小檗堿對D-半乳糖誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征模型小鼠的影響*

史成良，宋春雨，齊曉娟

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是一種慢性少排卵或不排卵、月經(jīng)失調(diào)及與多囊卵巢形態(tài)學(xué)有關(guān)的高雄激素血癥，常伴有超重或肥胖[1]。 PCOS 為引起育齡期婦女不孕的常見病因，發(fā)病率為5%～10%。D-半乳糖誘導(dǎo)的動物模型可產(chǎn)生腦、肝、腎及血細(xì)胞等多種器官及組織衰老[2]。有學(xué)者提出，D-半乳糖不但能引起生殖器官衰老，更易引起小鼠PCOS表型[3]。周越等[4]報道D-半乳糖誘導(dǎo)復(fù)制的小鼠PCOS 模型，小檗堿可改善胰島素抵抗；同時具有抑制卵巢細(xì)胞分泌雄激素水平的作用，具有與二甲雙胍相似的生物學(xué)行為[5]。本研究進(jìn)一步探討小檗堿對PCOS模型小鼠卵巢形態(tài)學(xué)及排卵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級ICR 小鼠48 只，雌性，20周齡，體重（40±2）g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部[許可證號：SCXK（黑）2013-001]。所有實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號SYXK（黑）2016-001]，分籠飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，12 h 晝/夜循環(huán)照明。所有小鼠自由進(jìn)食和飲水。并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 試劑與儀器 D-半乳糖、小檗堿及二甲雙胍購自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，血糖試紙和血糖儀為上海強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)，電子顯微鏡為日本日立公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的復(fù)制和分組 48 只ICR 小鼠隨機(jī)分為：①對照組12 只，注射生理鹽水0.2 ml/d，連續(xù)皮下注射21 d。模型復(fù)制第22 天起小鼠給予生理鹽水灌胃0.2 ml/只，1 次/d，連續(xù)灌胃21 d；②D-半乳糖組12 只，采用Poretsky 法[6]復(fù)制PCOS 小鼠模型，皮下注射D-半乳糖200 mg/（kg·只），1 次/d，并按該劑量維持至第21 天，模型復(fù)制后同對照組；③小檗堿組12 只，模型復(fù)制同D-半乳糖組，模型復(fù)制第22 天起每只小鼠給予小檗堿灌胃，1 次/d，連續(xù)灌胃21 d。藥粉溶在生理鹽水中，灌胃濃度為小檗堿100 mg/（kg·d）；④二甲雙胍組12 只，模型復(fù)制同D-半乳糖組，模型復(fù)制第22 天起每只小鼠給予二甲雙胍灌胃，1 次/d，連續(xù)灌胃21 d，灌胃濃度為二甲雙胍300 mg/（kg·d）[7]。

1.2.2 取材 采用頸椎脫臼的方法處死小鼠，解剖取卵巢，觀察卵巢變化，采用2.5%戊二醛固定，透視電鏡檢查。

1.2.3 動情周期檢查 從給藥后連續(xù)10 d，每天下午5：00 ～6：00 收集小鼠陰道脫落細(xì)胞，通過顯微鏡確定動情周期。

1.2.4 血糖值測定 給藥治療后第21 天，將小鼠隔夜禁食，尾部取血，測定空腹血糖。

1.2.5 飲食量及體重測定 每日測定小鼠飲食消耗量及體重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.00 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)食量變化

對照組與D-半乳糖組、小檗堿組及二甲雙胍組治療21 d 后進(jìn)食量分別為（4.62±0.90）、（4.24±0.77）（3.87±0.83）及（3.33±0.68）g。4組小鼠治療21 d后進(jìn)食量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.085，P=0.000）。對照組與D-半乳糖組進(jìn)食量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；對照組與小檗堿組進(jìn)食量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），小檗堿組進(jìn)食量相對降低；對照組與二甲雙胍組進(jìn)食量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二甲雙胍組進(jìn)食量相對較低；D-半乳糖組與小檗堿組進(jìn)食量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；D-半乳糖組與二甲雙胍組進(jìn)食量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二甲雙胍組進(jìn)食量相對較低；小檗堿組與二甲雙胍組進(jìn)食量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），二甲雙胍組進(jìn)食量相對較低。見圖1。

圖1 各組小鼠不同時間進(jìn)食量的變化 （n =12，±s）

2.2 體重變化結(jié)果

對照組、D-半乳糖組、小檗堿組及二甲雙胍組給藥1、5、9、13、17 及21 d 體重變化比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點(diǎn)的體重變化有差別（F=6.434，P=0.000）；②各組的體重變化有差別（F=8.292，P=0.000），D-半乳糖組、小檗堿組及二甲雙胍組較對照組體重降低（P＜0.05）；③各組體重變化趨勢有差別（F=11.331，P=0.000）。見表1和圖2。

表1 各組小鼠不同時間點(diǎn)的體重變化 （n =12，g，±s）

表1 各組小鼠不同時間點(diǎn)的體重變化 （n =12，g，±s）

組別 1 d 5 d 9 d 13 d 17 d 21 d對照組 28.84±0.39 30.41±0.59 29.83±0.63 31.86±0.65 31.27±0.65 30.93±0.64 D-半乳糖組 26.64±0.78 27.46±0.72 28.22±0.78 29.06±0.57 28.12±0.54 29.04±0.77小檗堿組 27.80±0.42 27.47±0.47 27.33±0.39 27.50±0.19 26.40±0.29 24.97±0.63二甲雙胍組 28.13±0.57 27.90±0.42 26.85±0.44 27.96±0.46 28.74±0.30 29.20±0.29

圖2 各組體重變化趨勢 （n =12，±s）

2.3 血糖測定結(jié)果

對照組、D-半乳糖組、小檗堿組及二甲雙胍組空腹血糖分別為（5.410±0.365）、（5.980±0.347）、（6.270±0.218）及（6.230±0.318）mmol/L。各組小鼠空腹血糖比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.516，P=0.227）。見圖3。

圖3 各組治療21 d 空腹血糖比較 （n =12，±s）

2.4 動情周期

小鼠正常動情周期包括動情前期（P）、動情期（E）、動情后期（M）和動情間期（D）4 個時期[8]。動情前期可見成群或單獨(dú)出現(xiàn)的梭形上皮細(xì)胞，白細(xì)胞較少。動情期見大量鱗狀上皮細(xì)胞，形狀大而不規(guī)則，無核，白細(xì)胞消失；動情后期可見多種細(xì)胞類型，白細(xì)胞，無核的上皮細(xì)胞及梭形上皮細(xì)胞；動情間期可見大量白細(xì)胞，極少量梭形上皮細(xì)胞。經(jīng)過連續(xù)10 d 的動情周期觀察發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠有4 ～5 d的動情周期，且各期分布比較均衡；D-半乳糖組小鼠未表現(xiàn)出動情周期存在，可見持續(xù)較多的動情間期，而動情周期的其他期表現(xiàn)較少，提示無排卵；小檗堿組小鼠有動情周期存在，提示應(yīng)用小檗堿后動情周期恢復(fù)；二甲雙胍組小鼠亦有動情周期存在。見圖4。

2.5 電鏡觀察結(jié)果

2.5.1 對照組 黃體細(xì)胞溶酶體及脂滴散在分布，可見圓形線粒體，胞核染色質(zhì)分布均勻，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞可見少量脂滴。顆粒細(xì)胞內(nèi)見中量滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂滴及線粒體。見圖5A。

2.5.2 D-半乳糖組 黃體細(xì)胞內(nèi)脂滴增多。顆粒細(xì)胞形態(tài)變形，細(xì)胞核核型不整，細(xì)胞間纖維增生，胞質(zhì)內(nèi)可見大量的核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量線粒體腫脹、嵴斷裂、絮狀變。卵泡內(nèi)膜細(xì)胞可見大量滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴。見圖5B。

2.5.3 小檗堿組 黃體細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少。顆粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器完整，可見中等量粗面及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂滴及線粒體。卵泡膜細(xì)胞內(nèi)脂滴及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少可見少量凋亡的卵泡膜細(xì)胞。見圖5C。

2.5.4 二甲雙胍組 黃體細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，細(xì)胞器豐富。顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞脂滴減少，可見粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。見圖5D。

圖4 各組動情周期變化示意圖

圖5 小檗堿對小鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)的影響 （×6 000）

3 討論

PCOS 臨床表現(xiàn)為雄激素過多（高雄激素血癥、多毛癥、痤瘡和脫發(fā)）、月經(jīng)周期不規(guī)律、不孕不育、胰島素抵抗和肥胖。PCOS 患者也有發(fā)展為嚴(yán)重代謝紊亂的風(fēng)險，如心血管疾病、2 型糖尿病、代謝綜合征和子宮內(nèi)膜癌[9]。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，胰島素抵抗增加和代償性高胰島素血癥在PCOS 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[10]。

D-半乳糖通常用于誘導(dǎo)引起腦、肝及腎等多種組織的氧化損傷和其他組織一系列退行性變化的亞急性衰老動物模型[11]，其對雌性生殖器官也有影響，可誘發(fā)PCOS[3]。有報道稱，小檗堿在臨床改善新陳代謝及激素紊亂，可用于治療女性PCOS[12]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用小檗堿治療，觀察其對D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠PCOS 模型小鼠的影響。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用小檗堿治療PCOS 小鼠，可使小鼠體重降低，改善動情周期紊亂及卵巢組織結(jié)構(gòu)，修復(fù)細(xì)胞器，結(jié)果與LEE 的研究相似[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍組與模型組比較，進(jìn)食量及體重低于D-半乳糖組，與最近的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果不完全一致[14]。此薈萃分析結(jié)果表明，二甲雙胍不能改善PCOS 的體重[14]，其產(chǎn)生的原因有待進(jìn)一步探討。有報道稱，二甲雙胍可增加胃腸道紊亂的發(fā)生率[15]。

小檗堿是一種異喹啉植物生物堿，在中國小檗堿作為一種藥物，具有廣泛的藥理作用，包括抗菌、降血糖、降膽固醇、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等活動。多項(xiàng)研究表明，小檗堿對2 型糖尿病、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝、一氧化氮生成及代謝綜合征均有積極作用[16-17]。一項(xiàng)針對98 例PCOS 臨床研究表明，應(yīng)用小檗堿治療可改善月經(jīng)及排卵率[18]。其治療PCOS 的作用機(jī)制尚不清楚，可能通過活A(yù)MP 激活的蛋白激酶發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿有類似于二甲雙胍的改善卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的胰島素抵抗作用[19]，與二甲雙胍相比，小檗堿對脂質(zhì)代謝的改善作用副作用少而輕[20]。

綜上所述，小檗堿是治療PCOS 有效且副作用較少的藥物，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。