小鼠骨骼肌細(xì)胞離體胰島素抵抗模型的建立和驗(yàn)證*

羅 維， 艾 磊， 李 顯， 王博發(fā)， 周 越△

(1北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理學(xué)教研室， 北京 100084； 2南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康科學(xué)系， 江蘇 南京 210014；3江蘇省體育科學(xué)研究所， 江蘇 南京 210033)

國(guó)際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，2017年全球糖尿病患者人數(shù)達(dá)4.25億，預(yù)計(jì)2045年將達(dá)6.29億，每6秒就有1位患者因糖尿病死亡，其中大部分患者為2型糖尿病[1-2]。胰島素抵抗是2型糖尿病的最主要病理特征，其不僅貫穿于2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，還是心腦血管疾病、乳腺癌和阿爾茲海默癥等疾病的共同病理基礎(chǔ)[3-6]。胰島素抵抗是指單位濃度的胰島素細(xì)胞效應(yīng)減弱，其實(shí)質(zhì)為胰島素激活的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及靶細(xì)胞的糖代謝降低，在分子水平是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損的結(jié)果[7]。

目前，防治胰島素抵抗的基礎(chǔ)研究仍以動(dòng)物模型為主，但其缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，需要投入較大人力和物力[8]，而從細(xì)胞和分子水平進(jìn)行深入研究有助于更好地探索胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，是進(jìn)行胰島素抵抗和相關(guān)疾病病理機(jī)制探索及藥物研發(fā)的重要途徑[9-10]。構(gòu)建穩(wěn)定的胰島素抵抗離體細(xì)胞模型有利于直觀快捷地探討胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)理并進(jìn)行相關(guān)藥物篩選[11]。

骨骼肌是胰島素作用的靶器官，胰島素刺激下人體80%以上的葡萄糖攝取在骨骼肌中完成[12-13]，因此骨骼肌為胰島素抵抗發(fā)生的主要部位。C2C12細(xì)胞是由C3H小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化而來(lái)的細(xì)胞株，因其形態(tài)特性均一，且可無(wú)限代培養(yǎng)，是體外研究骨骼肌胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制和降糖藥物作用機(jī)制的理想細(xì)胞模型[14]。鑒于目前關(guān)于建立C2C12細(xì)胞胰島素抵抗模型的研究報(bào)道實(shí)驗(yàn)條件不一，方法各異，且胰島素抵抗效果不穩(wěn)定[15]，本課題組在離體胰島素抵抗模型建立中進(jìn)行了較長(zhǎng)時(shí)間的研究，通過(guò)采用不同濃度葡萄糖干預(yù)C2C12細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)，實(shí)時(shí)收集細(xì)胞檢測(cè)其基礎(chǔ)和胰島素刺激下的熒光標(biāo)記葡萄糖2-NBDG攝取水平及胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探索高糖刺激與C2C12細(xì)胞胰島素抵抗之間的量效關(guān)系，期望構(gòu)建穩(wěn)定可重復(fù)的離體骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型，促進(jìn)胰島素抵抗和相關(guān)疾病的病理機(jī)制探索及相關(guān)藥物研發(fā)與篩選，進(jìn)而推進(jìn)胰島素抵抗等慢性疾病的防治研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞C2C12購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。C2C12細(xì)胞傳代到足夠細(xì)胞量后統(tǒng)一凍存，選取同一代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。于1 mL無(wú)糖分化液中分別溶入7.2 mg和10.8 mg D-葡萄糖(Aladdin，G116307)配制葡萄糖濃度為40 mmol/L和60 mmol/L的分化液，正常分化液中葡萄糖濃度為25 mmol/L。

待C2C12細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、40 mmol/L葡萄糖(40)組和60 mmol/L葡萄糖(60)組，誘導(dǎo)分化，其中，對(duì)照組分化液中葡萄糖濃度為25 mmol/L，40組分化液中葡萄糖濃度為40 mmol/L，60組分化液中葡萄糖濃度為60 mmol/L，每組設(shè)置48個(gè)復(fù)孔，分別在誘導(dǎo)分化1、3、5和7 d后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，收集細(xì)胞時(shí)每組12個(gè)復(fù)孔，再于組內(nèi)隨機(jī)分為胰島素組和PBS組，分別加入200 nmol/L胰島素和等量PBS，繼續(xù)孵育30 min后收集細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性的影響。

2 主要試劑

無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，Gibco)；馬血清(horse serum，HS， HyClone)；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)探針2-NBDG(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)用胰島素(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(glucose transporter 4， GLUT4)抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

3 主要方法

3.1小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化培養(yǎng) C2C12細(xì)胞采用細(xì)胞生長(zhǎng)液(25 mmol/L 葡萄糖、DMEM培養(yǎng)基、10% FBS、青霉素和鏈霉素各100 mg/L)，于5% CO2、37 ℃細(xì)胞孵育箱中孵育，依細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)1～2 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞以每皿1.0×106個(gè)的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿或以每孔4×105個(gè)的密度接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～90%融合度時(shí)，按方法1中分組方式隨機(jī)分為3組，將生長(zhǎng)液更換為分化液(DMEM培養(yǎng)基、2% HS、青霉素和鏈霉素各100 mg/L)，誘導(dǎo)分化，隔24 h更換分化液。每天在相差顯微鏡下觀察多核肌管形成并采集圖像。

3.22-NBDG法檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)C2C12細(xì)胞基礎(chǔ)糖攝取和胰島素刺激糖攝取的影響 2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)是天然D-葡萄糖衍生物，通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，2-DG第2位氧原子被熒光基團(tuán)NBD取代形成2-DG的熒光類(lèi)似物, 即2-NBDG。2-NBDG激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)為540 nm, 能夠被熒光酶標(biāo)儀探測(cè)。C2C12細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，按方法3.1中實(shí)驗(yàn)條件處理后，分別用不同濃度葡萄糖干預(yù)1、3、5和7 d 后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。收集細(xì)胞后常溫PBS洗1次，每孔加入1 mL含2%牛血清白蛋白的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，孵育3 h后再組內(nèi)隨機(jī)分為胰島素組和PBS組，分別用胰島素或PBS干預(yù)30 min，避光條件下每孔加入3 μL 2-NBDG，孵育30 min，預(yù)冷PBS洗2遍，以熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)并統(tǒng)計(jì)相對(duì)熒光值。制作2-NBDG濃度和熒光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞攝取2-NBDG的濃度。

3.3Western blot檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)GLUT4蛋白表達(dá)量的影響 不同濃度葡萄糖處理5 d和7 d后收集細(xì)胞，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2 mL EP管，4°C離心留沉淀，每管加入裂解液150 μL，混勻，置冰上裂解25 min；取10 μL裂解的蛋白液加入蛋白定性液，分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度；剩余蛋白液加入等體積2×loading buffer，100 °C加熱10 min，4 °C 離心取上清。Wes-tern blot 蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)100 V電壓電泳和60 V電壓電轉(zhuǎn)后取出NC膜，麗春紅預(yù)染剪下對(duì)應(yīng)條帶,封閉2 h后分別加入對(duì)應(yīng) I 抗，抗GLUT4 抗體的濃度為1 ∶2 000，抗β-actin抗體的濃度為1∶5 000。孵育過(guò)夜，加入 II抗，孵育2 h。X射線曝光膠片顯影。顯影后的膠片掃描導(dǎo)入Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

3.4免疫熒光組化檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)GLUT4蛋白分布的影響 細(xì)胞誘導(dǎo)分化5天后，用1 mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，5%羊血清封閉1 h；5%羊血清配制GLUT4抗體，濃度為1 ∶100，孵育過(guò)夜，5%羊血清配制山羊抗兔紅色I(xiàn)I抗，濃度為1 ∶200，孵育2 h；配制DAPI工作液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿500 mL，避光儲(chǔ)存于4 °C。激光共聚焦顯微鏡采集圖像，觀察細(xì)胞膜上GLUT4的分布情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Origin 7.5軟件繪制圖表。

結(jié) 果

1 不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)C2C12細(xì)胞形態(tài)的影響

在倒置相差顯微鏡下觀察以不同濃度葡萄糖干預(yù)的C2C12細(xì)胞形態(tài)的變化，對(duì)照組誘導(dǎo)分化第3天出現(xiàn)匯聚融合現(xiàn)象并有細(xì)小肌管形成，第5 天肌管數(shù)量明顯增加、體積明顯變大，第7 天形成大量粗大的肌管(圖1中紅色箭頭標(biāo)示處)；40組誘導(dǎo)分化第5 天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)小肌管，第7 天肌管數(shù)量增多；而60組直到第7 天才開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)小肌管，同時(shí)未見(jiàn)明顯增殖。以上形態(tài)學(xué)結(jié)果提示，高糖干預(yù)明顯抑制C2C12細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，且存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性，60 mmol/L葡萄糖干預(yù)5 天肌管明顯減少，干預(yù)7 天抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

2 不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)C2C12細(xì)胞糖攝取能力的影響

不同濃度葡萄糖干預(yù)第1 天，3組細(xì)胞2-NBDG基礎(chǔ)攝取量無(wú)顯著差異(P>0.05)，且以200 nmol/L胰島素刺激后，3組細(xì)胞2-NBDG攝取量均明顯增加(P<0.01)；干預(yù)3 d后，3組細(xì)胞2-NBDG基礎(chǔ)攝取量仍無(wú)顯著差異(P>0.05)，但以胰島素刺激后，對(duì)照組2-NBDG攝取量明顯增加(P<0.01)，40組2-NBDG攝取量也明顯增加(P<0.05)，而60組2-NBDG攝取量未見(jiàn)明顯增加(P>0.05)；干預(yù)5 d后，3組細(xì)胞胰島素刺激的2-NBDG攝取量變化趨勢(shì)與第3天基本一致，同時(shí)60組細(xì)胞2-NBDG基礎(chǔ)攝取量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；干預(yù)7 d后，3組細(xì)胞的2-NBDG基礎(chǔ)攝取量和胰島素刺激的2-NBDG攝取量與第5 天趨勢(shì)基本一致，見(jiàn)圖2。以上葡萄糖攝取結(jié)果提示，高糖干預(yù)明顯降低C2C12細(xì)胞基礎(chǔ)和胰島素刺激的糖攝取能力，且存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性，以60 mmol/L葡萄糖干預(yù)5 d出現(xiàn)明顯抑制，干預(yù)7 d抑制效果進(jìn)一步加強(qiáng)。

Figure 1.The morphological changes of the C2C12 cells treated with glucose at different concentrations were observed under phase contrast microscope. The scale bar=100 μm.

圖1 不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)C2C12細(xì)胞形態(tài)的影響

3 不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)C2C12細(xì)胞 GLUT4蛋白表達(dá)的影響

檢測(cè)不同濃度葡萄糖干預(yù)5 d和7 d后細(xì)胞基礎(chǔ)GLUT4蛋白表達(dá)和200 nmol/L胰島素刺激的GLUT4蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，干預(yù)5 d和7 d后對(duì)照組胰島素刺激的GLUT4水平均顯著高于基礎(chǔ)GLUT4水平(P<0.05)，而5 d后，60組胰島素刺激的GLUT4水平與基礎(chǔ)GLUT4水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，7 d后甚至低于基礎(chǔ)GLUT4水平。40組在第5天后與60組變化趨勢(shì)一致，但第7天后，與對(duì)照組相比基礎(chǔ)GLUT4水平顯著降低，胰島素刺激后顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)圖3。以上結(jié)果提示，高糖干預(yù)明顯降低C2C12細(xì)胞的基礎(chǔ)和胰島素刺激的GLUT4蛋白表達(dá)，且存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性，60 mmol/L葡萄糖干預(yù)5 d明顯抑制GLUT4的蛋白表達(dá)，干預(yù)7 d抑制效果進(jìn)一步加強(qiáng)。

4 不同濃度葡萄糖干預(yù)5 d對(duì)C2C12細(xì)胞膜上 GLUT4蛋白分布的影響

3組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞膜GLUT4免疫熒光染色，隨機(jī)選取3個(gè)14 mm×14 mm視野采集圖像，并計(jì)算相對(duì)熒光水平。40組細(xì)胞膜上GLUT4熒光水平低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。60組細(xì)胞膜的GLUT4熒光水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。以上結(jié)果提示高糖干預(yù)5 d明顯降低C2C12細(xì)胞膜 GLUT4表達(dá)量，且存在劑量依賴(lài)性，以60 mmol/L葡萄糖干預(yù)抑制效果最明顯，說(shuō)明60 mmol/L葡萄糖干預(yù)不僅導(dǎo)致細(xì)胞中GLUT4蛋白表達(dá)降低，同時(shí)抑制GLUT4蛋白向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制C2C12細(xì)胞葡萄糖的攝取。

Figure 2.The changes of glucose uptake in the C2C12 cells treated with glucose at different concentrations. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vscontrol group.

圖2 不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響

Figure 3.The changes of GLUT4 protein expression in the C2C12 cells treated with glucose at different concentrations for 5 d (A) and 7 d (B) respectively. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖3 不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)C2C12細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.The changes of GLUT4 fluorescence intensity in C2C12 cell membrane treated with glucose at different concentrations for 5 d. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖4 不同濃度葡萄糖干預(yù)5 d對(duì)C2C12細(xì)胞膜GLUT4蛋白分布的影響

討 論

建立離體胰島素抵抗模型既有利于在細(xì)胞和分子水平深入探討胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，又有利于在體外進(jìn)行胰島素抵抗防治藥物的研發(fā)和篩選，骨骼肌是胰島素抵抗發(fā)生的主要部位，因此建立穩(wěn)定可重復(fù)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型至關(guān)重要[16]。雖目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于C2C12細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立已多有研究，主要通過(guò)棕櫚酸、游離脂肪酸和碳酸鑭等進(jìn)行誘導(dǎo)，但采用的誘導(dǎo)方法、誘導(dǎo)藥物的作用濃度及作用時(shí)間均有所差異, 尚無(wú)法確定一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且胰島素抵抗效果也不穩(wěn)定[17]。

本研究嘗試以高糖誘導(dǎo)建立胰島素抵抗模型，一方面與棕櫚酸和游離脂肪酸等的間接作用相比，長(zhǎng)期高糖是導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病的直接原因，也是體內(nèi)胰島素抵抗和2型糖尿病的主要特征，以高糖干預(yù)建立胰島素抵抗離體模型對(duì)于胰島素抵抗的在體研究具有更好的參考意義[18-19]；另一方面本研究通過(guò)以不同濃度葡萄糖刺激C2C12細(xì)胞并分別在干預(yù)1、3、5和7 d后實(shí)時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，建立高糖刺激與C2C12細(xì)胞胰島素抵抗之間的量效關(guān)系，以確保該建模方式的穩(wěn)定性、可信性和可重復(fù)性。

胰島素抵抗實(shí)質(zhì)為胰島素激活的靶細(xì)胞糖代謝降低及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，在分子水平是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損的結(jié)果[7]。因此，本研究不僅通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的葡萄糖攝取量來(lái)判斷胰島素抵抗，而且對(duì)細(xì)胞胰島素信號(hào)通路中關(guān)鍵因子GLUT4表達(dá)水平和分布進(jìn)行分析，同時(shí)實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，以期更加全面的分析和驗(yàn)證胰島素抵抗模型是否成功建立。

作為新生肌肉的細(xì)胞來(lái)源，衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化在骨骼肌質(zhì)量維持和重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這對(duì)于提高機(jī)體胰島素敏感性尤為重要，反之則進(jìn)一步加快胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)展進(jìn)程[20-21]。本研究中，從形態(tài)學(xué)上觀察到60 mmol/L葡萄糖干預(yù)3 d后明顯抑制成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，且存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)成肌細(xì)胞生長(zhǎng)分化的抑制更加明顯，這將導(dǎo)致細(xì)胞葡萄糖攝取能力減弱，加快胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)展進(jìn)程。

為進(jìn)一步驗(yàn)證不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)成肌細(xì)胞糖攝取能力的影響，本研究通過(guò)2-NBDG法檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)成肌細(xì)胞基礎(chǔ)糖攝取和胰島素刺激糖攝取的影響。2-NBDG通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度能較好地反映一定時(shí)長(zhǎng)內(nèi)細(xì)胞的糖攝取能力，是目前研究離體胰島素敏感性的常用手段[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖干預(yù)可明顯降低C2C12細(xì)胞基礎(chǔ)和胰島素刺激的糖攝取能力，且存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性，以60 mmol/L葡萄糖干預(yù)5 d出現(xiàn)明顯抑制，干預(yù)7 d抑制效果進(jìn)一步加強(qiáng)，說(shuō)明60 mmol/L葡萄糖干預(yù)5 d后導(dǎo)致細(xì)胞葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性顯著下降，產(chǎn)生胰島素抵抗。

作為胰島素信號(hào)通路的最終效應(yīng)蛋白，GLUT4對(duì)于維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有關(guān)鍵作用，是研究胰島素抵抗的重要靶點(diǎn)，胰島素抵抗發(fā)生時(shí)GLUT4的激活明顯減少[23]。由于在本研究的形態(tài)學(xué)和糖攝取能力檢測(cè)中，60 mmol/L葡萄糖干預(yù)成肌細(xì)胞5 d后產(chǎn)生明顯胰島素抵抗現(xiàn)象，因此我們檢測(cè)了不同濃度葡萄糖干預(yù)第5 天和第7 天的基礎(chǔ)和胰島素刺激的GLUT4蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)60 mmol/L葡萄糖干預(yù)成肌細(xì)胞5和7 d后，胰島素刺激均無(wú)法使細(xì)胞的GLUT4激活增加，即出現(xiàn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損，尤其是7 d后，基礎(chǔ)GLUT4水平也顯著低于正常細(xì)胞，說(shuō)明60 mmol/L葡萄糖干預(yù)成肌細(xì)胞5 d后導(dǎo)致胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損，到第7 天后，受損程度進(jìn)一步加深。

GLUT4屬于跨膜蛋白，只有在細(xì)胞外膜上才能轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞[24]，因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了不同濃度葡萄糖干預(yù)5 d后細(xì)胞膜上GLUT4蛋白的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60 mmol/L葡萄糖干預(yù)成肌細(xì)胞5 d后不僅導(dǎo)致GLUT4蛋白表達(dá)下降，同時(shí)抑制GLUT4從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜上GLUT4的分布減少和對(duì)胰島素敏感性降低。以上研究中，40 mmol/L葡萄糖也一定程度抑制成肌細(xì)胞增殖分化，導(dǎo)致成肌細(xì)胞葡萄糖攝取能力和GLUT4激活水平下降，但效果不如60 mmol/L葡萄糖明顯和穩(wěn)定。

綜上所述，本研究通過(guò)高糖刺激能成功構(gòu)建較為穩(wěn)定的小鼠骨骼肌細(xì)胞離體胰島素抵抗模型，以60 mmol/L葡萄糖干預(yù)5 d產(chǎn)生胰島素抵抗，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察并檢測(cè)基礎(chǔ)和胰島素刺激的葡萄糖攝取能力以及GLUT4蛋白表達(dá)與分布能較好地評(píng)價(jià)骨骼肌細(xì)胞離體胰島素抵抗水平。