不同抗凍劑組合對(duì)4℃負(fù)壓保存的豬精液質(zhì)量的影響

王 碩，李雁冰，黃大鵬，李井春，魏國(guó)生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

目前豬人工授精技術(shù)中的精液長(zhǎng)期保存被廣泛重視[1]。常溫保存為豬精液的主要保存方式，可利用時(shí)間一般只有3 d[1]，易造成資源浪費(fèi)。相對(duì)于其他畜禽，豬冷凍精的技術(shù)應(yīng)用較少[2]，4℃保存不僅保存時(shí)間較長(zhǎng)且對(duì)豬精子損傷較小，研究精液4℃保存具有重要意義。

豬精子在低溫易引起“冷休克”[3]，因此抗低溫保護(hù)劑的選擇尤為重要。保護(hù)劑可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)外的水，使液態(tài)環(huán)境黏性上升，降低溶液中電解質(zhì)的濃度和滲透壓等作用[4-5]，達(dá)到保護(hù)精子的目的。甘油是廣泛應(yīng)用的冷凍保護(hù)劑，但具有一定毒性。Sánchez-partida 等[6]研究表明，有甘油的稀釋液中精子運(yùn)動(dòng)性比沒有甘油更好。乙二醇活性較強(qiáng)，在一定條件下易產(chǎn)生酸類，造成精子損傷，而甘油較穩(wěn)定。孫時(shí)軍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在4℃下采用1%乙二醇對(duì)精子活率的保護(hù)效果最好。本實(shí)驗(yàn)在Modena 基液中添加不同比例的乙二醇和甘油，同時(shí)采用負(fù)壓處理，通過檢測(cè)精子活率、直線速度、路徑速度、畸形率、鞭打頻率參數(shù)，探究組合劑對(duì)精液的保存效果，為豬精液的4℃保存研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 甘油（吉林省軍區(qū)化工廠生產(chǎn)）；乙二醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）；每1 升Modena 稀釋液中含：葡萄糖 27.50 g；NaHCO31 g；TRIS 5.65 g；檸檬酸 2.9 g；檸檬酸鈉 6.9 g；EDTA-2Na 2.6 g；青霉素 0.074 g；鏈霉素 0.05 g；BSA 4 g。Modena 稀釋液藥品成分均購(gòu)自西格瑪公司。

1.2 精液來源 豬精液采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場(chǎng)，采集3 頭健康無病長(zhǎng)白種公豬混合精液，年齡為2～3 歲。無異味、色澤為乳白色、精子活力在0.7 以上的精液。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將稀釋后精液分成6 組，添加抗凍劑分 別 為0.00%+0.00%（ 對(duì) 照 組）、0.50%+0.50%、0.75%+0.25%、0.25%+0.75%、0.00%+1.00%、1.00%+0.00%的甘油和乙二醇，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各組稀釋液有效羥基含量分別為0.00×10-2、3.13×10-2、22.77×10-2、27.10×10-2、36.13×10-2、42.40×10-2mol/L。檢測(cè)不同保存時(shí)間段的精子質(zhì)量參數(shù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 豬精液的稀釋 原精液采集后1～2 h 內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，采用精板計(jì)數(shù)法檢測(cè)原精液的精子密度，用添加乙二醇和甘油的Modena 基礎(chǔ)稀釋液進(jìn)行稀釋，稀釋后密度為1×108個(gè)/mL。

1.4.2 精液4℃保存處理 將稀釋后的各組放入負(fù)壓瓶中，通過真空泵將其壓強(qiáng)調(diào)整至負(fù)壓 0.04 MPa，用數(shù)層紗布包裹，轉(zhuǎn)入17℃的恒溫箱內(nèi)降溫平衡1.5 h，再轉(zhuǎn)入4℃恒溫箱內(nèi)，降溫過程平穩(wěn)緩慢。每隔12 h 對(duì)精液緩慢混勻，避免精子沉聚而損傷。

1.4.3 精子質(zhì)量參數(shù)的檢測(cè) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在保存的各時(shí)間段（1、3、5、7、9、11、13 d）定時(shí)取樣，樣品需在37℃培養(yǎng)箱中復(fù)蘇15 min，通過邁朗全自動(dòng)精子分析儀檢測(cè)精子活率、路徑速度、直線速度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用 StatView 5.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。P＜0.05 為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同抗凍劑配合對(duì)精子活率的影響 由表1 可知，隨著保存天數(shù)的增加，各組精子活率呈逐漸下降趨勢(shì)。相對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組精子活率的下降速度較快，1 d 后精子活率低于其他組（P＜0.05）。保存13 d 時(shí)僅0.25%+0.75%、1.00%+0.00%組精子有活率，其中，1.00%+0.00%組精子活率在9～13 d 高于除0.25%+0.75%之外的3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，0.25%+0.75% 組在9～13 d的精子活率高于0.50%+0.50% 組和0.75%+0.25% 組（P＜0.05）；0.75%+0.25%組在保存9～11 d 的精子活率高于0.50%+0.50%組（P＜0.05）。精子活率基本符合“有效羥基”含量越高保存效果越好的原理。

2.2 不同抗凍劑配合對(duì)精子路徑速度的影響 由表2 知，對(duì)照組1 d 后精子路徑速度大幅度下降，且顯著低于各實(shí)驗(yàn)組，而各實(shí)驗(yàn)組下降速度緩慢。1.00%+0.00%組在1～13 d的精子路徑速度高于其他組（P＜0.05）。在實(shí)驗(yàn)組中，0.25%+0.75%組在7～13 d 的精子路徑速度高于0.50%+0.50%、0.75%+0.25% 組（P＜0.05）；0.75%+0.25%、0.00%+1.00%組在7～11 d高于0.50%+0.50%組（P＜0.05），但兩者無顯著差異；0.25%+0.75% 組在11～13 d 高于0.00%+1.00% 組（P＜0.05），且13 d 時(shí)0.00%+1.00%組無速度。

表1 不同抗凍劑配合對(duì)精子活率的影響 %

表2 不同抗凍劑配合對(duì)精子路徑速度的影響 μm/s

2.3 不同抗凍劑配合對(duì)精子直線速度的影響 由表3知，對(duì)照組的直線速度在1 d 后就大幅度下降，且低于各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。1.00%+0.00% 組在1～13 d 的直線速度高于其他各組（P＜0.05），且在13 d 時(shí)仍有速度。5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，0.25%+0.75% 組在9～13 d 的直線速度高于0.50%+0.50%、0.75%+0.25%組（P＜0.05）；0.75%+0.25%組在7～11 d高于0.50%+0.50%組（P＜0.05），且這2 組13 d 時(shí)都無速度；0.25%+0.75%組在11～13 d高于0.00%+1.00% 組（P＜0.05）。0.00%+1.00% 組 在5～11 d 高于0.50%+0.50% 組（P＜0.05），在9～11 d 高于0.75%+0.25%組（P＜0.05）。

2.4 不同抗凍劑配合對(duì)精子畸形率的影響 由表4 可知，各組精子畸形率隨著保存天數(shù)的增加呈逐漸上升趨勢(shì)。其中，對(duì)照組在2～11 d 的畸形率高于各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，1.00%+0.00%組在11～13 d 的精子畸形率低于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；0.00%+1.00%組在3～13 d低于0.50%+0.50%、0.75%+0.25%組（P＜0.05），0.75%+0.25%組在11～13 d 低于0.50%+0.50%組（P＜0.05）；0.00%+1.00%組在9～13 d 低于0.50%+0.50%、0.25%+0.75%組（P＜0.05），而0.25%+0.75%組在3～13 d 低于0.00%+1.00%組（P＜0.05）。

2.5 不同抗凍劑配合對(duì)精子鞭打頻率的影響 由表5可知, 各組精子鞭打頻率隨著保存天數(shù)的增加呈逐漸下降趨勢(shì)。對(duì)照組的鞭打頻率從1 d 后低于各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，0.50%+0.50%、0.75%+0.25%組間的鞭打頻率差異不顯著；0.00%+1.00%組在9～13 d低于0.25%+0.75%、1.00%+0.00%組（P＜0.05）；1.00%+0.00%組在13 d 高于0.25%+0.75%組（P＜0.05）。

表3 不同抗凍劑配合對(duì)精子直線速度的影響 μm/s

表4 不同抗凍劑配合對(duì)精子畸形率的影響 %

表5 不同抗凍劑配合對(duì)精子鞭打頻率的影響 HZ

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)壓處理，可有效降低精液內(nèi)的含氧量，減緩精子代謝過程，也可抑制微生物的滋生，從而降低對(duì)精子的損傷以及疾病的傳播。由于乙二醇活性較強(qiáng)，低氧環(huán)境可減緩乙二醇的變質(zhì)過程，可減少酸類物質(zhì)對(duì)精子的損傷。

本實(shí)驗(yàn)選用的Modena稀釋液對(duì)精液保存效果良好[8-9]。甘油與乙二醇是良好的抗凍劑，最初是Polge 等[10]發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)牛精子具有抗凍保護(hù)作用，以此家畜精液長(zhǎng)期保存技術(shù)有了重大突破。保護(hù)劑的羥基與水之間以氫鍵的形式鍵合，使溶液粘稠度升高，同時(shí)保護(hù)劑可以沖淡溶液中溶質(zhì)鹽濃度和滲入細(xì)胞內(nèi)，降低攝入精子的鹽量，調(diào)節(jié)胞內(nèi)過冷狀態(tài)，從而緩解細(xì)胞脫水皺縮的程度及速度[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)均顯示0.25%甘油+0.75%乙二醇組的精子保存效果較好，但1%甘油組的保護(hù)效果優(yōu)于0.25% 甘油+0.75% 乙二醇組，0.25% 甘油+0.75% 乙二醇組優(yōu)于1% 乙二醇組，說明甘油與乙二醇不同比例組合會(huì)弱化保護(hù)作用，可能是2種保護(hù)劑分子鍵合所致。高才等[12]研究表明，甘油與乙二醇的羥基除了與水鍵合外，自身也有鍵合，從而會(huì)弱化與水鍵合的效果。溶液中“羥基濃度”近似相等時(shí)乙二醇的未結(jié)冰水略高于甘油，說明2 種保護(hù)劑在水溶液中有著復(fù)雜的溶質(zhì)與溶劑、溶劑與溶劑、溶質(zhì)與溶質(zhì)之間的相互作用，溶質(zhì)結(jié)合水的能力確實(shí)與溶質(zhì)中的羥基含量有定量的關(guān)系。根據(jù)相似相溶等原理分析推測(cè)，乙二醇與甘油首先鍵合會(huì)造成有效羥基量減少，從而弱化對(duì)精子的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，0.25% 甘油+0.75%乙二醇組的有效羥基含量低于1%乙二醇組，在9 d 之后保存效果優(yōu)于1% 乙二醇組，從抗凍劑組成來看1%乙二醇組乙二醇含量高于0.25% 甘油+0.75% 乙二醇組，表明乙二醇活性較強(qiáng)，若保存不當(dāng)易產(chǎn)生酸類，造成精子損傷，而甘油較穩(wěn)定，pH 變化可能是0.25%甘油+0.75%乙二醇組保存效果顯著高于1%乙二醇組的原因。本實(shí)驗(yàn)與孫時(shí)軍等[7]在7 d 時(shí)1%乙二醇組的精子活率優(yōu)于1%甘油組的結(jié)果不同，本實(shí)驗(yàn)在7 d 時(shí)1%乙二醇組與1%甘油組的精子活率差異不顯著，7 d 后1%甘油組顯著優(yōu)于1%乙二醇組，并且直線速度指標(biāo)在1 d后1%甘油組顯著優(yōu)于1%乙二醇組。

甘油會(huì)導(dǎo)致胞體膜損傷和頂體膜的穿透能力改變。本實(shí)驗(yàn)保護(hù)劑總濃度為1%，低于冷凍保存甘油含量對(duì)精子損傷較低。李青旺等[13]研究表明，乙二醇用于冷凍保護(hù)劑，精子尾部畸形較多，頂體較少，而甘油引起精子尾部畸形較少，頂體較多。曾維斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)，將甘油與乙二醇組合使用既可保護(hù)冷凍精液中精子頂體又保護(hù)其尾部。本實(shí)驗(yàn)中，1%乙二醇組的路徑速度與直線速度顯著低于1%甘油組，可能是乙二醇引起精子尾部異常所致。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，部分精子的質(zhì)膜損傷，造成精子難以承受滲透壓變化，使細(xì)胞內(nèi)部機(jī)制ATP 供應(yīng)不足，致使精子運(yùn)動(dòng)形式變化和運(yùn)動(dòng)性能喪失[15]。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在精液基礎(chǔ)液中添加一定量的甘油和乙二醇在4℃負(fù)壓環(huán)境下可顯著提高豬精子的活率、路徑速度、直線速度、鞭打頻率，降低精子畸形率，其中，1% 甘油組對(duì)精液保存效果最好，0.25% 甘油+0.75%乙二醇組保存效果優(yōu)于其他組合組和1%乙二醇組，且甘油與乙二醇分子間有相互作用關(guān)系，如果按量因子，目前實(shí)驗(yàn)可分析二者互作效應(yīng)。