間充質(zhì)干細(xì)胞治療腎纖維化作用的研究進(jìn)展

喻希綜述 劉修恒審校

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是1966年Friedenstein等首次發(fā)現(xiàn)的。來自人體的各種組織，如骨髓、脂肪組織和胎盤等[1]。它們這些強大的分化潛力，為臨床治療各種疾病提供了新的方法[2]。另外，MSC的來源廣泛，獲取、培養(yǎng)、擴增、純化也相對容易，免疫原性低，并且較少有倫理沖突[3]，所以MSC在組織工程、基因治療和免疫治療中具有很大的潛在應(yīng)用價值。

腎纖維化是慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展至終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)的主要過程，伴隨著高發(fā)病率和病死率[4-5]。以腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化為特征，腎纖維化是一個動態(tài)過程，由4個階段組成：啟動、激活、執(zhí)行和進(jìn)展[6]。目前沒有有效的藥物來阻止ESRD的發(fā)展。因此，非常需要預(yù)防或逆轉(zhuǎn)腎纖維化的新策略?；诖?，現(xiàn)綜述不同來源的MSC以及MSC產(chǎn)生的不同物質(zhì)對腎纖維化的作用，并初步評估其療效和安全性，旨在提供對腎纖維化治療新的見解。

1 不同來源MSC對腎纖維化的作用

1.1 骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived MSCs，BM-MSCs) 目前已有很多動物研究已經(jīng)證實了BM-MSCs可以改善腎纖維化模型動物的腎功能。

Lira等[7]研究發(fā)現(xiàn)MSC治療腎血管性高血壓可以降低收縮壓、腎素、血管緊張素和1型血管緊張素受體，上調(diào)2型血管緊張素受體和膜蛋白的表達(dá)，恢復(fù)腎臟Na-K-ATP酶活性。此外，MSC還可以改善腎形態(tài)，減少腎臟纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)表達(dá)，減少蛋白尿。Xing等[8]報道，將BM-MSCs經(jīng)小鼠尾靜脈注入小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型(unilateral ureteral obstruction，UUO)小鼠體內(nèi)，與對照組相比，BM-MSCs組的腎間質(zhì)纖維化顯著減弱，并且抑制了UUO誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的活化和增殖，減少UUO小鼠中巨噬細(xì)胞的腎小管間質(zhì)浸潤，起到了保護(hù)腎功能的作用。Matsui等[9]進(jìn)行了一項研究，在UUO模型中，BM-MSCs通過降低STAT3的活化和STAT3依賴的MMP-9的產(chǎn)生，在一定程度上防止了梗阻引起的腎纖維化，也能促進(jìn)腎功能恢復(fù)。Lang等[10]在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠的疾病模型中研究證實，BM-MSCs能顯著抑制DN大鼠腎纖維化，機制可能與抑制TGF-β1 / Smad3通路、減少PAI-1蛋白質(zhì)的表達(dá)、減少細(xì)胞外基質(zhì)的積累相關(guān)，從而平衡了纖溶系統(tǒng)，保護(hù)腎功能。Gregorini等[11]體內(nèi)外實驗證實BM-MSCs通過抑制人抗原R(human antigen R，HuR)抑制了腎素血管緊張素系統(tǒng)來預(yù)防纖維化，研究結(jié)果提示BM-MSCs可能通過某種分子機制在具有共同的RAS激活途徑的疾病中起預(yù)防纖維化作用。 Yoshida等[12]進(jìn)行了一項研究，發(fā)現(xiàn)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BM-MSCs通過改變巨噬細(xì)胞的極性抑制炎性反應(yīng)，通過腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6(tumor necrosis factor-α-induced protein 6，TNFαIP)抑制炎性細(xì)胞聚集，較用含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSC更有利于減弱UUO小鼠腎纖維化程度。

綜上所述，BM-MSCs可減輕纖維化進(jìn)程，并可抑制炎性反應(yīng)、凋亡和EMT相關(guān)的調(diào)節(jié)因子。這些因素主要涉及幾個信號通路包括：TGF-β1/Smad、NK-κB、JAK-STAT通路。

1.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC) 脂肪組織作為一種理想的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，因其可獲得性、豐富性和自充盈性而受到廣泛關(guān)注[13]。關(guān)于ADSC的研究非常豐富，包括自體、同源性和異種ADSC移植。

Zhu等[14]研究ADSC對腎纖維化的作用中發(fā)現(xiàn)， ADSC可上調(diào)腎小管Sox9的表達(dá)，促進(jìn)腎小管再生，減輕AKI，并減輕隨后的腎纖維化，最終改善腎功能。Burgos-Silva等[15]研究ADSC在急性腎損傷和慢性腎損傷小鼠中的作用，發(fā)現(xiàn)ADSC可以通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和細(xì)胞周期，在腎毒性損傷的腎臟中發(fā)揮保護(hù)作用，促進(jìn)腎臟損傷恢復(fù)和功能改善，抑制器官纖維化，提供長期的免疫調(diào)節(jié)。Song等[16]使用來自Wistar大鼠附睪周圍組織的ADSC，通過將這些ADSC移植到UUO大鼠模型尾靜脈，觀察到ADSC通過抑制TGF-β1/ Smad2 / 3/7信號傳導(dǎo)，降低成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(FSP-1)、α-SMA、EMT和纖連蛋白的表達(dá)，以及減少炎性反應(yīng)緩解腎臟間質(zhì)纖維化。Zou等[17]將小鼠ADSCs包被針對腎損傷分子-1(KIM-1)的抗體，涂層抗體ab-KIM-1對ADSC增殖幾乎沒有影響。在單側(cè)腎動脈狹窄(RAS)模型中，這些經(jīng)ADSC處理的小鼠表現(xiàn)出毛細(xì)血管密度和腎臟灌注的改善和細(xì)胞凋亡，氧化損傷和纖維化的減弱(下調(diào)PAI-1，但對TGF-β表達(dá)沒有影響)。對于同種異體ADSC移植研究，在2個試驗中進(jìn)行了研究。Quimby等[18]的研究選擇自然發(fā)生CKD的貓，每2周接受來自無特異性病原體(SPF)貓脂肪組織的ADSC靜脈注射，血清肌酐濃度顯著降低。另一個由同一研究小組進(jìn)行的貓實驗表明血清肌酐、磷、鉀、GFR、BUN等沒有明顯的變化[19]。

1.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord MSCs，uc-MSCs) 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞資源極其豐富，采集過程安全、無創(chuàng)[20]。此外，uc-MSCs具有較低的免疫原性，同時較BM-MSCs具有更有效的增殖方式。此外，越來越多的研究證實了這一點[21-22]。uc-MSCs作為一種新興的干細(xì)胞資源具有良好的治療特性。

Rota等[23]做了一項關(guān)于uc-MSCs的研究，指出uc-MSCs具有優(yōu)于其他間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎抗纖維化作用，能減少巨噬細(xì)胞浸潤并誘導(dǎo)其向M2型分化，來自uc-MSCs的條件培養(yǎng)基具有相同的細(xì)胞保護(hù)作用，能誘導(dǎo)腎組織修復(fù)，可作為CKD患者最可靠的臨床治療工具。Rodrigues等[24]建立大鼠缺血再灌注損傷模型，然后腹腔注射人uc-MSCs。發(fā)現(xiàn)uc-MSCs治療的大鼠有更好的腎小管功能和促進(jìn)腎小球濾過，以及較低水平的TGF-β1、巨噬細(xì)胞浸潤和衰老相關(guān)蛋白β-半乳糖苷酶。較少的巨噬細(xì)胞浸潤可能與較輕的腎纖維化相關(guān)。Fan等[25]在腹膜透析(PD)誘導(dǎo)纖維化的大鼠模型中檢測了人uc-MSCs的作用。該模型是通過甲基乙二醛(MGO) PD溶液建立的，大鼠腹腔注射uc-MSCs可明顯減輕腹膜纖維化(降低了α-SMA和膠原的表達(dá))、炎性反應(yīng)、血管生成和超濾衰竭。證明了uc-MSCs抑制纖維化可能與TGF-β信號通路相關(guān)。

1.4 牙齒干細(xì)胞(dental stem cells,DSCs) 類似于MSCs，DSCs也存在于人的一生之中[26]。DSCs有5種類型:脫落乳牙干細(xì)胞、牙周韌帶干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、根尖乳頭干細(xì)胞和牙濾泡前體細(xì)胞[27]。

Barros等[28]探討了低溫保存的DSCs在急性腎功能衰竭(ARF)大鼠模型中的趨向性。經(jīng)靜脈或腹腔注射后，DSCs表現(xiàn)出嗜酸性和周細(xì)胞樣的特性，并有助于加速腎小管結(jié)構(gòu)的再生，減弱纖維化。此外，Hattori等[29]證實，在缺血再灌注損傷引發(fā)的急性腎損傷中，DSCs能夠降低炎性因子，促進(jìn)腎功能恢復(fù)。

1.5 羊水來源間充質(zhì)干細(xì)胞(amniotic fluid-derived MSCs,AF-MSCs) 一些妊娠組織，包括羊水、胎盤膜和胎盤，在出生后經(jīng)常被當(dāng)作垃圾處理。但是其含有豐富的高多能干細(xì)胞資源，包括間充質(zhì)干細(xì)胞。通過在中期進(jìn)行羊膜穿刺術(shù)，可從少量羊水中獲得羊水來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(AF-MSCs)[30]。目前，幾乎所有關(guān)于AF-MSCs對腎纖維化的研究均以動物模型研究為中心。

Baulier等[31]采用豬模型，在同種異體腎移植6 d后，通過腎動脈將自體的AF-MSCs直接注射到移植腎。注入AF-MSCs可增強腎小管和腎小球功能，從而消除纖維化，增加體內(nèi)TGF-β含量，這表明自體AF-MSCs可能通過TGF-β通路發(fā)揮抗纖維化作用。Sun等[32]在UUO小鼠模型中表明，人AF-MSCs可以增加微血管密度，從而改善間質(zhì)纖維化，保護(hù)腎功能。Sedrakyan等[33]建立了小鼠Alport綜合征模型(Col4a5敲除小鼠)，采用心臟內(nèi)移植的同源AF-MSCs的治療方法。結(jié)果表明，AF-MSCs在蛋白尿發(fā)生前可延遲間質(zhì)纖維化和腎小球硬化的進(jìn)展。M2巨噬細(xì)胞極化也被證實在AF-MSC治療的鼠腎臟中起作用。此外，腎素—血管緊張素系統(tǒng)被AF-MSCs抑制可能也有助于緩解腎纖維化。

1.6 外周血干細(xì)胞(peripheral blood MSCs，PB-MSCs) 目前對于PB-MSCs的報道比較少。Pan等[34]收集PB-MSCs，經(jīng)卵母細(xì)胞誘導(dǎo)劑純化，重新編成誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞(iMSCs)，隨后將iMSCs注射到兔UUO模型中。研究表明，iMSCs顯著降低BUN和血清肌酐值，提高腎小球濾過率，降低TGF-β1，并且誘導(dǎo)組幾乎沒有發(fā)生纖維化。

2 MSCs產(chǎn)生的不同物質(zhì)對腎纖維化的影響

2.1 MSCs條件培養(yǎng)基(condition medium，CM) Liu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，uc-MSCs-CM可顯著降低UUO誘導(dǎo)的丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平，增加谷胱甘肽(GSH)活性。此外，uc-MSCs-CM顯著降低UUO腎臟TGF-β1、α-SMA、TNF-α、Collagen-I的表達(dá)，促進(jìn)了腎小管上皮細(xì)胞的擴散和抑制其凋亡。此外，E-cadherin表達(dá)的增加也反映了腎間質(zhì)纖維化的有效改善。證明uc-MSCs-CM可保護(hù)UUO誘導(dǎo)的腎臟損傷，因此可能是預(yù)防CKD進(jìn)展的潛在工具。

2.2 外囊泡(extracellular vesicles，EV) Grange等[36]研究發(fā)現(xiàn)從BM-MSCs分離提取得到的EV顯著改善了糖尿病小鼠的一些功能參數(shù)，例如白蛋白/肌酸酐排泄，血肌酐和血尿素氮，另外在糖尿病腎病進(jìn)展期間發(fā)生的腎纖維化被顯著抑制。Luo等[37]推測MSC通過旁分泌機制釋放EV，進(jìn)而在大鼠模型中顯著改善了輸尿管纖維化，恢復(fù)了輸尿管形態(tài)發(fā)育，MSC-EVs還可以減輕腎積水，減少腎功能障礙和減弱TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化。Eirin等[38]研究發(fā)現(xiàn)，從ADSC分離出來的ADSC-EV可以改善慢性腎損傷，減輕腎纖維化，最終改善腎臟的功能。在腎內(nèi)遞送的ADSC-EV能減少腎臟炎性反應(yīng)，增加修復(fù)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，上調(diào)IL-10的表達(dá)，提示起了抗炎作用。但他們同時指出，ADSC-EV的長期影響、最佳時間和劑量以及對人類的功效仍需要大量研究。

2.3 MSCs的外泌體(exosome) Ebrahim等[39]發(fā)現(xiàn)BM-MSCs的外泌體能引起糖尿病腎的自噬，顯著增加腎組織中LC3和Beclin-1的表達(dá)，通過mTOR信號通路降低纖維化標(biāo)志物的表達(dá)，從而減弱腎纖維化、改善腎功能并促進(jìn)腎組織的組織學(xué)恢復(fù)。Nagaishi等[40]在糖尿病腎病小鼠模型中使用從BM-MSCs純化的外泌體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)外泌體在腎小管上皮細(xì)胞中具有抗凋亡作用、抗纖維化和保護(hù)細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的作用，腎小球系膜底物的增加受到抑制，從而指出BM-MSCs通過旁分泌作用的腎營養(yǎng)因子，包括外泌體發(fā)揮治療作用。 Wang等[41]報道在UUO小鼠模型中，BM-MSCs通過外泌體攜帶miRNA-let7c選擇性地聚集于受損腎臟，上調(diào)miR-let7c基因表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化作用。

3 MSCs對腎纖維化的不利影響

盡管大多數(shù)研究均顯示MSC治療能夠給患者帶來益處，但是也有相反的報道。Kim等[42]報道1例經(jīng)過自身MSC治療后腎功能迅速惡化患者，在自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注1周后，腎功能在無明顯誘因下迅速加重，MSC給藥后3個月開始血液透析。腎活檢示重度間質(zhì)纖維化和炎性細(xì)胞浸潤，少數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD34和CD117表面標(biāo)志物。

綜上所述，基于MSC的腎纖維化治療因其來源廣泛、獲取和收集方便、免疫原性低、不良反應(yīng)低等優(yōu)點而越來越被人們所接受，具有廣泛的研究前景。