甜菜紅素對小鼠體內(nèi)抗氧化及免疫調(diào)節(jié)的作用

包曉瑋，韓海霞，杜光明，魏辰業(yè)，朱 璇，任 薇，曾蘭君，張亞濤

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

紅甜菜（Beta vulgarisvar. rubra）屬黎科（Chenopodiaceae）甜菜屬（Beta），是栽培甜菜的一個變種，又稱紫菜頭，俗稱牛皮菜，可生食、熟食或制成菜肴[1]。紅甜菜是歐洲和美洲國家的重要蔬菜之一，可以提取甜菜紅素，在馬來西亞、中國、日本、以色列和越南廣泛種植[2]。Ashwini等提出食品中的甜菜紅素既具有審美價值，又對健康有積極的影響[3]。甜菜紅素是一種甜菜苷紅色素，廣泛存在于莧科、藜科、紫茉莉科、商陸科等多種植物中，甜菜紅素屬于酮、醌類衍生物色素，是水溶性的天然食用紅色素，食用后不被代謝，無毒副作用，美國食品與藥物管理局對甜菜紅素作為食用色素的添加用量不作上限規(guī)定。Vidal[4]和Sawicki[5]等證實(shí)甜菜紅素具有抗炎、抗氧化能力和抗腫瘤活性。有研究報道，甜菜紅素可通過作用在線粒體途徑緩解百草枯對實(shí)驗(yàn)大鼠造成的肝損傷和肺損傷間質(zhì)性肺炎[6-7]。Farabegoli等通過研究發(fā)現(xiàn)甜菜紅素對Caco-2腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，提出可以利用甜菜紅素作為膳食成分，以減少和限制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[8]。郝秀梅等[9]研究了紅甜菜水提物及其色素的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，紅甜菜水提物及其色素有較強(qiáng)的抗氧化能力，且純化后的紅甜菜色素體外抗氧化能力更突出。王曉宇等[10]研究表明，甜菜紅苷能夠引起人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的凋亡，可能具有抗結(jié)腸癌和其他惡性腫瘤的效果。本研究利用DEAE-52纖維素提取、分離甜菜紅素，同時利用納濾和噴霧干燥技術(shù)制備甜菜紅素，進(jìn)行甜菜紅素體內(nèi)抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用研究，以期為今后開發(fā)紅甜菜作為功能保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

紅甜菜來源于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪農(nóng)場農(nóng)學(xué)院。

清潔級KM小鼠（雄性）、豚鼠均購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2016003）；K592細(xì)胞 中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心；綿羊紅細(xì)胞、印度墨汁 廣東洛孚生物科技有限公司。

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-2H-tetrazoliubromide，MTT）、刀豆素A（concanamycin A，ConA） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜-高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-high resolution mass/mass spectrometry，UPLC-HRMS/MS）系統(tǒng) 美國Thermo Fisher公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LZ-0.5榨汁破碎一體機(jī) 靖江食品機(jī)械有限公司；納濾機(jī) 廈門世達(dá)膜科技有限公司；OPD-8噴霧干燥儀 上海大川原儀器有限公司；酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；Shellab型醫(yī)用二氧化碳培養(yǎng)箱 美國希爾頓公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；AE-31數(shù)碼倒置顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜菜紅素的制備

紅甜菜粉碎→紗布過濾→取汁→DEAE-52纖維素吸附紅甜菜汁→填裝進(jìn)分離柱→體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸溶液洗滌→分離甜菜紅素→收集甜菜紅素

利用納濾膜進(jìn)行過濾濃縮，濃縮后的甜菜紅素的色價為1 150.5 mL－1。將濃縮汁利用噴霧干燥技術(shù)制備成干粉備用，干物質(zhì)得率為83%。

1.3.2 甜菜紅素UPLC-HRMS/MS分析

樣品處理：將濃縮的甜菜紅素液體經(jīng)0.22 μm膜過濾后用于分析測定。UPLC條件：色譜柱為Poroshell 120 SB-C18柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），柱溫為30 ℃；流動相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液（加0.005 mol/L醋酸銨）；B相為甲醇；流速為0.5 mL/min。洗脫梯度為：0～5.0 min，0% B；5.0～12.0 min，0%～10% B；12.0～25.0 min，10%～90% B；25.0～35.0 min，90% B；35.0～36.0 min，90%～0% B；36.0～40.0 min，0% B。MS條件：全掃描模式；正離子模式；分辨率：70 000；誘導(dǎo)解離能量：0 eV；掃描范圍：m/z250～800；檢測離子：m/z551。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥

小鼠的給藥劑量由實(shí)驗(yàn)室前期藥效學(xué)動物實(shí)驗(yàn)得出的灌胃劑量確定。選用200 只健康的小鼠，體質(zhì)量18～22 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)挑選40 只，每組10 只，用于抗氧化實(shí)驗(yàn)；其余160 只用于免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白組（灌胃0.25 mL/10 g生理鹽水）；將噴霧干燥后的甜菜紅素干粉用生理鹽水溶解，配制甜菜紅素高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）劑量組（以干物質(zhì)計）用于灌胃小鼠。每天早晨9∶00灌胃，連續(xù)灌胃15 d。

1.3.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)

于末次灌胃2 h后進(jìn)行眼眶采血，然后分離血清。各組小鼠血清中的GSH-Px、SOD活力及MDA濃度按試劑盒說明書方法測定。

1.3.5 免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 脾臟、胸腺指數(shù)及碳廓清能力的測定

末次灌胃2 h后，將稀釋4 倍體積的印度墨汁（10 mL/kg）從小鼠尾部靜脈注入，立即計時，分別在注入墨汁2 min和10 min時從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加入到2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% Na2CO3溶液中。在600 nm波長處測定OD值，以Na2CO3溶液作為空白對照。接著將小鼠斷頸脫臼致死，小心解剖取動物肝臟、脾臟和胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱質(zhì)量，計算胸腺和脾臟指數(shù)，按式（1）計算吞噬指數(shù)α以反映小鼠碳廓清能力。

1.3.5.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的測定

末次灌胃2 h后，將各組小鼠用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液消毒后，在無菌操作臺內(nèi)無菌取小鼠脾臟，將脾臟置于裝有冷的無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用1 mL無菌注射器吸取PBS，將針頭刺入脾臟內(nèi)反復(fù)用PBS吹打，直至脾臟薄如蟬翼狀并發(fā)白后停止，得到的液體即為淋巴細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)計數(shù)活細(xì)胞數(shù)后，再用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL，以1 mL/孔接種于24 孔板，同時用7.5 μg/mL ConA刺激（測試孔），以不加ConA作為非刺激孔（空白孔）。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h后，加入5 mg/mL MTT（50 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出；加入二甲基亞砜溶液600 μL，振蕩數(shù)次后于室溫暗處放置15 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度，以測試孔與空白孔OD值的差值表示脾淋巴細(xì)胞增殖能力。

1.3.5.3 血清溶血素水平的測定

豚鼠補(bǔ)體制備：取5 只豚鼠，以無菌操作采集血液，采集好的血液置于4 ℃冰箱過夜，次日離心分離血清即可分離到補(bǔ)體。取5 mL豚鼠血清加入1 mL壓積綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cells，SRBC），水平放置于4 ℃冰箱內(nèi)吸附30 min后離心取上清液，將上清液置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用半數(shù)溶血值（half hemolysis value，HC50）法測定各組小鼠的血清溶血素水平。末次灌胃2 h后，各組小鼠于腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SRBC懸液0.2 mL。正常飼喂4 d，然后采血并分離血清，將血清用無菌生理鹽水稀釋200 倍體積。取干凈試管，向其中依次加入稀釋后的血清1 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SRBC 0.5 mL和生理鹽水稀釋10 倍體積的補(bǔ)體1 mL，混合均勻，同時設(shè)定無血清管作為對照管，于37 ℃水浴30 min后，用冰水浴終止反應(yīng)。離心，取1 mL上清液與3 mL都氏試劑混合均勻，同時取0.25 mL 10% SRBC懸液加都氏試劑至4 mL，充分混勻作為半數(shù)溶血管。放置10 min后，以對照管為空白，測定各樣品管在540 nm波長處的OD值，按式（2）計算HC50。

1.3.5.4 NK細(xì)胞活性的測定

實(shí)驗(yàn)前將靶細(xì)胞K562進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，Hanks液洗滌2 次，計數(shù)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/mL。末次灌胃2 h后，每組小鼠中選取5 只，按照1.3.5.2節(jié)方法制備效應(yīng)細(xì)胞K592，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107個/mL后加入96 孔板，每孔100 μL。將靶細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＝50∶1）加入高、中、低劑量組實(shí)驗(yàn)孔，每孔100 μL；自然釋放孔加入100 μL培養(yǎng)液；最大釋放孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% NP40。37 ℃培養(yǎng)4 h，離心，取上清液100 μL置于96 孔酶標(biāo)板中，加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)8 min，以30 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定OD值。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活性按式（3）計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜紅素UPLC-HRMS/MS分析結(jié)果

采用UPLC-HRMS/MS對甜菜汁進(jìn)行全掃描后，提取m/z 551，在保留時間分別為9.38、11.17 min處檢測到2 個色譜峰（圖1）。保留時間為9.38 min時，對一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子峰進(jìn)行分析（圖2），結(jié)合文獻(xiàn)[11]對比，驗(yàn)證其為甜菜紅苷（C24H26N2O13）。保留時間為11.17 min的化合物結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

圖1 甜菜紅素的離子色譜圖（m/z 551）Fig. 1 Ion chromatogram of betalain (m/z 551)

圖2 甜菜紅苷的質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of betagin

2.2 甜菜紅素對小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA濃度的影響

表1 甜菜紅素對小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA濃度的影響Table 1 Effect of betalain on GSH-Px, SOD activity and MDA levels in serum of mice

從表1中可以看出，與空白組比較，甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠血清中的GSH-Px活力，其中，中劑量組效果最顯著（P＜0.01），高、低劑量組效果相對較差（P＜0.05）。高、中、低劑量組與空白組相比SOD活力均顯著提高，其中，中劑量組效果較好。與空白組相比，高、中劑量組均能顯著降低小鼠血清中MDA濃度（P＜0.05），但低劑量組沒有顯著性影響。

2.3 甜菜紅素對小鼠免疫器官臟器指數(shù)及碳廓清能力的影響

表2 甜菜紅素對小鼠免疫器官臟器指數(shù)及吞噬指數(shù)的影響Table 2 Effects of betalain on spleen and thymus indices and macrophage phagocytosis index in mice

從表2可以看出，與空白組比較，甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠胸腺指數(shù)，其中，中劑量組效果最好（P＜0.01），高、低劑量組效果相對較差（P＜0.05）；低劑量組小鼠脾臟指數(shù)無顯著變化，高、中劑量組均顯著提高（P＜0.05）；低劑量組吞噬指數(shù)無顯著變化，高、中劑量組均顯著提高（P＜0.05），且中劑量組效果更好。

2.4 甜菜紅素對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞活性、血清溶血素水平的影響

表3 甜菜紅素對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性、血清溶血素水平的影響Table 3 Effects of betalain on lymphocyte proliferation and NK cell activity as well as serum hemolysin in mice

從表3可以看出，與空白組比較，甜菜紅素各劑量組均能提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性和血清溶血素水平，其中高、中劑量組效果顯著（P＜0.05），低劑量組雖然高于空白組，但差異不顯著。本研究結(jié)果說明高、中劑量甜菜紅素能增強(qiáng)小鼠抗體生成能力。

3 討 論

免疫是一種機(jī)體識別“自己”、“非己”并排除異己物質(zhì)，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的生理功能，具有維持自身穩(wěn)定、免疫監(jiān)視和免疫防御的重要作用。免疫系統(tǒng)包括固有免疫和適應(yīng)性免疫，是人類對抗感染首要的防御系統(tǒng)。同時，它也是衡量人的健康和長壽的一個指標(biāo)。然而，壓力、疲勞、化療和輻射會引起免疫抑制[12]。

同時，一些巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖的有絲分裂活動與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生密切相關(guān)[13]。ROS的過度積累會對免疫細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響。比如，它們會通過氧化膜脂和加速GSH-Px的消耗影響細(xì)胞成分，最終導(dǎo)致氧化損傷和免疫抑制[14]。許多研究表明，天然食品中含有豐富的生物活性物質(zhì)，能夠中和ROS，從而保護(hù)生物體免受氧化損傷，增強(qiáng)免疫功能。近年來，由于甜菜紅素具有藥理活性，已經(jīng)引起了人們的更多關(guān)注。本研究在前期對甜菜紅素的提取及抗腫瘤作用研究[15-16]的基礎(chǔ)上，開展了甜菜紅素的體內(nèi)抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的研究。

適應(yīng)性免疫包括體液和細(xì)胞免疫，主要為依賴T、B淋巴細(xì)胞的免疫活動。研究外來抗原免疫后的抗體反應(yīng)是一種重要的免疫功能檢測方法[17]。利用SRBC免疫小鼠時，B淋巴細(xì)胞可以分泌產(chǎn)生溶血素，血清中溶血素的水平可以用來評價機(jī)體的體液免疫狀態(tài)。

T淋巴細(xì)胞的免疫功能活性可以通過其排除靶細(xì)胞、產(chǎn)生各種細(xì)胞因子以及增殖活動等指標(biāo)反映，進(jìn)而評價機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)。在本研究中，血清溶血素和利用ConA刺激的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可用于闡明甜菜紅素對適應(yīng)性免疫的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，高、中劑量甜菜紅素能顯著增加血清溶血素水平（P＜0.05），并顯著增強(qiáng)小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.05）。給KM小鼠灌胃甜菜紅素后，小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫水平均明顯提高，其中中劑量組效果最明顯。

SBRC作為抗原刺激T、B淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，需要巨噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞的共同作用。巨噬細(xì)胞表面有多種模式識別受體、細(xì)胞因子受體和調(diào)理性受體，具有直接殺傷胞內(nèi)寄生菌、加工處理提呈抗原[18]、啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答以及自身分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了甜菜紅素對KM小鼠碳廓清能力的影響，結(jié)果表明，中劑量甜菜紅素對小鼠吞噬能力的提高效果最好，高劑量組效果不及中劑量組，這種情況可能是因?yàn)榫奘杉?xì)胞在將抗原加工和提呈給T、B淋巴細(xì)胞的過程中，甜菜紅素劑量增加可能會下調(diào)巨噬細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響其對抗原加工處理的作用。

胸腺和脾臟是淋巴細(xì)胞分化、成熟和定居的場所，高、中劑量甜菜紅素能顯著提高胸腺和脾臟指數(shù)，說明甜菜紅素通過影響免疫器官指數(shù)影響淋巴細(xì)胞的作用，推測甜菜紅素能夠提高小鼠適應(yīng)性免疫功能。

除了適應(yīng)性免疫功能以外，固有免疫功能在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中同樣具有重要作用。NK細(xì)胞屬于固有免疫細(xì)胞，在固有免疫中扮演重要角色，NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時既不需要特異性抗體參與，又不需要抗原預(yù)先致敏淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞在抗腫瘤和抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，其活性的控制是通過NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)及靶細(xì)胞表面配體的呈現(xiàn)共同作用調(diào)節(jié)[19]。目前，K562細(xì)胞是常被用于評價NK細(xì)胞活性的靶細(xì)胞，本研究結(jié)果表明，與空白組比較，高、中劑量甜菜紅素能顯著提高NK細(xì)胞的活性（P＜0.05），說明甜菜紅素增加了NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性，進(jìn)一步說明甜菜紅素提高了小鼠的固有免疫水平。有研究表明，NK細(xì)胞不僅能夠識別、殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞，同時能夠調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞分泌趨化因子和細(xì)胞因子，比如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等[20]。因此，今后可以利用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定檢測甜菜紅素對這些細(xì)胞因子的作用，從而更全面地了解甜菜紅素對NK細(xì)胞活性的影響。

很多研究數(shù)據(jù)證明，氧化應(yīng)激機(jī)制在降低免疫系統(tǒng)的生理功能中有促進(jìn)作用[21]。免疫細(xì)胞和免疫器官對氧化應(yīng)激十分敏感[22]，同樣地，免疫反應(yīng)一般也會產(chǎn)生ROS，尤其是由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞刺激產(chǎn)生的“呼吸性爆裂”更明顯?？寡趸瘎┰谇宄齊OS中扮演了重要角色，其可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷和保持正常功能?？寡趸瘎w外和體內(nèi)免疫功能的有益作用已經(jīng)被證實(shí)。有研究報道，抗壞血酸的消耗能夠損害NK細(xì)胞的活性[23]。另有研究表明，N-乙酰半胱氨酸和VE能夠平衡免疫功能的改變[24]，這些研究均表明抗氧化作用與免疫作用密切相關(guān)。為了避免氧化應(yīng)激，多種抗氧化防御機(jī)制可有效消除ROS，在導(dǎo)致大分子氧化之前，抗氧化酶是最有效的防御機(jī)制之一，能中和ROS的主要酶有SOD、GSH-Px和過氧化氫酶。MDA是脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，其濃度反映了細(xì)胞膜受損害的程度[25]。有研究表明，提高輻射小鼠腦組織、血液及肝臟中SOD和GSH-Px的活性、降低MDA的含量，可以達(dá)到抗輻射作用[26]。另有研究表明，通過降低由輻射、噪聲引起的MDA濃度升高，提高血清SOD、GSH-Px活性，可以使造血器官脾臟和免疫器官胸腺的臟器指數(shù)增加[12,27-28]。這些研究結(jié)果說明抗氧化能力的提高可能會提高免疫功能，進(jìn)而提高機(jī)體對抗外界的應(yīng)激能力。本研究結(jié)果表明，甜菜紅素能顯著提高KM小鼠血清中SOD、GSH-Px活力，并顯著降低血清中MDA濃度，說明甜菜紅素對免疫調(diào)節(jié)作用的影響可能與其抗氧化活性有關(guān)。

綜上，甜菜紅素能明顯起到免疫調(diào)節(jié)的作用，同時，其抗氧化活性有助于增強(qiáng)小鼠的免疫作用。因此，甜菜紅素能夠有效地改善人體的健康和免疫功能。本研究結(jié)合甜菜紅素抗氧化及免疫功能，為開發(fā)甜菜紅素作為保健品并推向臨床應(yīng)用提供參考。