異補(bǔ)骨脂素對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠模型的作用及機(jī)制

王軍，王劍，魯敏，牧亭亭，耿亞會(huì)

骨質(zhì)疏松(OP)是臨床最常見的全身性骨骼疾病，目前已成為一個(gè)全球性的健康問題[1]。OP可分為原發(fā)性和繼發(fā)性2類，其中繼發(fā)性占比較大，患者主要表現(xiàn)為骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)受損及骨脆性增加，易骨折，因此其致殘率較高，給患者日常生活帶來嚴(yán)重影響[2-3]。不少研究證實(shí)，氧化應(yīng)激(OS)是引發(fā)OP的根本原因之一，糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體OS反應(yīng)，使生理功能受阻，長期大劑量的糖皮質(zhì)激素使用會(huì)誘發(fā)繼發(fā)性O(shè)P[4-5]。臨床上治療OP常采用抗骨吸收或促骨形成類藥物，但其對(duì)OS介導(dǎo)的OP療效并不理想，因此從抗OS方面尋求新型治療OP的藥物十分重要[6]。異補(bǔ)骨脂素是一種從豆科植物中提取的香豆素類化合物，具有防治OP的作用[7]。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討異補(bǔ)骨脂素對(duì)OS介導(dǎo)的OP的治療效果，以期為其防治提供新的思路，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物： 健康大鼠[動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)：SCXK(京)2018-0013]40只，雌性，月齡8個(gè)月，體質(zhì)量(210±10)g，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，所有大鼠自由攝食飲水。

1.1.2 試藥試劑： 骨鈣素(OCN)、骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、骨保護(hù)素(OPG)、可溶性核因子κB受體活化因子配體(sRANKL)及抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)試劑盒由英國IDS公司提供，過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)檢測試劑盒均由寧波博泰生物技術(shù)有限公司提供，β-catenin抗體、FoxO3a抗體和Axin2抗體均由美國Santa Cruz公司提供，Trizol總RNA提取試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Western-blot及凝膠電泳試劑均購自南京凱基生物有限公司，醋酸潑尼松購自浙江仙琚制藥股份有限公司，異補(bǔ)骨脂素購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備：骨密度儀(XR-46型，美國 NORLAND公司生產(chǎn))、電子天平(AEL-40SM型，日本島津公司生產(chǎn))、半自動(dòng)圖像分析儀(BioDent/OsteoProbe型，美國OsteoMesure公司生產(chǎn))、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Read Max 1900Plus型，上海閃譜生物科技有限公司生產(chǎn))、MTS材料測試系統(tǒng)(858 Mini Bionix型，美國MTS公司生產(chǎn))、顯微鏡(Olympus IX71型，日本OLYMPUS公司生產(chǎn))、電泳儀(Bio-RaD型，美國Bio-Rad公司生產(chǎn))、離心機(jī)(Allegra 64R型，美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn))。

1.2 造模與分組 2017年9月—2018年10月在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 健康大鼠40只隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和干預(yù)組，各20只。醋酸潑尼松以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成0.5 mg/ml濃度的藥液，2組大鼠每日給予10 ml·kg-1·d-1，灌胃，連續(xù)14周。自造模之日起，干預(yù)組大鼠每日上午給予醋酸潑尼松，下午給予異補(bǔ)骨脂素混懸液25 mg·kg-1·d-1，每周停1天，連續(xù)治療14周，期間密切觀察各組大鼠的生理反應(yīng)及生活情況。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)檢測： 14周時(shí)各組大鼠末次灌胃后，禁食24 h，10%水合氯醛腹腔麻醉后，右心室徹底抽血處死，血標(biāo)本離心取上清，-80℃?zhèn)浯娲郎y。ELISA 法檢測各組大鼠血清BAP、OCN、TRACP5b、sRANKL和 OPG水平，嚴(yán)格按照說明書操作要求進(jìn)行。

1.3.2 骨樣本留?。捍笫筇幩篮?，取兩側(cè)股骨、兩側(cè)脛骨和第4腰椎體(L4)，剔除周圍附著的肌肉及筋膜后，采用0.9%氯化鈉溶液沖洗，醫(yī)用紗布包裹，外面包裹一層錫紙，-80℃?zhèn)浯娲郎y。

1.3.3 骨組織氧化應(yīng)激水平檢測：將脛骨樣本采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)灌洗至骨干變白，收集灌洗液，離心后PBS重懸，調(diào)整骨髓細(xì)胞密度為2×106/ml，接種在6孔板中，無血清培養(yǎng)液37℃下培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，采用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行氧化應(yīng)激水平檢測。

1.3.4 骨密度及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析：(1)骨密度。采用骨密度儀對(duì)各組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度進(jìn)行檢測；(2)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。取右側(cè)股骨樣本解凍后，置于MTS試驗(yàn)機(jī)上采用三點(diǎn)彎曲法進(jìn)行生物力學(xué)檢測[8]，通過儀器記錄彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷，并計(jì)算剛性系數(shù)。

1.3.5 骨組織FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表達(dá)水平檢測：取右側(cè)股骨樣本解凍后，碾碎倒入勻漿器，加入裂解液混勻，按照Trizol總RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取總蛋白，-80℃下凍存;將總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離蛋白，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，置入封閉液中搖動(dòng)1 h，加入一抗(PFoxO3a、β-catenin和Axin2抗體均為1∶500稀釋)孵育，4℃下過夜。二抗孵育(1∶2 000稀釋)2 h，免疫熒光增強(qiáng)法顯色，采用Western-blot法檢測骨組織FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表達(dá)，以其與GAPHD的灰度比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)比較 與模型組比較，干預(yù)組大鼠14周后的BAP、OCN、OPG明顯升高，sRANKL和TRAP5b明顯下降(P<0.01)，見表1。

2.2 2組大鼠骨組織氧化應(yīng)激水平比較 干預(yù)組大鼠CAT及SOD水平明顯高于模型組，MDA水平明顯低于模型組(P<0.01)，見表2。

表2 2組大鼠骨組織氧化應(yīng)激水平比較

2.3 2組大鼠的骨密度情況比較 14周后，干預(yù)組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組(P<0.01)，見表3。

表3 2組大鼠的骨密度比較

2.4 2組大鼠骨生物力學(xué)性能比較 三點(diǎn)彎曲檢測大鼠股骨干的生物力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示，干預(yù)組大鼠的彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷及剛性系數(shù)較模型組明顯上升(P<0.01)，見表4。

表4 2組大鼠骨生物力學(xué)性能比較

2.5 2組大鼠骨組織FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表達(dá)比較 與模型組大鼠比較，干預(yù)組FoxO3a和Axin2蛋白水平下調(diào)，β-catenin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，見表5、圖1。

表5 2組大鼠骨組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平情況比較

表1 2組大鼠血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)比較

注：1～4為模型組，5～8為干預(yù)組

3 討 論

OP是在老年人群中發(fā)病率較高的一種全身性骨骼疾病，并給老年人生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響。近些年衰老的“OS理論”在肝病、腎病、心血管疾病及腫瘤等疾病的研究中被廣泛應(yīng)用，但在OP方面尚處于初步研究階段[9]。機(jī)體衰老時(shí)，代謝系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生較多的前氧化劑，從而對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，當(dāng)其損傷積累到一定程度時(shí)，會(huì)發(fā)生OS反應(yīng)，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生與衰老相關(guān)的退行性疾病。骨組織屬于人體第三大最易衰老組織，OS會(huì)對(duì)骨髓干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞產(chǎn)生抑制，同時(shí)會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，從而誘導(dǎo)OP的發(fā)生[10-11]。長期大量使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體高OS狀態(tài)，從而導(dǎo)致繼發(fā)性O(shè)P。大鼠是OP動(dòng)物模型最常用的動(dòng)物，其模型具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，利于學(xué)者對(duì)OP的發(fā)生機(jī)制及防治進(jìn)行探索。本研究通過醋酸潑尼松誘導(dǎo)建立OS介導(dǎo)OP大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)研究人類OS介導(dǎo) OP有著積極的指導(dǎo)意義。

尋找和篩選中藥中抗氧化及衰老的成分研究一直來都是熱點(diǎn)。天然抗氧化劑在植物中存在繁多的種類，在各種慢性病的防治方面有著重要作用[12]。異補(bǔ)骨脂素是從豆類植物中提取的一種化學(xué)活性成分，具有溫脾止瀉及溫補(bǔ)腎陽功效，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，異補(bǔ)骨脂素可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制骨吸收[13]。OCN是由成骨細(xì)胞分泌的一種功能性蛋白，可反映機(jī)體成骨細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)[14]。BAP主要存在于機(jī)體肝臟和骨骼上，是成骨細(xì)胞的表型標(biāo)志物之一[15]。OPG為破骨細(xì)胞分化因子的誘導(dǎo)受體，可減少破骨細(xì)胞的產(chǎn)生[16]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組，干預(yù)組大鼠的BAP、OCN、OPG明顯升高，sRANKL和TRAP5b明顯下降(P<0.01)。這說明異補(bǔ)骨脂素可能發(fā)揮類似雌激素作用，促進(jìn)雌激素受體陽性細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)成骨分化，從而維持骨密度，并促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生，緩解OP癥狀。

骨折是OP的嚴(yán)重并發(fā)癥，通過檢測骨組織力學(xué)特征，可有效評(píng)價(jià)OP的嚴(yán)重程度[17]。本研究通過股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，結(jié)果顯示，干預(yù)組大鼠的彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷及剛性系數(shù)較模型組明顯上升(P<0.01)，說明經(jīng)過異補(bǔ)骨脂素治療，可抵消OS介導(dǎo)OP對(duì)骨生物力學(xué)的硬性，增強(qiáng)大鼠的骨組織抵抗變形能力，提高其骨生物性能，降低骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。機(jī)體在新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，在正常狀態(tài)時(shí)，機(jī)體內(nèi)抗氧化劑和各種酶與ROS呈一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，會(huì)發(fā)生OS反應(yīng)，從而使纖連蛋白和膠原降解，對(duì)成骨細(xì)胞的正常分化產(chǎn)生抑制，并加速機(jī)體衰老[18]。SOD是機(jī)體內(nèi)可清除超氧陰離子的一種抗氧化酶，可起到抗氧化作用[19]。CAT是一種可催化過氧化氫，分解成氧和水的酶，是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，是其他巰基蛋白質(zhì)的保護(hù)劑[20]。MDA是ROS與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種代謝終產(chǎn)物，其可以反映機(jī)體受ROS攻擊的嚴(yán)重程度[21]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組CAT及SOD水平明顯高于模型組，MDA水平明顯低于模型組(P<0.01)。這是因?yàn)楫愌a(bǔ)骨脂素具有抗氧化作用，可有效清除機(jī)體內(nèi)過多的ROS，從而對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到重要作用，逆轉(zhuǎn)OS反應(yīng)，減輕機(jī)體受氧化損傷的程度。

FoxO是一種可調(diào)控OS的最重要蛋白，可包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4及FoxO6，其中FoxO3a在骨組織中廣泛存在[22]。Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化和增殖中起重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信號(hào)通路的主要成分，可啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路[23]。Axin2是一種可抑制Wnt 信號(hào)通路激活的骨架蛋白[24]。本研究顯示，干預(yù)組FoxO3a和Axin2蛋白水平下調(diào)，β-catenin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。這可能是因?yàn)镺S會(huì)促進(jìn)FoxO3a通路激活，并加重OS，同時(shí)引起成骨組織細(xì)胞凋亡，抑制成骨分化功能，異補(bǔ)骨脂素通過抗氧化作用，可抑制FoxO3a信號(hào)通路激活；同時(shí)上調(diào)β-catenin蛋白表達(dá)，使其與FoxO3a結(jié)合，啟動(dòng)調(diào)節(jié)骨組織細(xì)胞凋亡及清除 ROS的轉(zhuǎn)錄程序，促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和骨形成，通過清除過多的ROS，實(shí)現(xiàn)對(duì)Axin2的表達(dá)下調(diào)，抑制Axin2/PPARγ信號(hào)通路參與脂質(zhì)代謝，阻斷Axin2對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制，起到防治OP的作用。

綜上所述，OS會(huì)引起并促進(jìn)OP的病理進(jìn)程，而異補(bǔ)骨脂素可通過抗氧化作用，調(diào)控FoxO3a/Wnt信號(hào)通路發(fā)揮OS介導(dǎo)OP的作用。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

王軍：整理資料，分析資料，撰寫論文；王劍：修改總指導(dǎo)；魯敏：收集整理資料，分析數(shù)據(jù)，圖表設(shè)計(jì)；牧亭亭、耿亞會(huì)：參考書籍查找，收集資料