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    強(qiáng)脈沖光與長(zhǎng)脈寬Nd:YAG激光對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

    2019-09-20 03:07:20朱雅琳聶晶帕麗達(dá)·阿布利孜
    中國(guó)美容醫(yī)學(xué) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:YAG激光強(qiáng)脈沖光內(nèi)皮細(xì)胞

    朱雅琳 聶晶 帕麗達(dá)·阿布利孜

    [摘要]目的:從分子生物學(xué)水平探討強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd:YAG激光治療血管瘤的機(jī)制。方法:使用不同能量強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd:YAG激光對(duì)嬰兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外照射,照射后測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞OD值,并進(jìn)行比較。結(jié)果:強(qiáng)脈沖光組照射后,在同一時(shí)間點(diǎn)能量越高,體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞OD值越低,表明照射后存活細(xì)胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在所有測(cè)試時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)相同的改變趨勢(shì)。Nd:YAG組照射后,在同一時(shí)間點(diǎn),不同能量顯示相同的變化趨勢(shì)。在同一能量組,不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)有所不同。結(jié)論:強(qiáng)脈沖光和Nd:YAG激光對(duì)于血管瘤的抑制作用除了“選擇性光熱作用”外,還通過(guò)影響血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮抑制作用,并且影響程度在一定范圍內(nèi)受到能量和時(shí)間的影響。

    [關(guān)鍵詞]強(qiáng)脈沖光;Nd:YAG激光;嬰兒血管瘤;內(nèi)皮細(xì)胞;體外培養(yǎng);生長(zhǎng)曲線

    [中圖分類(lèi)號(hào)]R732.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455(2019)09-0096-06

    1983年Anderson和Parish提出了“選擇性光熱作用”理論[1-2],對(duì)激光的臨床應(yīng)用起到革命性的作用。此后激光成功用于血管瘤的治療中,并取得明顯成效。激光將血液加熱到70℃左右導(dǎo)致血管的不可逆性破壞,從而達(dá)到治療目的。強(qiáng)脈沖光源是由高能量的閃光燈激發(fā)出波長(zhǎng)515~1 200nm的非相干光,也通過(guò)“選擇性光熱作用原理”對(duì)血管瘤發(fā)揮治療作用,可變脈寬1 064nm Nd:YAG激光在嬰兒血管瘤的治療中也取得較好的臨床應(yīng)用[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用,同時(shí)對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子、β-腎上腺素受體及細(xì)胞凋亡均有影響[4-10],那么強(qiáng)脈沖光和激光除了通過(guò)“選擇性光熱作用原理”起到治療嬰兒淺表血管瘤的作用外,是否通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性而起到治療作用,還有待研究。本研究擬通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd:YAG激光照射,分別觀察照射前后血管瘤內(nèi)皮生長(zhǎng)曲線及形態(tài)學(xué)的變化,從分子生物學(xué)水平探討強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd:YAG激光治療血管瘤的機(jī)制。

    1? 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料:嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于前期實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審查,并且體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫組化進(jìn)行鑒定,進(jìn)行了純度測(cè)定(為75%)。

    1.2 主要試劑:胎牛血清(FBS)(美國(guó)Life technologies公司,16000044);EGM-2(CC-4176,Lonza);0.25%胰酶(Trypsin-EDTA)(25200-056,Gibco);PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(ZLI-9062,北京中杉金橋生物);青霉素-鏈霉素雙抗(10000U)(SC30010,Gibco);CCK-8試劑(FC101-03,北京全式金生物)

    1.3 方法

    1.3.1 試劑配制:2%血清EGM-2完全培養(yǎng)基:500ml的EGM-2培養(yǎng)基中含10ml胎牛血清、0.2ml醋酸氫化可的松、hFGF-b 2ml、VEGF 2ml、R3-IGF-1 0.5ml、抗壞血酸0.5ml、hEGF 0.5ml、GA-1000 0.5ml、肝素0.5ml,添加1ml的青-鏈霉素雙抗溶液。10% DMSO細(xì)胞凍存液:0.1ml的DMSO溶液加入0.9ml的完全培養(yǎng)基中。10% CCK-8溶液配制:按照CCK-8與完全培養(yǎng)基1:9比例配制10% CCK-8檢測(cè)溶液。

    1.3.2 細(xì)胞準(zhǔn)備:從液氮中取出凍存的前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行原代培養(yǎng)并鑒定的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)行復(fù)蘇及傳代。當(dāng)培養(yǎng)瓶(25cm2)中細(xì)胞貼壁融合達(dá)80%時(shí),即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,完全培養(yǎng)基制備成0.2~1×105 cells/ml單細(xì)胞懸液,每隔24h接種至96孔板中(100μl/孔,6個(gè)復(fù)孔,即0.2~1×104個(gè)細(xì)胞/孔)。8d后小心吸干凈細(xì)胞培養(yǎng)基,加入配置好的10% CCK-8溶液,置于37℃培養(yǎng)箱中孵育,1~4h后酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。(取合適的檢測(cè)時(shí)間OD值進(jìn)行計(jì)算,一般選取OD值為1~2的值進(jìn)行計(jì)算)。繪制生長(zhǎng)曲線,確定細(xì)胞株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.3 不同能量激光照射體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞:共分為七組。

    1.3.3.1 激光分組照射情況:空白對(duì)照組:不照射,只使用2%血清EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。強(qiáng)脈沖光照射組(intense pulsed light):照射波長(zhǎng)為560nm,雙脈沖,脈寬3.5ms,脈沖間隔20ms,其中A組照射能量為23J/cm2,B組為24J/cm2,C組為25J/cm2。激光照射組(l 064nm Nd:YAG激光):照射波長(zhǎng)1 064nm,單脈沖,脈沖持續(xù)時(shí)間11.5ms,其中A組能量為90J/cm2,B組為100J/cm2,C組為110J/cm2。

    1.3.3.2 細(xì)胞培養(yǎng):取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基制備成0.2~1×105 cells/ml單細(xì)胞懸液,接種至96孔板中(100μl/孔,5個(gè)復(fù)孔,即0.2~1×104個(gè)細(xì)胞/孔)。2種照射方式、每組7個(gè)檢測(cè)時(shí)間段、每個(gè)時(shí)間段5個(gè)重復(fù),共加7個(gè)96孔板,標(biāo)記好光照能量和檢測(cè)時(shí)間段,將96孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后將96孔板按1.3.3.1中的激光能量分組照射,空白對(duì)照組不進(jìn)行照射。照射后將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力:照射后第1、2、3、4、7、14、21天用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。小心吸干凈對(duì)應(yīng)時(shí)間段小孔中的細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔加入配置好的100μl 10% CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱中37℃孵育1~4h,450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),平均OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

    2? 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制結(jié)果:結(jié)果顯示第1~2天細(xì)胞吸光度平均值增長(zhǎng)緩慢,第2~4天迅速增長(zhǎng),第5天輕度下降,第6~7天達(dá)到平臺(tái)期。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。見(jiàn)圖1。

    2.2 CCK-8檢測(cè)結(jié)果:不同能量強(qiáng)脈沖光及l(fā) 064nm Nd:YAG照射體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后,不同時(shí)間點(diǎn)使用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞OD值。

    2.2.1 強(qiáng)脈沖光照射:強(qiáng)脈沖光560nm,雙脈沖,脈寬3.5ms,脈沖間隔20ms,能量分別為23、24、25J/cm2進(jìn)行照射,照射后第1、2、3、4、7、14、21d用CCK-8法檢測(cè)每組細(xì)胞OD值發(fā)現(xiàn),在同一時(shí)間點(diǎn),能量越高,體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞OD值越低,提示經(jīng)過(guò)照射后生存的細(xì)胞減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);并且在所有的測(cè)試時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)相同的改變趨勢(shì)。而在同一能量組,空白組的變化與體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線吻合,而23J/cm2照射組照射后第2~3天較第1天OD值有明顯變化,第4、7、21天OD值明顯下降,較第2、3天均下降,但4、7、21d間并無(wú)差異;24J/cm2照射組則有所不同,在照射第2、3、4、7天的OD值變化不大,第14、21天OD值明顯下降。25J/cm2照射組照射后OD值隨時(shí)間變化不大(P>0.05)。多因素方差分析后顯示激光能量及時(shí)間均是細(xì)胞OD值的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    2.2.2 不同Nd:YAG激光照射:在同一時(shí)間點(diǎn),不同能量顯示相同的變化趨勢(shì),90J/cm2照射組較空白組OD值有所變化,100J/cm2較空白組和90J/cm2照射組的OD值均有下降,而110J/cm2組較100J/cm2組OD值沒(méi)有明顯變化。在同一能量組,不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)有所不同,90J/cm2組照射后第2、3、4、7、14、21天的OD值較第1天均有變化,但隨時(shí)間變化,OD值變化不大,在100J/cm2組OD值較空白組的OD值是下降的,隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞的OD值也是逐漸下降的。見(jiàn)表2。

    2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

    2.3.1 空白組:血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)傳代24h后觀察,細(xì)胞逐漸貼壁,呈類(lèi)圓形至多角形。生長(zhǎng)2~3d后,數(shù)量逐漸增多。4~5d細(xì)胞逐漸融合,呈多角形,隨后細(xì)胞逐漸成梭形及條索行,部分可見(jiàn)有類(lèi)似血管結(jié)構(gòu)形成。見(jiàn)圖2。

    2.3.2 照射后細(xì)胞形態(tài)變化情況:體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同激光照射后,細(xì)胞形態(tài)較前有所改變,細(xì)胞形態(tài)較前纖細(xì),細(xì)胞間距增大,細(xì)胞變稀疏,見(jiàn)圖3~4。

    3? 討論

    目前多認(rèn)為激光治療嬰兒血管瘤的機(jī)制為“選擇性光熱作用原理”[1],但隨著嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入,尤其是前期研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等的變化在血管瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起重要作用[4-6,11-15],因此猜想激光治療嬰兒血管瘤的機(jī)制并不局限于“選擇性光熱作用原理”,激光同時(shí)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子有著重要的影響作用。

    本研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)脈沖光(560nm,雙脈沖,脈寬3.5ms,脈沖間隔20ms)和1 064nm激光對(duì)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)是有影響的。在不同能量組,不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)有所改變,隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞間距增大,變稀疏,說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖受到抑制。其次,對(duì)細(xì)胞的OD值進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),兩種激光干預(yù)均可降低細(xì)胞的OD值,并且在一定能量范圍內(nèi)隨著能量的升高,OD值降低越明顯,說(shuō)明對(duì)細(xì)胞的抑制作用越明顯,并且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),OD值在進(jìn)一步下降。

    強(qiáng)脈沖光照射各能量組在第21天時(shí)OD值較第14天變化不大(P>0.05),在25J/cm2照射組,隨著時(shí)間的變化,細(xì)胞OD值較其他能量組變化不大,而其他各組隨著能量增加以及治療時(shí)間的延長(zhǎng),OD值均降低,提示強(qiáng)脈沖光照射后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量減少,生長(zhǎng)被抑制,因此考慮強(qiáng)脈沖光對(duì)體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞有抑制作用,其對(duì)血管瘤的治療作用不僅僅是通過(guò)“選擇性光熱作用原理”,也通過(guò)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)而發(fā)揮作用。并且在一定范圍內(nèi)(<25J/cm2)能量越高,抑制作用越強(qiáng),治療后一定時(shí)間內(nèi)(21d),血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)被抑制的現(xiàn)象,因此推測(cè)激光治療后,除了血紅蛋白吸收激光能量,加熱血管,使血管閉鎖破壞,同時(shí)強(qiáng)脈沖光在治療一段時(shí)間內(nèi)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞有持續(xù)抑制作用,但是強(qiáng)脈沖光抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。但此結(jié)論提示在臨床治療中,為達(dá)到更好的臨床療效,在一定范圍內(nèi)可提高治療能量,但不能無(wú)限制提高,否則副作用出現(xiàn)增多,且并不能提高療效,其次治療一段時(shí)間后,激光對(duì)細(xì)胞的抑制作用減弱,可再次進(jìn)行治療,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21d后,強(qiáng)脈沖光組細(xì)胞OD值下降不明顯,因此可以將此時(shí)間作為治療間隔的參考時(shí)間。

    Nd:YAG照射組(波長(zhǎng)1 064nm,單脈沖,脈沖持續(xù)時(shí)間11.5ms):隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng),鏡下觀察發(fā)現(xiàn) 細(xì)胞間距增大,變稀疏,說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖受到抑制。在不同能量組間90~100J/cm2較空白組的OD值變化明顯,說(shuō)明細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制,而更高能量組(110J/cm2)則并沒(méi)有顯示出更大的抑制作用,而同一能量組在21d之內(nèi),隨著時(shí)間延長(zhǎng),在110J/cm2組,細(xì)胞的生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),而其他組則沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì),但通過(guò)多因素方差分析后,時(shí)間和能量均是細(xì)胞活性的影響因素(P<0.05)。

    綜上所述,強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬Nd:YAG激光對(duì)于體外培養(yǎng)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)是有影響的,這說(shuō)明強(qiáng)脈沖光和Nd:YAG激光對(duì)于血管瘤的抑制作用除了“選擇性光熱作用”之外,還通過(guò)影響血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用,并且影響程度在一定范圍內(nèi)受到能量和時(shí)間的影響。因此提示在臨床治療過(guò)程中,在一定范圍內(nèi)可適當(dāng)加大治療劑量以提高療效,也應(yīng)避免過(guò)高能量引起不良反應(yīng)。其次,激光治療后一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞呈持續(xù)抑制作用,但在一段時(shí)間后(21d),抑制作用呈減弱趨勢(shì),提示治療可在一定時(shí)間內(nèi)重復(fù)進(jìn)行,但臨床使用還需要進(jìn)一步觀察研究。例如治療需要間隔,給予血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)的時(shí)間。強(qiáng)脈沖光和Nd:YAG激光的這一作用機(jī)制目前尚不清楚,根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道及研究考慮與細(xì)胞生長(zhǎng)因子,信號(hào)通路有關(guān),這還需要進(jìn)一步的研究。嬰兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制研究并不透徹,但目前的研究顯示,血管瘤發(fā)病機(jī)制是多環(huán)節(jié),多靶點(diǎn)的,因此提示嬰兒血管瘤的治療除目前的治療方法外,可嘗試多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)的治療,并可考慮綜合治療,以提高血管瘤的治療療效。

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    [收稿日期]2018-12-27

    本文引用格式:朱雅琳,聶晶,帕麗達(dá)·阿布利孜.強(qiáng)脈沖光與長(zhǎng)脈寬Nd:YAG激光對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2019,28(9):96-101.

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