氧時可導(dǎo)致機(jī)體三羧酸循環(huán)速率下降，使丙酮酸進(jìn)入有氧氧化發(fā)生障礙，由NADH+H+提供氫，乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原成乳酸，導(dǎo)致機(jī)體乳酸增多。血乳酸過多將使體液呈酸性，進(jìn)一步影響細(xì)胞順利攝取營養(yǎng)和氧氣，使細(xì)胞的正常功能受到影響。堆積的血乳酸會使肌肉發(fā)生收縮，因而擠壓血管，使得血流不暢，使肌肉功能下降，產(chǎn)生疲勞。因此，血乳酸被認(rèn)為是影響運(yùn)動性疲勞的重要因素，可作為評判機(jī)體疲勞程度的指標(biāo)；減少血乳酸的產(chǎn)生和加快乳酸的分解可以反映疲勞的產(chǎn)生和消退[1]。本研究結(jié)果顯示活性免疫球蛋白蛋黃粉可減少乳酸堆積，有效延緩運(yùn)動過程中的疲勞。

血清尿素氮是血漿中除蛋白質(zhì)以外的一種含氮化合物，由蛋白質(zhì)和氨基酸最終代謝而成。機(jī)體在進(jìn)行長時間運(yùn)動過程中，因?yàn)椴荒軓奶穷悺⒅痉纸猥@得足夠的能量，蛋白質(zhì)和氨基酸分解則會加強(qiáng)以滿足機(jī)體能量供應(yīng)，因此機(jī)體內(nèi)的血清尿素氮會有所增加。由于機(jī)體劇烈運(yùn)動后體內(nèi)血清尿素氮含量會明顯增加，所以測定血清尿素氮可以作為評判疲勞程度的指標(biāo)[2]，以反映機(jī)體肌肉蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝狀況。我們的檢測結(jié)果表明，持續(xù)灌注高濃度活性免疫球蛋白蛋黃粉，能更有效地減少體內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化分解，從而減少含氮廢物尿素氮的產(chǎn)生，有利于運(yùn)動過程的持續(xù)進(jìn)行，低濃度的活性免疫球蛋白蛋黃粉反而使尿素氮稍有升高，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

肝糖原是肝臟中葡萄糖聚合物，在機(jī)體需要時可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖而供能。腦組織在正常飲食情況下所需能量主要來自葡萄糖，而腦組織葡萄糖幾乎全部來自血糖，當(dāng)血糖降低時可以引起疲勞。當(dāng)機(jī)體進(jìn)行劇烈運(yùn)動時，各組織消耗葡萄糖均增多，骨骼肌消耗肌糖原增多，導(dǎo)致血糖水平降低，而肝糖原釋放葡萄糖入血維持血糖平衡。若肝糖原儲備量降低，不能維持血糖平衡，則會導(dǎo)致疲勞的發(fā)生[3]。本研究表明，灌胃活性免疫球蛋白蛋黃粉與普通蛋黃粉后，均具有增加糖原儲備，延緩疲勞的作用。

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的主要代謝產(chǎn)物。體內(nèi)某些物質(zhì)代謝過程及某些外源性藥物或毒物在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的自由基，可引起脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用產(chǎn)生MDA等醛類物質(zhì)，進(jìn)而作用于脫氧核糖核酸(DNA)、膜蛋白和酶等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生改變，這對細(xì)胞具有嚴(yán)重的損害作用。近年在研究中發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化作用對于某些疾病的發(fā)生發(fā)展起到一定作用。因此，對體內(nèi)MDA含量的測定在一定程度上可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，體現(xiàn)了細(xì)胞或機(jī)體受損程度，對于監(jiān)測身體狀況、疲勞程度、研究某些疾病或藥物的作用，具有一定的價值[10]。本研究檢測結(jié)果表明，與空白對照組比較，蛋黃粉對照組及低濃度組小鼠丙二醛含量有所升高，而高濃度組小鼠丙二醛水平與空白對照組沒有明顯變化，其原因可能是由于灌胃使小鼠產(chǎn)生的應(yīng)激導(dǎo)致丙二醛含量升高，而持續(xù)灌注高濃度活性免疫球蛋白蛋黃粉，又防止丙二醛堆積，減少體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，減輕細(xì)胞或機(jī)體氧化受損，具有延緩疲勞發(fā)生的作用。

綜上所述，通過低溫制備的活性免疫球蛋白蛋黃粉，能夠改變小鼠運(yùn)動過程中的代謝狀況，改善運(yùn)動過程中的能量供給，明顯提高小鼠運(yùn)動耐受能力，并減少乳酸、丙二醛等代謝產(chǎn)物的堆積，減少機(jī)體對蛋白質(zhì)的過度消耗，增加肝糖原儲備，為運(yùn)動過程持續(xù)供給能量，延緩疲勞的發(fā)生，提高小鼠的運(yùn)動能力，發(fā)揮抗疲勞的作用。

致謝“特異性免疫球蛋白功能性檢測技術(shù)方法的建立與功效測定”資金來源于濰坊康奧思生物技術(shù)有限公司，在此表示真誠的感謝。