穴注加貼敷對哮喘大鼠血清IL-10、IL-17和肺組織ICAM-1表達的影響*

耿立梅，閆紅倩，于向艷，馬璇雯，牛曉艷

(1. 河北省中醫(yī)院呼吸一科, 石家莊 050011； 2. 石家莊市中醫(yī)院呼吸科，石家莊 050000；3. 鄭州市管城中醫(yī)院內(nèi)科，鄭州 450000)

哮喘是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，具有復雜的發(fā)病機制。研究證實，ICAM-1、IL-10以及IL-17在哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。ICAM-1參與呼吸道炎癥形成的早期階段，可介導白細胞在呼吸道黏膜的黏附和轉(zhuǎn)移；IL-10在炎癥早期可抑制促炎因子、 趨化因子的合成，阻斷炎癥細胞釋放促炎性細胞因子；IL-17是T 細胞誘導的炎癥反應的啟動因素，對炎癥細胞有強大的化學趨化作用。 Treg/Th17細胞及其相關(guān)細胞因子IL-10/IL-17比例失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎。中醫(yī)的貼敷及穴注治療哮喘的療效也被研究所證實。本研究旨在探討穴注加貼敷對哮喘大鼠血清IL-10、IL-17和肺組織ICAM-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性Wistar SPF級大鼠60只，體質(zhì)量(120±20) g，由河北醫(yī)科大學實驗室提供。將動物按隨機數(shù)字表法分為正常組(A)、模型組(B)、貼敷組(C)、穴位注射組(D)和貼敷組+穴位注射組(E)各12只。

1.2 主要試劑和儀器

雞卵蛋白(Sigma),氫氧化鋁(分析純，成都科龍化工試劑廠),IL-10定量酶檢測試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司), IL-17定量酶分析試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)，免疫組化試劑盒：一抗：兔抗小鼠ICAM-1(北京博安生物科技有限公司)，二抗：山羊抗兔 IgG抗體-HRP多聚體(北京中山金橋生物技術(shù))，顯微圖像分析系統(tǒng)HMIAS-2000(武漢同濟醫(yī)科大學)，數(shù)碼顯微鏡 DP73(Olympus公司),草分枝桿菌 FU36 注射液1.72 μgml(成都金星健康藥業(yè)有限公司),貼敷(河北省中醫(yī)院呼吸科)。

1.3 造模方法

在第1天和第8天給予腹腔注射OVA和氫氧化鋁懸浮液1 mL[1-2]，并給予正常組注射相同量的生理鹽水。 在第15天將大鼠置于獨立的密封霧化箱中進行霧化，并用2%OVA溶液進行超聲霧化。 每天1次用生理鹽水替換正常組，每次30 min。 各組大鼠的行為發(fā)生了變化。 在霧化組中，有呼吸短促、咳嗽、煩躁、點頭，甚至四肢柔軟易發(fā)，尿失禁和大小便失禁。 挑戰(zhàn)持續(xù)7 d，然后每周2次。

1.4 實驗方法

在成功建模后的第22天開始干預。 穴位大椎、雙頂川、雙肺、脾、雙腎服用。 剃須后，食欲組大鼠剃毛， 發(fā)表于6 h; 穴位注射組注射穴位結(jié)核，5組穴位輪流取穴，每穴5 μl; 在應用組中應用穴位，然后應用中藥6 h，模型組用相同的治療組治療。 更換相同量的生理鹽水和空貼紙,每隔1 d操作1次，每次治療3次，共4個療程。

1.5 標本采集

在實驗結(jié)束時，將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml / 100 mg)麻醉，以仰臥位固定，并將動脈血從右側(cè)腹股溝取出至血液收集管。 將管放置30 min，以3000 r/min離心并分配血清,收集放入冷凍管中，在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線，將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定，在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線，將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE染色 右肺中葉常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色。

1.6.2 ELISA檢測 酶標儀采用HBS-1096C Pro自動酶標儀(上海珂淮儀器有限公司)，IL-10和IL-17的ELISA檢測試劑盒分別為北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司上海森雄科技實業(yè)有限公司生產(chǎn)。根據(jù)試劑盒說明書嚴格操作，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-10、IL-17水平。

1.6.3 免疫組化檢測 嚴格按照SABC免疫組化試劑盒說明操作：切片常規(guī)脫蠟脫水→3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶→滴加一抗(兔抗鼠 ICAM-1，1∶100稀釋)37 ℃孵育4 h→滴加二抗(羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體， 1∶200稀釋) →37 ℃孵育20 min→滴加SABC 37 ℃孵育20 min→DAB顯色，鏡下控制反應時間5 min，蒸餾水終止反應→脫水封片→光鏡下觀察、照相和分析。

根據(jù)盲法原則，采用日本OLYMPUS公司的AX-70顯微成像系統(tǒng)進行觀察分析及照相，每只大鼠取6張切片，每張切片隨機取2個視野照相。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測定ICAM表達的平均光密度值(IOD)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 肺組織HE染色

圖1顯示，氣管周圍及肺組織內(nèi)的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎性細胞HE染色后呈藍色。對照組：細支氣管上皮完整，形態(tài)規(guī)則，支氣管壁不增生，肺泡形態(tài)規(guī)則，肺泡壁規(guī)則；模型組：氣管和肺組織周圍有大量炎性細胞浸潤，支氣管狹窄，上皮細胞分離，黏膜水腫，肺泡腔明顯變小;穴位組：與模型組比較，炎癥細胞浸潤減少，支氣管形態(tài)略微縮小，肺泡形態(tài)不規(guī)則;貼片組：與模型組比較，細支氣管形態(tài)較正常，腔內(nèi)無明顯上皮細胞脫落，壁內(nèi)炎癥細胞，肺泡形態(tài)不完善;穴位注射+貼片組：細支氣管形態(tài)規(guī)則，管周圍可見小炎癥細胞，黏膜正常，肺泡腔形態(tài)較規(guī)則，個別肺泡壁增厚，炎癥細胞增多。

2.2 各組血清IL-10、IL-17和IgE含量比較

表1顯示，血清IL-10、IL-17和IgE含量統(tǒng)計學比較顯示，模型組大鼠IL-17、IgE高于正常組，IL-10低于正常組，差異顯著(P<0.05)；3個治療組的IL-17和IgE均低于模型組，IL-10高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 IL-17含量：應用組+注射組低于應用組和注射組， 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 穴位組與斑塊組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。 IgE含量：貼劑+穴位注射組的應用低于穴位注射組和應用組(P<0.05)。 穴位注射組與放置組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。 IL-10含量：貼劑+穴位組高于貼劑組和空穴注射組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，穴位組與貼劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織ICAM-1的表達比較

表1圖2顯示，在正常組支氣管周圍觀察到少量棕黃色陽性細胞， 模型組在支氣管和支氣管分泌物以及間質(zhì)和肺泡棕黃色顆粒周圍具有更多表達。 ICAM-1的平均光密度高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 應用組和穴位組中的棕黃色顆粒小于模型組。 ICAM-1的表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 斑塊+穴位組中棕黃色陽性細胞表達不明顯。 與注射組比較，ICAM-1的平均光密度低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 穴位組和貼劑組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

3 討論

支氣管哮喘(下稱哮喘)是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，其病理生理學機制包括炎癥細胞、炎癥介質(zhì)與呼吸道組織和細胞間的復雜相互作用，導致急性支氣管痙攣，呼吸道壁水腫，黏液分泌增加和呼吸道重構(gòu),從而引起呼吸道阻塞。此外，炎癥還可以引起呼吸道反應性增高。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘的發(fā)病機制主要與免疫反應有關(guān)，其中，呼吸道炎癥是哮喘發(fā)病的主要原因之一。本實驗中，模型組血清IL-10含量明顯低于對照組，表明在哮喘的炎癥階段IL-10的含量減低。IL-10是一類強大的免疫抑制因子，主要由CD4+CD25+ Tregs 細胞合成分泌。此外，TH2、TH1淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞也都是其來源[3]。IL-10可抑制促炎因子、趨化因子的合成以及與受體的結(jié)合，并且阻斷炎癥細胞釋放促炎癥細胞因子[4]。缺乏IL-10可能是哮喘的重要原因。 通常認為，Th1 / Th2細胞因子的比例是不平衡的，并且TH2細胞因子的優(yōu)勢是哮喘的免疫學基礎。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，Treg / Th17細胞及其相關(guān)細胞因子IL-10 / IL-17的失衡也是哮喘發(fā)病機制的重要病理生理基礎[5]。

表1 各組血清IL-10、IL-17、IgE含量及ICAM-1在肺組織中IOD值表達比較

注： 與模型組比較：*P<0.05； 與穴注組比較：#P<0.05；與貼敷組、穴注組比較：△P<0.05; 與貼敷組、穴注組比較：▲P<0.05

圖1 各組大鼠肺組織HE染色比較

圖2 各組大鼠肺組織ICAM-1表達比較(免疫組化分析)

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-17明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義。這與文獻關(guān)于IL-17具有促炎作用的研究相符合，提示IL-17對哮喘炎癥反應的促進作用。有研究顯示，IL-17水平可以作為評估嚴重支氣管哮喘的獨立危險因素[6]。哮喘大鼠氣道的高反應性依賴于TH17細胞應答及中性粒細胞浸潤，表明TH17細胞及其細胞因子IL-17是促進哮喘加重的關(guān)鍵因素[7]。實驗中的模型組大鼠血清IL-17含量明顯高于正常組，而IL-10低于正常組，經(jīng)穴位貼敷組、穴位注射組、穴位注射+貼敷組治療后大鼠的血清IL-17含量較模型組降低，IL-10含量較模型組升高。同時HE染色顯示，血管周圍有少量炎癥細胞，支氣管形態(tài)規(guī)則，黏膜正常，肺泡腔形態(tài)規(guī)則。 上述結(jié)論進一步表明，Treg細胞和TH17細胞之間的失衡是哮喘的重要原因[8]，Treg細胞分泌IL-10減少，可導致免疫細胞失衡而發(fā)生哮喘，而IL-10與IL-17的表達失衡，從某種方面也反映了Treg/TH17的失衡狀態(tài)。

該研究中的另一個指標是細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，在從血管到炎癥部位的白細胞如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等積累中起關(guān)鍵作用[9]。 ICAM-1主要在白細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞和肺組織中表達。當哮喘發(fā)生時，ICAM-1可以介導和促進上述細胞的黏附[10]。有研究表明，ICAM-1與哮喘的呼吸道炎癥有密切聯(lián)系，使用抗ICAM-1單抗能夠改善哮喘動物模型呼吸道的炎癥細胞浸潤[11]。也有研究推斷[12]， ICAM-1能夠協(xié)同炎性因子加快嗜酸粒細胞等炎癥細胞向氣道浸潤，ICAM-1對于氣道炎癥程度的影響很大。模型組大鼠肺組織免疫組化的平均積分光密度(OD)值明顯高于正常對照組，表明在哮喘大鼠的炎癥階段，ICAM-1的表達增強，減少ICAM-1的表達，可以減少氣道炎癥從而控制哮喘。

傳統(tǒng)醫(yī)學的內(nèi)病外治常配合穴位敷貼來完成。 穴位敷貼對于藥物有放大和增敏作用[13]。貼敷藥物由白芥子、延胡索、甘遂、細辛、百部、五味子、前胡、麻黃組成。上述藥研磨過篩，加用姜汁、香油調(diào)制，選用辛香走竄之品，具有辛溫散寒平喘之功，配以行氣化痰、斂肺平喘藥物，達到祛痰鎮(zhèn)咳平喘的作用。加之對以上穴位的刺激，肺、脾、腎三臟同調(diào)，達到宣肺理氣、健脾化痰、培元固本的作用。此外，草分枝桿菌是一種滅活的非病原性細菌[14]，能夠促進外周血單個核細胞產(chǎn)生γ-IFN、IL-4，促進TH細胞成熟，上調(diào)TH1細胞功能，從而調(diào)節(jié)Th1 /Th2的平衡，起到防治哮喘的作用[15]。并且能夠提高機體IgG、IgM的水平，從而調(diào)整T細胞亞群的含量，發(fā)揮提高免疫功能的作用[16]。本實驗將草分枝桿菌作為穴位注射藥物注射于哮喘大鼠模型，為草分枝桿菌的應用尋找新的注射方法，也是尋找哮喘防治更有效的手段。穴位敷貼組、穴位注射組、穴位注射+黏連組ICAM-1的表達均低于模型組，表明3種方法均有效。 穴位組和斑塊組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，穴位暴露組ICAM-1表達低于其他組。 結(jié)果表明，3種方法均可通過降低肺組織ICAM-1的表達，抑制炎癥細胞的積聚，減輕哮喘的癥狀。 應用效果與穴位注射相似，穴位注射聯(lián)合應用效果更好。

綜上所述，穴位注射聯(lián)合貼敷可提高哮喘大鼠血清IL-10含量，降低IL-17、IgE水平及ICAM-1的表達。