基于Rho/ROCK信號通路的針刺對高脂血癥模型大鼠血管內皮保護機制研究

陶 歡，劉盛菲，凌 敏

(廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510006)

高脂血癥是指人體脂肪代謝或轉運異常，血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等主要脂質成分超過正常范圍。大量的研究表明，高脂血癥是導致心腦血管疾病的主要危險因素，通過損傷血管內皮參與動脈粥樣硬化、腦卒中、冠心病等心腦血管疾病的病理過程。因此，有效防治高脂血癥、保護血管內皮功能對心腦血管疾病具有重要意義。Rho/ROCK信號通路近年來已成為心血管疾病研究的熱點，研究表明其與動脈粥樣硬化以及血管內皮結構改變、功能變化關系密切[1-2]。大量研究也表明，針刺能夠有效改善血脂代謝，改善血管內皮功能[3]，但其作用機制尚不明確。本實驗通過建立高脂血癥大鼠模型，觀察其一般狀態(tài)及體質量變化，測定血脂4項以及血清水平，觀察主動脈HE染色下形態(tài)學改變，采用Western blot 法檢測主動脈RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表達水平，探討針刺改善高脂血癥血管內皮功能的機制，為其臨床防治高脂血癥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級雄性SD大鼠30只，體質量(200±10) g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。實驗前所有大鼠均進行適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、針刺組各10只。

1.2 主要試劑及儀器

維生素D3注射液(1 ml:7.5 mg×10支/盒，上海通用藥業(yè)股份有限公司)，NO試劑盒、ET-1試劑盒、Elisa試劑盒(南京建成生物有限公司), RhoA、ROCK2、MLCP抗體(美國 ABCAM 公司)，Synergy HTX多功能酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)，海康YB2000電子天平(上海拓西電子科技有限公司)，TKY-BMC石蠟包埋機(湖北泰康醫(yī)療設備有限公司)，R239型輪轉式石蠟切片機(湖北泰維科技公司)，TG-18 W高速離心機(濟南來寶醫(yī)療器械有限公司)，902-ULTS超低溫冰箱(美國賽默飛公司)，CX31光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)等。

1.3 飼養(yǎng)及模型制備

空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組及針刺組大鼠給予一次性腹腔注射維生素D360萬單位/Kg，并配合高脂乳劑灌胃(高脂乳配方：吐溫-80 20%+丙二醇30%+豬油20%+膽固醇10%+膽酸鈉3%+丙基硫氧嘧啶1%)4周，并測量血脂4項確認血脂升高。造模成功后，空白組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組及針刺組大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)。

1.4 干預方法

從第5周開始空白組、模型組只做固定不進行任何治療。針刺組選用雙側“脂三針”(內關、足三里、三陰交)，取穴方法參照《實驗針灸學》[4]。內關直刺1 mm，足三里直刺7 mm，三陰交直刺5 mm，針刺后接英迪牌KWD-808-I電針儀，疏密波，頻率5～25 Hz，強度以肌肉輕微顫動為度，每次留針25 min，每日1次，連續(xù)干預3周。

1.5 血清及血脂水平測定

實驗結束后，使用真空管對腹主動脈采血2～3 mL， 3000 r/min 離心15 min分離血清。采用ELISA方法檢測一氧化氮(NO)、內皮素-1(ET-1)含量，采用全自動生化儀檢測血脂4項(TC、TG、HDL-C、LDL-C)水平。

1.6 HE染色觀察主動脈形態(tài)學變化

實驗結束后，隨機切取主動脈組織并放入4%多聚甲醛中固定，脫水、包埋、切片、脫蠟至水、HE染色，在光鏡下觀察主動脈形態(tài)學改變并選取典型視野拍照。

1.7 Western blot法測定主動脈 RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表達

取各組大鼠主動脈組織 100 mg，在均質勻漿機中完全搖勻， 1200 r /min 離心10 min取上清，BCA法測定蛋白濃度。依次灌膠上樣、切膠、備膜、裝膜、裁膜。加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫下孵育30 min，采用 ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)進行曝光。內參采用GAPDH，以RhoA、ROCK2、MLCP與 GAPDH 的積分光密度比值作為其相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)及體質量變化

表1顯示，整個實驗過程中空白組大鼠表現(xiàn)活躍，精神狀態(tài)良好，反應靈敏，毛發(fā)富有光澤，體質量增長穩(wěn)定；4周后模型組、針刺組大鼠活動減少，精神倦怠，反應較遲緩，毛發(fā)枯黃無光澤，體質量增長較快，體型較肥胖；7周后模型組大鼠活動緩慢，精神狀態(tài)萎靡，反應遲鈍，體質量繼續(xù)增長，針刺組大鼠較模型組上述一般狀態(tài)改善，體質量降低。

表1 各組大鼠體質量變化情況比較

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 各組大鼠血脂4項比較

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組大鼠TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血脂4項含量比較

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 大鼠血管內皮形態(tài)學變化

圖1顯示，光鏡下空白組主動脈形態(tài)正常，各層分界清晰，內膜光滑完整，內皮細胞排列連續(xù)，血管平滑肌細胞排列規(guī)則整齊。模型組內中外膜三層分界不清，內膜嚴重增厚，內皮細胞損傷水腫，血管平滑肌細胞排列紊亂。針刺組主動脈形態(tài)較正常，各層邊界較清晰，內膜尚完整，無明顯增厚，病理損傷有不同程度改善。

2.4 各組大鼠血清NO、ET-1含量比較

表3顯示，與空白組比較，模型組NO含量下降、ET-1含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組NO含量升高，ET-1含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明針刺能升高高脂血癥大鼠NO含量，降低其ET-1含量，對血管內皮具有保護作用。

2.5 各組大鼠血管內皮RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表達比較

表3圖2顯示，與空白組比較，模型組RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明針刺能降低相關蛋白表達，抑制Rho/ROCK通路激活。

圖1 各組大鼠主動脈血HE染色(×200)

組別鼠數(shù)NO(umol/L)ET-1(pg/ml)RhoAROCK2MLCP空白組1081.56±5.4358.45±4.341.32±0.151.53±0.181.41±0.16模型組1048.38±4.96?121.27±5.15?4.17±0.23?3.71±0.24?4.93±0.32?針刺組1067.29±4.62#74.42±3.76#2.81±0.19#2.45±0.21#2.75±0.16#

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖2 各組大鼠血管內皮RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表達比較

3 討論

高脂血癥是一種臨床常見病、多發(fā)病，特別是近年來發(fā)病率逐年攀升，已成為腦卒中、冠心病等心腦血管疾病的主要病理因素。中醫(yī)學認為，本病多為肝脾腎臟腑功能失調，氣血化生運行代謝紊亂，導致痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物夾雜，為本虛標實之證。針刺治療本病具有很大優(yōu)勢，內關、足三里、三陰交為靳三針之“脂三針”穴組處方，臨床驗證療效顯著。內關穴為八脈交會穴之一，與陰維脈相通，主治心胸胃疾病，能理氣、寬胸、和胃；足三里為足陽明胃之合穴、胃之下合穴，是治病保健第一要穴；三陰交為肝、脾、腎三陰經(jīng)交會穴，可調節(jié)足三陰經(jīng)及經(jīng)絡所屬臟腑經(jīng)氣。三穴配合可理氣健脾和胃，化濕祛痰除瘀。相關研究[5]表明，“脂三針”能有效降低血脂水平，調節(jié)整體內分泌代謝功能，還能改善高脂血癥、動脈硬化、冠心病等心腦血管疾病的癥狀。

NO是最具代表性的血管舒張因子，ET是作用最強烈的血管收縮因子。生理狀態(tài)下，ET可促進內皮細胞NO的釋放，NO對ET導致的血管收縮可進行負性調節(jié)以抑制ET的合成釋放。兩者作為一對拮抗因子，其血管活性物質的相對平衡狀態(tài)對調節(jié)血流動力、維持正常血管張力具有重要意義，常作為反映血管內皮功能的指標。本研究顯示，模型組大鼠血管內皮形態(tài)學病理變化明顯，內皮細胞脫落嚴重，內膜增生嚴重，血清NO合成減少， ET-1釋放增多。而針刺組NO合成增加， ET-1表達降低，血管內皮病理損傷程度明顯改善，說明針刺能較好地修復內皮結構并保護其功能。

Rho/ROCK信號通路在心血管疾病發(fā)病機制中具有重要作用，尤其對于血管內皮功能影響較大。Rho/ROCK信號通路主要包括Rho GTP酶和ROCK兩部分。RhoA是Rho GTP酶中的典型蛋白，而ROCK是Rho下游靶效應分子中功能研究最為詳細的分子。正常狀態(tài)下，ROCK可調節(jié)血管內皮細胞的通透性，保護內皮屏障的完整性，增加NO 的生成，誘導血管舒張，促進單核細胞遷移。血管內皮損傷狀態(tài)下，ROCK活化可抑制血管舒張，增加血管內皮通透性，并參與動脈粥樣硬化斑塊形成過程[6]。

在某些病理因素的刺激和誘導下，RhoA通過激活下游ROCK，ROCK的亞型ROCK2可直接引起MLCP磷酸化，增加血管平滑肌細胞收縮。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠RhoA，ROCK2及其下游底物MLCP表達均增高，說明血管內皮功能障礙時Rho/ROCK信號通路處于激活狀態(tài)，且蛋白活性變化趨勢與ET-1相一致，而與NO變化趨勢相反，血管舒縮功能異常，這也說明Rho/ROCK通路能調節(jié)血管舒縮，維持血管正常功能。這與相關研究Rho/ROCK通路激活可減弱 eNOS基因的穩(wěn)定性使NO 表達下降的結論一致[7]。通過觀察HE染色下主動脈形態(tài)學改變，提示針刺可以降低RhoA、ROCK2、MLCP表達量，增加NO活性，同時又可改善血管內皮損傷程度，所以推測針刺可能通過提高NO表達來抑制Rho/ROCK通路相關蛋白表達，以達到保護血管內皮功能的目的。

綜上，針刺能夠改善高血脂模型大鼠的精神狀態(tài)，降低血脂水平，提高血管舒張因子NO 含量， 降低血管收縮因子ET-1含量，修復血管內皮損傷，改善血管內皮功能，推測可能與抑制Rho/ROCK通路激活有關。因此，針刺能較好地改善高脂血癥以及相關心腦血管疾病，本研究結果對臨床推廣具有積極作用。