草原紅牛FABP7 基因克隆、生物信息學(xué)及組織表達(dá)差異分析

呂 陽，曹 陽，高 一，劉理想，薛佳佳，張國梁

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林公主嶺 136100）

草原紅牛是我國第1 個肉乳兼用型優(yōu)良品種，具有肉質(zhì)性能好、口感細(xì)嫩、風(fēng)味獨特、遺傳性能穩(wěn)定等特點，是東北地區(qū)肉牛的主要品種[1]，但與國外優(yōu)質(zhì)肉牛品種相比仍存在個體偏小、產(chǎn)肉性能偏低等缺點，因此加強(qiáng)選種選育工作、深入研究其脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制，對了解草原紅牛的肉用性能具有重要價值。脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是一種細(xì)胞內(nèi)低分子量（14 ～16 ku）多肽，分布于脊椎動物、非脊椎動物細(xì)胞質(zhì)中，主要有9種脂肪酸結(jié)合蛋白[2]，并且在大多數(shù)組織中含量豐富，是胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員。FABPs 參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運輸和體內(nèi)脂肪的合成與降解，包括長鏈脂肪酸和類視黃醇的攝取和細(xì)胞內(nèi)運輸，與長鏈脂肪酸緊密結(jié)合發(fā)揮重要作用。另外還在基因調(diào)控、細(xì)胞信號、細(xì)胞生長和分化中發(fā)揮作用[3]。FABPs 家族成員中，F(xiàn)ABP7（Fatty Acid Binding Protein 7）是腦型脂肪酸結(jié)合蛋白(Brain Lipid Binding Protein)，最初在腦組織發(fā)現(xiàn)分離，主要作用是調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取和胞內(nèi)運輸，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)。FABP7 位于脂質(zhì)代謝的經(jīng)典通路PPAR 通路中[4]，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，并在脂肪沉積中起作用[5]。近年來家畜脂肪沉積及脂代謝的分子機(jī)制研究廣泛，F(xiàn)ABP7 基因作為分子輔助標(biāo)記參與其中，具有潛在研究價值。目前，關(guān)于FABP7基因的研究主要集中于雞、豬的脂肪沉積分子機(jī)制，F(xiàn)ABP7 基因?qū)ε５闹x是否有影響鮮有報道。因此，本研究以草原紅牛為研究對象，利用RT-PCR 技術(shù)克隆草原紅牛FABP7 基因編碼區(qū)序列，并使用多種生物軟件和在線工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過qPCR 技術(shù)檢測FABP7 基因在各組織間mRNA 的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究FABP7 基因在牛脂代謝及脂肪沉積等方面的調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗所用的草原紅牛樣品來自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，飼養(yǎng)于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院草原紅牛育種實驗場，3 頭健康的24 月齡草原紅牛閹牛屠宰后，采集心、肝、腎、胃、腸、肌肉、皮下脂肪等組織，用錫箔紙包好并迅速放入液氮中凍存，后期一部分放入-80℃冰箱用于提取RNA。

1.2 主要試劑 Trizol 購自Invitrogen 公司；pMD19-T 載體購自TaKaRa 公司；Axygen DNA 凝膠回收試劑盒購自Axygen 公 司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 購自羅氏(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中牛FABP7（登錄號：NM_001078162.2）的mRNA 序列，使用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計該基因的CDS 區(qū)序列特異性引物及熒光定量PCR 引物，選取GAPDH 基因（登錄號：NM_001034034.2）為內(nèi)參基因，序列見表1。引物由金唯智生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 草原紅牛FABP7 基因克隆 按照Trizol 試劑使用說明書對草原紅牛的小腸組織進(jìn)行總RNA 的提取，使用紫外分光光度計檢測其濃度和純度（OD 值在1.8～2.0），符合要求后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR 擴(kuò)增體系共20 μL：Mix 10 μL，10 pmol/L 上、下游引物各0.5 μL，100 ng/μL cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，49.9℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35 個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測后使用PCR 清潔試劑盒回收目的條帶。采用TA 克隆的方法，將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體16℃孵育30 min 進(jìn)行連接，隨后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)菌均勻涂布在預(yù)先準(zhǔn)備好的氨芐青霉素平板上，倒置放于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落，在含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖床37℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，送往蘇州金唯智生物公司測序。

1.3.3 FABP7 基因生物信息學(xué)分析 通過NCBI-BLAST 對草原紅牛FABP7 基因編碼區(qū)核苷酸序列與牛（登錄號：NM_001078162.2）、羊（登錄號：XM_004011152.3）、豬（登錄號：NM_001025229.1）、人（登錄號：NM_00131 9039.1）、鼠（登錄號：NM_021272.3）、雞（登錄號：NM_205308.2）FABP7 基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對，并利用Mega6.0 軟件構(gòu)建草原紅牛、普通牛、羊、豬、鼠、雞FABP7 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用DNAStar 中SeqMan 軟件對測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的牛FABP7 基因序列進(jìn)行比對，利用在線ProtParam 分析FABP7 基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用在線Net Phos3.1、NetOGlyc4.0、NetNGlyc1.2、SignalP 4.1 Server 分析預(yù)測FABP7 氨基酸序列中存在的潛在磷酸化位點、O-糖基化位點、N-糖基化位點及信號肽，使用Scratch Protein Predictor 對FABP7 蛋白進(jìn)行二硫鍵預(yù)測；運用在線工具Prot Scale 進(jìn)行氨基酸序列的親疏水性分析；利用在線工具TMHMM2.0 和Tmpred 對蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；TargetP 1.1 Server、PSORT II 預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；PredictProtein 預(yù)測FABP7 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL 分析預(yù)測FABP7 蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.3.4 FABP7 基因各組織表達(dá)量測定 將提取的各組織總RNA 反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 作為模板（共3 頭），實時熒光定量PCR（qPCR）檢測FABP7 基因在心、肝、腎、胃、腸、肌肉、脂肪中的相對表達(dá)量，qPCR 反應(yīng)體系為20 μL：10 pmol/L 上、下游引物各0.5 μL，100 ng/μL cDNA 1 μL，SYBR 10 μL，H2O 8 μL；程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)；熔解曲線分析：95℃ 5 s，65℃ 1 min，每個待測樣品設(shè)置3 個重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計分析 采用2-ΔΔCt方法對實時熒光定量PCR 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Graph 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（或標(biāo)準(zhǔn)差），以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 FABP7 基因CDS 區(qū)序列克隆鑒定 以反轉(zhuǎn)錄得到的小腸組織cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到399 bp 左右的擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小一致（圖1），同時用TA 克隆的方法，通過測序比對成功克隆草原紅牛FABP7 基因編碼區(qū)。

圖1 草原紅牛FABP7 基因編碼區(qū) PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.2 FABP7 基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 FABP7 基因序列分析 如圖2 所示，F(xiàn)ABP7 基因與牛、羊、豬、人、鼠、雞的同源性分別為99%、98%、94%、92%、85%、85%，比對發(fā)現(xiàn)同源性在85%～99%，說明該基因在生物進(jìn)化過程中比較保守；并用Mega6.0 構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹，差異度單位為0.02，98、93、49、72 代表每個分支的置信度，如果2個物種在同一豎線上，代表同源性越近，如果越長說明越遠(yuǎn)。因此，草原紅牛與牛、綿羊的親緣關(guān)系最近，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖2），所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以直觀表達(dá)不同物種之間的分子水平差異。

圖2 FABP7 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.2 FABP7 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 通過在線工具ProtParam分析草原紅牛FABP7 蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP7基因共編碼132 個氨基酸，分子式C659H1037N179O206S6，總原子數(shù)2 087，分子量為14.96 ku，理論等電點為5.38。氨基酸組成結(jié)果顯示，共包含20 種氨基酸，其中纈氨酸（V）所占的比例最高為11.4%（15 個氨基酸），脯氨酸（P）所占的比例最低為0.8%（1 個氨基酸），同時包含21 個負(fù)電荷氨基酸堿基（天冬氨酸D+谷氨酸E）和17 個正電荷氨基酸（精氨酸R+賴氨酸K），該蛋白整體偏向負(fù)電荷，消光系數(shù)14 105，不穩(wěn)定系數(shù)為26.27，說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白，預(yù)計的半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為73.71，總平均親水性為-0.378，蛋白表現(xiàn)出親水性，并使用Protscale 分析其蛋白親疏水性發(fā)現(xiàn)，該蛋白為親水性蛋白。

2.2.3 FABP7 蛋白潛在的磷酸化位點、糖基化位點、信號肽、跨膜區(qū)及二硫鍵分析 FABP7 氨基酸序列中共存在14 個潛在的磷酸化位點（圖3），4 個絲氨酸磷酸化位點，9 個蘇氨酸磷酸化位點，1 個酪氨酸磷酸化位點。分析表明不存在潛在位點O-糖基化，1 個N-糖基化潛在位點（圖4）位于第35 氨基酸；SignalP 4.1 Server預(yù)測該氨基酸序列不存在信號肽；FABP7 氨基酸序列的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP7 氨基酸序列不存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。FABP7 蛋白在Cys6 和Cys81 位置存在1 個二硫鍵。

圖3 FABP7 蛋白潛在的磷酸化位點分析

圖4 FABP7 蛋白潛在的N-糖基化位點分析

2.2.4 亞細(xì)胞定位 使用TargetP 1.1 Server、PSORT II預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明分泌信號通路位點（mTP）0.061、線粒體作用位點（SP）0.091，所占比例均很小，無信號肽，說明該蛋白不屬于分泌型蛋白；FABP7 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)（65.2%）上，細(xì)胞核（21.7%）和線粒體（13%）中也有分布（表2）。

表2 FABP7 蛋白亞細(xì)胞定位

2.2.5 FABP7 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用PSIPRED 預(yù)測FABP7 蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，α-螺旋占12.12%，β-折疊占58.33%，無規(guī)則卷曲占29.55%，為混合型蛋白。利用SWISS-MODEL 分析預(yù)測FABP7 蛋白三級結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)存在2 個α- 螺旋結(jié)構(gòu)和10 條β- 折疊（圖6），結(jié)果與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)基本一致。

圖5 FABP7 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 FABP7 基因在草原紅牛不同組織間的差異表達(dá) 如圖7 所示， FABP7 基因在6 個組織中均有表達(dá)，在腸組織表達(dá)量最高，高于其他組織（P＜0.05）；在心臟、脂肪和胃中中度表達(dá)，在肝臟和肌肉中相對低表達(dá)。

圖6 FABP7 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖7 FABP7 基因在草原紅牛各組織中的mRNA 相對表達(dá)量

3 討 論

目前，關(guān)于FABP7 基因的研究主要集中在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方面，F(xiàn)ABP7 在神經(jīng)干細(xì)胞和發(fā)育中的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)。多不飽和脂肪酸（PUFAs）是大腦的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，對大腦的正常發(fā)育至關(guān)重要，PUFAs 參與細(xì)胞運輸和其生理作用，與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白基因家族編碼的脂肪酸結(jié)合蛋白緊密相關(guān)，F(xiàn)ABP7是ω-3 PUFA 的強(qiáng)結(jié)合劑，表明其通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在膠質(zhì)細(xì)胞的分化或增殖中發(fā)揮作用[6-8]。

此外，關(guān)于FABP7 基因在畜禽動物脂代謝作用的研究相對較少。在全基因組關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)FABP7 可能是影響北京油雞公雞體重以及胴體性狀的候選基因[9]，并且在雞[10]、豬[5]的脂肪沉積分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的FABP7 基因上調(diào)，并參與PPAR 信號通路；同時，敲除FABP7 減少細(xì)胞對長鏈脂肪酸的攝取和Hepa1-6 細(xì)胞中脂質(zhì)的積累[11-12]。這些研究說明FABP7 可能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用。然而，關(guān)于FABP7 基因?qū)εＶx是否有影響的研究鮮有報道。

本研究通過對草原紅牛FABP7 基因核苷酸序列與其他7 個物種進(jìn)行同源性對比分析，發(fā)現(xiàn)草原紅牛與普通牛、綿羊的親緣關(guān)系最近，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，符合生物進(jìn)化特征，并且具有廣泛的同源性。信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列不存在信號肽，不屬于分泌蛋白，說明該結(jié)構(gòu)不具有把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)的功能。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，F(xiàn)ABP7 蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體上，說明FABP7 蛋白可通過接受外來傳入的信號，參與細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控代謝，從而維持細(xì)胞的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)等。磷酸化位點和糖基化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)，共有14 個潛在的磷酸化位點，而磷酸化主要發(fā)生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基[13]，蛋白磷酸化能夠修飾蛋白，存在的磷酸化對于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用[14]；N-糖基化潛在位點1 個，與磷酸化類似，蛋白糖基化同樣具有修飾蛋白的作用，經(jīng)過糖基化使之形成糖蛋白，使蛋白發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[15]，蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化修飾對草原紅牛FABP7 蛋白的生物學(xué)功能具有重要的調(diào)節(jié)能力，更進(jìn)一步說明FABP7 基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能上發(fā)揮著主要作用。根據(jù)分析預(yù)測FABP7 蛋白三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)存在2 個α- 螺旋結(jié)構(gòu)和10條β- 折疊，這對于脂肪酸結(jié)合蛋白與脂肪酸分子結(jié)合的穩(wěn)定性起到了一定的作用，有助于脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運等環(huán)節(jié)。

本研究通過qPCR 方法檢測FABP7 基因在草原紅牛6 個組織的相對表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FABP7 在各個組織中均有表達(dá)，但是不同組織間的表達(dá)差異較大，腸組織表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，在心臟中的表達(dá)量僅次于腸，在脂肪和胃中中度表達(dá)，在肝臟和肌肉組織中低度表達(dá)。FABP7 在哺乳動物中的肝臟、乳腺、腎臟、皮下脂肪、肌肉中均有表達(dá)[16]，在建鯉中FABP7主要在腦、肝臟和精巢中表達(dá)[17]。本實驗中FABP7 在腸中表達(dá)量最高，而胃、腸為脂肪代謝的主要場所，參與脂肪的運輸，與脂質(zhì)代謝和脂肪沉積均密不可分，猜測不同組織間表達(dá)差異與FABP7 基因所發(fā)揮的作用有關(guān)，但目前對草原紅牛FABP7 基因各個組織的相關(guān)研究較少，具體的功能和調(diào)控機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。本研究主要為FABP7 基因在草原紅牛脂肪分化和脂質(zhì)代謝后續(xù)研究提供基礎(chǔ)資料，進(jìn)一步研究FABP7 基因在草原紅牛中脂質(zhì)代謝及脂肪沉積等方面的調(diào)控作用提供參考。