膽汁及膽囊黏膜中骨橋蛋白、瘦素、內(nèi)脂素及脂聯(lián)素的表達及意義

鄒旺生，陳健，張宏

（1.銅陵市人民醫(yī)院 急診外科，安徽 銅陵 244000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004）

膽囊結(jié)石是膽道系統(tǒng)中一種常見的良性疾病，綜合發(fā)病率約為10%[1]。其中最常見的類型為膽固醇結(jié)石，約占90%[2-3]。膽固醇結(jié)石的形成可能與膽汁膽固醇過飽和，膽固醇結(jié)晶成核時間，膽囊運動減弱，基因和環(huán)境等因素共同作用有關(guān)[4]。目前國內(nèi)外對結(jié)石形成與發(fā)展所處的內(nèi)環(huán)境（膽汁）及膽囊黏膜的研究相對缺乏。本研究旨在通過檢測膽汁及膽囊黏膜中瘦素、內(nèi)脂素、脂聯(lián)素及骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）等指標(biāo)或表達差異，為臨床膽固醇結(jié)石的進一步防治提供潛在可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2018年12月在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科行腹腔鏡膽囊切除術(shù)的74 例患者作為觀察組，術(shù)后均證實為膽固醇結(jié)石。其中，男性21 例，女性53 例。另選取30 例手術(shù)切除膽囊的非膽囊結(jié)石患者作為對照組。其中，男性9 例，女性21 例；根據(jù)膽囊是否有息肉將對照組分為對照息肉組和對照正常組，分別為22 和8 例。對照組患者術(shù)前均無膽囊結(jié)石病史，術(shù)中確認(rèn)膽囊無結(jié)石、結(jié)晶及膽汁淤積、腫瘤侵襲等。

1.2 材料與試劑

1.2.1 標(biāo)本采集 記錄患者年齡、身高、體重，計算BMI。所有患者膽囊切除后迅速從膽囊中抽取膽汁5 ～10 ml，然后剖開膽囊采集結(jié)石。在膽囊床對側(cè)的膽囊壁內(nèi)（遠(yuǎn)離電刀分離面），用剪刀沿黏膜下行銳性剝離，取膽囊壁全層約4 cm2置于10%甲醛中留作病理染色使用。膽汁置于-80℃保存，膽石經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）漂洗、烘干后室溫存儲。

1.2.2 試劑 Western blotting 一抗（美國Abcam 公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（美國Rapidbio 公司），氧化酶法試劑盒（南京建成生物工程研究所）

1.2.3 儀器與設(shè)備 分光光度計、離心機（德國Eppendorf 公司），37℃水浴鍋、95℃金屬浴鍋（北京田園奧瑞生物科技有限公司），膠片曝光機SRX-101A（日本Konica Minolta 公司）

1.3 方法

1.3.1 膽汁成分測定 膽汁3 000 r/min 離心10 min 取上清，檢測瘦素、內(nèi)脂素、脂聯(lián)素、膽固醇、磷脂及總膽汁酸等。按ELISA 試劑盒說明書操作，用Excel 軟件繪制出的標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線（曲線經(jīng)校正為直線），按曲線方程計算各樣本濃度值。膽汁中膽固醇按總膽固醇的檢測（氧化酶法）試劑盒說明書操作。

1.3.2 膽固醇飽和指數(shù)（cholesterol saturation index,CSI）測定 利用膽汁中膽固醇濃度、磷脂和總膽汁酸濃度計算出膽汁總脂濃度和磷脂百分比并通過查Carey 表算出CSI[5]。

1.3.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色 常規(guī)石蠟包埋和切片：從10%甲醛固定標(biāo)本中剪取部分膽囊全層組織，按沖洗→梯度脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片烘片流程操作。切片厚度5μm。HE 染色：切片置于60℃溫箱烤片熔蠟30 min，分置二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，無水、95%、85%及75%酒精梯度脫水，蘇木精染色5 min，流水沖洗。0.5%鹽酸酒精分化20 s，自來水洗2 min，梯度酒精脫水，0.5%伊紅染色3 min，蒸餾水速洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 為進一步觀察差異表達基因OPN 在膽囊黏膜的表達部位，對膽囊組織進行免疫組織化學(xué)染色，用PBS 代替一抗作內(nèi)參對照。石蠟切片二甲苯Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ脫蠟各10 min，無水酒精、90%酒精、80%及70%酒精梯度脫水各2 min。PBS漂洗2 min/次，共3 次，浸入枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸（微波抗原修復(fù)），高火2 min，再維持10 min，取出自然冷卻后PBS 漂洗2 min/次，共3 次。過氧化氫H2O2和甲醇按1 ∶9 比例孵育5 ～10 min（去除內(nèi)源性過氧化物酶）。切片加2 滴5%胎牛血清白蛋白封閉液封閉。室溫放置20 min 后，輕輕甩去封閉液，不洗，加入抗體稀釋液1 ∶200 稀釋的一抗40μl，置于濕盒中。4℃冰箱孵育過夜。PBS 漂洗5 min/次，共3 次，加二抗40μl，室溫孵育1 h。PBS 漂洗5 min/次，共3 次。二氨基苯聯(lián)胺顯色，室溫下鏡下觀察3 ～10 min。陽性產(chǎn)物呈棕黃色，觀察到陽性產(chǎn)物后立即終止反應(yīng)。蘇木精襯染細(xì)胞核，鹽酸酒精水洗藍(lán)化，80%、90%及無水酒精梯度酒精脫水，二甲苯透明5 min，干燥后用中性樹脂封片，鏡下觀察。所有圖片采用Image pro plus 6.0 軟件行光密度（optical density,OD）值 分析。

1.3.5 Western blotting ①黏膜組織勻漿及樣品制備：將組織放入10 ml離心管，加入細(xì)胞裂解液1 ml（pH 8.0 的1 mmol/L Tris-HCl 50μl，5 mmol/L NaC1 30μl；NP-40 10μl，0.5 mmol/L EDTA 4μ1，0.5 mmol/L 去氧膽酸鈉10μl，100 mmmol/L PMSF 10μl，2 mg/ml Leupeptin 5μl，2 mg/ml Aprotinin 2.5μl，0.5 mmol/L 焦磷酸鈉l0μl，10% SDS l0μl，三蒸水定容至1.0 ml），充分勻漿，4℃、12 000 r/min 離心10 min，去上清分裝成20μl/管。分光光度計測濃度，加入三蒸水使每管濃度為25μg/ml，再加入等體積的Sample Buffer（10% SDS 2.0 ml，甘油1.0 ml，pH 6.8 的0.5 mol Tris-HC1 1.6 ml，β- 巰 基 乙 醇0.5 ml，Western blotting protein ladders 10μl，三蒸水定容至10 m1）混勻備用。使用前90℃煮沸10 min，短暫離心，按25μg/孔蛋白上樣。②電泳：垂直電泳槽中加入分離膠（三蒸水4 ml，30% Acrylamide 3.3 ml，pH 8.8 的1.5 mmol/L Tris-HCl 2.5 ml，10% SDS 1OOμl，10% APS 100 μl，最后加入10% TEMED 10μl 占下3/4），用注射器注入濃縮膠（三蒸水1.4 ml，30% Acrylamide 0.4 ml，pH 6.8 的0.5 mmol/L Tris-HCl 0.63 ml，10% SDS 50μl，10% APS 12μl，10% TEMED 5μ1），插上梳子，室溫聚合1 h。待膠完全聚合后取下梳子，每樣上2 塊平行膠，蛋白上樣70μl/孔；上樣完畢后電泳槽中加入電泳緩沖液（25 mmol/L Tris 3.03 g，192 mmol/L 甘氨酸14.42 g，pH 8.0 的0.1% SDS l g），電泳先以80 V 電壓進行，待Protein Ladders 入分離膠后將電壓改為120 V 恒定電壓進行，電泳至Protein Ladders到底邊處停止電泳，取出凝膠。③轉(zhuǎn)膜：電泳完畢將膠取下做好標(biāo)記，按塑料孔板（黑）-海綿-濾紙-電泳凝膠-PVDF 膜-濾紙-海綿-塑料孔板（白）的順序做好三明治，放于電轉(zhuǎn)膜液中（甘氨酸11.26 g，Tris 2.42 g，20%甲醇500 ml，pH 8.0）轉(zhuǎn)膜，400 mA 恒流電轉(zhuǎn)移1.5 h。④抗體孵育：取下電轉(zhuǎn)移的PVDF 膜，1×TBST 洗膜3 次，10 min/次，置于5% BSA 中常溫封閉1 h。加入1 ∶1 000 稀釋的一抗，4℃恒溫孵育過夜，取出PVDF 膜用1×TBST 洗膜3 次，10 min/次，加入1 ∶5 000 稀釋的相應(yīng)二抗，37℃恒溫孵育1 h，1×TBST 洗膜3 次，10 min/次。 ⑤顯影：取WestPico Chemiluminescent Substrate ECL試劑A、B 液各1 ml 混勻，每張PVDF 膜用1 ml A、B 混合液浸潤約5 min 后放入暗盒固定，在暗室以膠片覆蓋后關(guān)上暗盒20 s ～5 min，取出膠片后放入顯影洗片機中顯影，取出膠片觀察結(jié)果。Western blotting 圖片采用Image J 軟件進行條帶灰度值數(shù)據(jù) 處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析，方差不齊時改用H檢驗，進一步兩兩比較用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者男女性構(gòu)成比、年齡、BMI 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組患者膽汁成分比較

兩組患者膽固醇、磷脂、總膽汁酸、膽固醇百分比、總脂及CSI 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組膽固醇、膽固醇百分比、總脂及CSI 高于對照組，觀察組磷脂、總膽汁酸低于對照組。見 表2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 兩組患者膽汁成分比較 （±s）

表2 兩組患者膽汁成分比較 （±s）

組別 n 膽固醇/ （mmol/L） 磷脂/（mmol/L） 總膽汁酸/（mmol/L） 百分比/% 磷脂百分比/% 總膽汁酸 百分比/% 總脂/（g/dl） CSI 膽固醇 觀察組 74 18.87±1.64 37.42±5.45 119.07±11.20 10.16±0.60 21.17±0.76 68.8±1.25 16.93±1.49 1.72±0.37對照組 30 10.55±1.03 59.77±6.03 176.53±14.23 4.05±0.22 24.21±1.07 71.80±1.14 11.76±1.16 0.95±0.15 t 值 10.273 24.511 56.581 5.311 7.870 30.435 8.122 2.290 P 值 0.005 0.041 0.033 0.028 0.093 0.115 0.012 0.006

2.3 兩組患者膽汁中瘦素、內(nèi)脂素及脂聯(lián)素 比較

兩組患者膽汁中瘦素、內(nèi)脂素及脂聯(lián)素比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組膽汁中瘦素、內(nèi)脂素高于對照組，觀察組膽汁中脂聯(lián)素低于對照組。見表3。

表3 兩組患者膽汁中瘦素、內(nèi)脂素及脂聯(lián)素比較 （±s）

表3 兩組患者膽汁中瘦素、內(nèi)脂素及脂聯(lián)素比較 （±s）

脂聯(lián)素/ （μg/ml）觀察組 74 7.14±3.75 12.02±3.39 7.4±1.65對照組 30 3.08±1.27 8.15±2.45 11.3±3.26 t 值 4.239 6.625 5.331 P 值 0.008 0.038 0.005組別 n 瘦素/ （ng/ml）內(nèi)脂素/ （ng/ml）

2.4 各組膽囊黏膜HE 染色結(jié)果

觀察組膽固醇結(jié)石患者近3 個月無急性發(fā)作史，膽囊黏膜呈慢性膽囊炎表現(xiàn)，沒有黏膜萎縮，囊壁增厚不明顯。鏡下見黏膜有增生，單核細(xì)胞浸潤。部分黏膜下可見泡沫細(xì)胞，表明有膽固醇沉積。少數(shù)黏膜內(nèi)可見淋巴結(jié)以及杯狀細(xì)胞，提示腸化。對照息肉組患者與對照正常組患者鏡下見膽囊黏膜炎癥細(xì)胞浸潤較輕。見圖1。

2.5 各組膽囊黏膜中OPN 的表達

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，觀察組患者膽囊黏膜OPN 主要表達在膽囊黏膜上皮細(xì)胞的頂端膜上，部分胞漿內(nèi)也可看到表達的顆粒。對照息肉組患者膽囊黏膜中較少表達，對照正常組患者膽囊黏膜中無表達。見圖2。

圖1 各組膽囊黏膜 （HE 染色×200）

圖2 各組膽囊黏膜中OPN 的表達 （×200）

2.6 各組OPN 的OD 值比較

觀察組OPN 的OD 值為（0.27±0.04），對照息肉組為（0.11±0.06），對照正常組為（0.03±0.01），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.876，P=0.020），但方差齊性levene 檢驗結(jié)果P=0.012，提示方差不齊，故改用非參數(shù)檢驗H 檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=12.283，P=0.029）；進一步兩兩比較，觀察組與對照息肉組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.246，P=0.012）；觀察組與對照正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.092，P=0.003）；對照息肉組與對照正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.179，P=0.035）。見圖3。

2.7 各組OPN 蛋白相對表達量比較

Western blotting 結(jié)果顯示，觀察組OPN 蛋白相對表達量為（0.88±0.13），對照息肉組為（0.33±0.07），對照正常組為（0.08±0.05）經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.374，P=0.039），但方差齊性levene 檢驗結(jié)果P=0.025，提示方差不齊，故改用非參數(shù)檢驗H檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=29.845，P=0.017）；進一步兩兩比較，觀察組與對照息肉組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.133，P=0.027）；觀察組與對照正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.034，P=0.008）；對照息肉組與對照正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.291，P=0.015）。見圖4、5。

圖4 各組OPN 蛋白的表達

圖5 各組OPN 蛋白相對表達量比較 （±s）

3 討論

瘦素由人體脂肪細(xì)胞分泌，它可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，影響膽囊收縮功能，并通過調(diào)節(jié)膽汁蛋白成分等機制促進膽固醇結(jié)石的形成[6]。脂聯(lián)素由人體脂肪組織合成，具有Adipo1（R1）、Adipo2（R2）兩種受體，R1 多在骨骼肌表達，而R2 主要在肝臟表達。胰島素可抑制膽鹽合成限速酶7α 羥化酶，使膽汁酸減少分泌，同時也使膽汁中鈣離子升高，黏多糖增多，打破了膽汁抗成核及促成核因子的動態(tài)平衡[7-8]。目前有研究認(rèn)為膽固醇結(jié)石患者體內(nèi)脂聯(lián)素的水平較低，這在一定程度上降低了胰島素的敏感性并使胰島素抵抗增加，胰島素的水平相對增高。胰島素與脂聯(lián)素的關(guān)系密切，兩者協(xié)同作用，共同參與了膽固醇結(jié)石的形成[9]。內(nèi)脂素可通過下調(diào)THP-1 源性巨噬細(xì)胞的人源脂類外向轉(zhuǎn)運蛋白ABCA1 的表達，減少細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇外流，同時使乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶1 表達增高，增加了細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，促進了泡沫細(xì)胞的形成[10-11]。脂肪細(xì)胞中的膽固醇負(fù)荷增加，可使脂肪細(xì)胞分泌內(nèi)脂素增加，其機制可能與脂肪細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強有關(guān)[12]。這也為內(nèi)脂素導(dǎo)致膽固醇性結(jié)石形成的機制研究提供了新的理論依據(jù)。而筆者實驗中觀察組相對于對照組，膽汁中的瘦素、內(nèi)脂素水平升高，脂聯(lián)素降低，基本與以上理論相吻合。

水溶性極差的膽固醇在膽汁中主要以膽固醇、膽鹽及磷脂混合的微膠粒相形式存在[13]。有研究通過檢測膽囊結(jié)石患者的膽汁發(fā)現(xiàn)，膽鹽和磷脂可以影響膽固醇在膽汁中的溶解度，它們之間存在熱力學(xué)平衡。結(jié)石患者的膽汁中膽固醇出現(xiàn)熱力學(xué)失衡，更易過飽和析出產(chǎn)生結(jié)晶，最終導(dǎo)致膽囊結(jié)石的形成[14]。筆者的實驗結(jié)果中，觀察組相對于對照組，膽汁中的膽固醇濃度，CSI 升高，總膽汁酸和磷脂的濃度降低，由此推測膽汁中膽鹽減少，形成的微膠粒絕對不足，影響了膽固醇的溶解度，同時由于膽固醇濃度增高，形成的微膠粒相對不足，影響了其在膽汁中的溶解度，兩種原因共同導(dǎo)致膽固醇呈過飽和狀態(tài)并析出結(jié)晶形成結(jié)石。

OPN 可以通過調(diào)節(jié)膽汁代謝，改變膽汁的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致膽固醇結(jié)石的發(fā)生。其機制是肝臟內(nèi)的OPN降低了肝臟中膽汁酸合成代謝的限速酶CYP7A1的表達，并增加了與膽固醇形成相關(guān)的基因SHP、ATP8B1、SR-B1及SREBP-2的表達，導(dǎo)致膽汁酸合成減少，膽固醇合成增加，加速了膽汁的成核作用。有研究報道，OPN 的缺乏可抑制腸道膽固醇轉(zhuǎn)運關(guān)鍵蛋白NPC1L1，而NPC1L1與膽固醇在腸道的吸收密切相關(guān)，NPC1L1 在腸道的表達減少可以導(dǎo)致膽固醇在腸道的吸收下降，間接使膽汁中膽固醇的含量降低，從而減少膽固醇結(jié)石的形成[15]。本實驗中，觀察組膽囊黏膜中OPN 的表達高于對照組，可能與以上機制 有關(guān)。