微流化對(duì)豆乳粉蛋白結(jié)構(gòu)及溶解性的影響

李 良，周 艷，王冬梅，樊金源，吳長玲，朱 穎，李 楊，江連洲，王中江,*，范志軍,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，黑龍江 佳木斯 154000；3.黑龍江省計(jì)算中心，黑龍江 哈爾濱 150028）

豆乳粉是在豆乳生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，將豆乳進(jìn)一步殺菌，添加甜味劑、乳化劑、食用香精（乳香型）、增味劑等食品添加劑，經(jīng)乳化、均質(zhì)、噴霧干燥再制成的速溶乳粉體。目前，濕法工藝是制備豆乳粉最常用的方法，其工藝過程一般包括黃豆浸泡、磨漿、濃縮調(diào)配及噴霧干燥[1]。豆乳粉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)及大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆卵磷脂等功能性成分，在溫水或涼水中就能迅速溶化，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的植物蛋白質(zhì)飲料，可以代替牛奶或其他奶制品，深受消費(fèi)者的喜愛[2]。但由于豆乳粉溶解性不高，氮溶解指數(shù)（70%～80%）低，在實(shí)際生產(chǎn)中存在沖調(diào)性差等問題，不僅影響了豆乳粉的食用性，而且阻礙了豆乳粉的推廣[3]。

動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)是一種新興的高壓加工技術(shù)，與傳統(tǒng)高壓均質(zhì)相比，其均質(zhì)壓力更高，碰撞能量更大，產(chǎn)品顆粒更細(xì)（破碎細(xì)度可達(dá)1 μm以下）[4]。微射流均質(zhì)過程中，高壓、強(qiáng)烈剪切、空穴爆炸、高頻振蕩等機(jī)械力的綜合作用導(dǎo)致物料分子發(fā)生顯著變化[5]。涂宗財(cái)?shù)萚6]研究發(fā)現(xiàn)微射流均質(zhì)可破壞大豆蛋白、花生蛋白的內(nèi)部基團(tuán)，使蛋白分子伸展，并使多項(xiàng)功能特性改善。萬紅霞等[7]研究了不同均質(zhì)壓力（40～200 MPa）對(duì)大米蛋白溶解性的影響，發(fā)現(xiàn)大米蛋白顆粒（分子）的結(jié)構(gòu)解聚、疏水基團(tuán)和極性基團(tuán)暴露及蛋白所帶電荷發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的水化作用增強(qiáng)，從而使大米蛋白的溶解性得到改善。同時(shí)，陳林等[8]的研究結(jié)果表明，微射流均質(zhì)可破壞蛋白聚集體和球蛋白分子高級(jí)結(jié)構(gòu)，有可能使被包埋的酶解位點(diǎn)暴露，提高蛋白的酶解敏感性。目前許多研究主要集中在在微射流均質(zhì)對(duì)蛋白功能特性的影響，但國內(nèi)外關(guān)于微射流均質(zhì)對(duì)豆乳粉蛋白結(jié)構(gòu)及溶解性影響的研究報(bào)道較少。

因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究微流化處理對(duì)豆乳粉蛋白結(jié)構(gòu)及溶解性的影響，并通過比較預(yù)處理前后豆乳粉蛋白結(jié)構(gòu)和溶解性的變化，探討改善豆乳粉溶解性能的機(jī)理。明晰該機(jī)理對(duì)提高豆乳粉溶解性能具有重要的理論和實(shí)踐意義，可為優(yōu)質(zhì)豆乳粉加工提供理論和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北大豆 哈爾濱品辰科技有限公司；Protex-6L堿性蛋白酶（1.0×105U/g） 丹麥novo公司；Tris試劑、甘氨酸試劑、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 北京索萊寶生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸 北京新光化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

WK2102型微波爐 廣東美的生活電器制造有限公司；0-40型阿貝折光儀 上海淋譽(yù)貿(mào)易有限公司；M-110EH30型高壓微射流均質(zhì)機(jī) 上海鯉躍精密機(jī)械貿(mào)易有限公司；JT-8000Y型離心式噴霧干燥器 杭州聚同電子有限公司；ATN-300型全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；JJ-1型恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)、UV-2600型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Bettersize2000型激光粒度分布儀 丹東市百特儀器有限公司；SU-8010型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 豆乳粉的制備

豆乳粉的制備流程：大豆→篩選→清洗→浸泡→熱燙→磨漿→過濾→微流化處理→限制性酶解→滅酶→濃縮→噴霧干燥→豆乳粉

豆乳粉的具體制備參考江連洲等[9]的方法，稱量50 g（精確至0.001 g）黃豆，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% NaHCO3溶液浸泡12 h，沸水熱燙5 min，按豆水比1∶7（m/V）加入弱堿水（pH 6.5～7.0、溫度90 ℃）磨漿，過濾除去漿渣，對(duì)豆?jié){進(jìn)行微流化處理（微流化處理壓力42.5、89.0、123.5 MPa和152.0 MPa），將微流化處理的豆乳pH值調(diào)節(jié)至8.6，在57 ℃溫度下進(jìn)行限制性酶（Protex-6L堿性蛋白酶）酶解1.7 h，然后在95℃下滅酶5 min，真空濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%左右，然后噴霧干燥（進(jìn)口溫度185 ℃、出口溫度85 ℃）得到豆乳粉樣品。對(duì)照組不進(jìn)行微流化處理，其他條件與上述一致。利用凱氏定氮法測定上述豆乳粉的總蛋白含量。

1.3.2 表面疏水性測定

使用ANS熒光探針法[10]測量豆乳粉中蛋白的表面疏水性，用福林-酚法測定低嘌呤脫脂豆?jié){中蛋白質(zhì)量濃度，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）逐步稀釋至蛋白質(zhì)量濃度在0.04～0.20 mg/mL之間。取2 mL不同質(zhì)量濃度稀釋樣品，在390 nm激發(fā)波長和470 nm發(fā)射波長條件下分別測定樣品的熒光強(qiáng)度（FI0）和樣品加入10 μL ANS溶液（8 mmol/L）后的熒光強(qiáng)度（FI1），F(xiàn)I1和FI0的差值即為FI，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)I為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始階段的直線斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。表面疏水性的計(jì)算見公式（1）。

式中：S0、S0C分別為處理組和對(duì)照組豆乳粉中蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.3 游離巰基含量的測定

參考王健等[11]的方法測定蛋白質(zhì)游離巰基含量，并稍作修改。吸取2 mL豆乳粉溶液（50 mg/mL），加入5 mL Tris-Gly緩沖液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L 甘氨酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）中，再加入0.100 mL Ellman試劑（0.01 mol/L），測定時(shí)溶液經(jīng)恒溫磁力攪拌混合后在25 ℃下保溫反應(yīng)15 min，用分光光度計(jì)測定其在412 nm波長處吸光度（A412nm）。以不加Ellman試劑的溶液作為對(duì)照。游離巰基含量的計(jì)算見公式（2）。

式中：A412nm表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度之差；D表示稀釋倍數(shù)；ρ表示樣品的蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.4 粒徑分布測定

噴霧干燥后豆乳粉樣品用激光粒度分布儀進(jìn)行粒子分布測定，測定參數(shù)為：樣品折射率為1.5，介質(zhì)的折射率為1.3，測定時(shí)折光率為10%～15%[12]。

1.3.5 蛋白分散指數(shù)測定

按照鐘芳等[13]的方法測定豆乳粉中蛋白分散指數(shù)。稱取1 g（精確至0.000 1 g）左右的噴霧干燥粉，溶解于200 mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢?.5 h后，將溶解液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，在4 ℃條件下10 000×g離心10 min，取上清液，在沉淀中加入10 mL蒸餾水混勻，隨后采用相同的方法離心并棄去沉淀，將上清液合并，按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》采用凱氏定氮法測定上清液粗蛋白含量。蛋白分散指數(shù)的計(jì)算見公式（3）。

1.3.6 溶解度測定

蒸餾水配質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的豆乳粉溶液，在室溫（25 ℃）下用磁力攪拌器混合一段時(shí)間后，取豆乳粉溶液，然后在4 ℃條件下5 000×g離心10 min，取上清液25 mL，于105 ℃烘干，按1.3.5節(jié)的方法測定上清液中蛋白含量，溶解度表示為上清液中蛋白含量（參照1.3.5節(jié)中方法計(jì)算）占豆乳粉溶液蛋白含量的比例[14]。溶解度的計(jì)算見式（4）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3 組平行，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微流化對(duì)豆乳粉表面疏水性的影響

圖1 微流化對(duì)豆乳粉的表面疏水性影響Fig. 1 Effect of high-pressure microfluidization on surface hydrophobicity of soymilk powder

微流化處理對(duì)豆乳粉中蛋白質(zhì)表面疏水性的影響見圖1。當(dāng)微射流壓力從0 MPa增加到123.5 MPa時(shí)，豆乳粉的表面疏水性逐漸增大。微流化處理壓力在123.5 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)表面疏水性達(dá)到最大值，提高至未處理樣品的1.6 倍，而且微流化處理樣品表面疏水性均高于對(duì)照樣品，推測可能是由于微流化處理的高剪切作用破壞了豆乳粉中的蛋白結(jié)構(gòu)。劉堅(jiān)等[15]認(rèn)為高剪切作用會(huì)逐漸破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水相互作用，使蛋白質(zhì)解折疊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部更多的疏水性區(qū)域暴露，從而增加蛋白質(zhì)的表面疏水性[16]。當(dāng)微流化處理壓力繼續(xù)增大（152.0 MPa）時(shí)，豆乳粉的相對(duì)表面疏水性降低，這可能是由于微射流壓力過大使蛋白質(zhì)分子間相互作用形成更多聚集體，導(dǎo)致表面疏水性下降[15]。Wang Xiansheng等[17]采用超高壓處理大豆分離蛋白時(shí)得到了相同的結(jié)論。

2.2 微流化對(duì)豆乳粉游離巰基含量的影響

圖2 微流化對(duì)豆乳粉游離巰基含量的影響Fig. 2 Effect of high-pressure microfluidization on free sulfhydryl content of soymilk powder

由圖2可見，當(dāng)微流化處理壓力在0～123.5 MPa時(shí)，隨著微流化處理壓力不斷增加，豆乳粉的游離巰基含量呈逐漸上升的趨勢，且豆乳粉中蛋白質(zhì)游離巰基含量均高于對(duì)照組。當(dāng)微射流壓力為123.5 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)游離巰基含量達(dá)到最大值（7.62 μmol/g），與未處理樣品相比增加了24.96%。鐘俊楨等[18]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)高壓微射流處理β態(tài)乳球蛋白能引起其二硫鍵斷裂增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，巰基游離到分子的表面，促使巰基含量上升。當(dāng)微流化處理壓力增大到152.0 MPa時(shí)，游離巰基含量下降，可能因?yàn)槭禽^大的微流化壓力導(dǎo)致變性的蛋白質(zhì)分子又發(fā)生了一定程度的聚集[19]。

2.3 微流化對(duì)豆乳粉粒徑分布的影響

激光粒度儀利用等效散射光能分布測定的顆粒大小及分布，能全面反映出樣品溶液中顆粒的粗細(xì)特性和均勻程度[20]。微流化處理對(duì)豆乳粉粒徑分布及平均粒徑的影響如圖3和表1所示，不同微射流壓力處理后樣品的體積平均粒徑和粒徑分布寬度均低于對(duì)照樣品。微射流處理壓力在0～123.5 MPa時(shí)，隨著壓力增加，體積平均粒徑減小，123.5 MPa時(shí)最低，且與其他組差異顯著（P＜0.05）。這可能是經(jīng)過微流化壓力處理后，強(qiáng)烈的撞擊過程中高剪切作用破壞蛋白質(zhì)緊密的有序結(jié)構(gòu)，使其破碎成更小的粒子[21]。但隨著微流化壓力進(jìn)一步加大（152.0 MPa），蛋白質(zhì)分子又重新聚合，導(dǎo)致體積平均粒徑增大[18]。

粒徑分布寬度可表征樣品粒徑的均勻程度，粒度分布越寬，表明樣品顆粒的粗細(xì)不均勻[20]。由表1可知，粒徑分布寬度均大于1.5，表明豆乳粉顆粒分布不均勻。微射流壓力123.5 MPa時(shí)豆乳粉粒徑分布寬度比42.5 MPa時(shí)有所降低，表明微流化（42.5～123.5 MPa）處理使溶液中蛋白質(zhì)顆粒分布更加均勻，故而使得溶液的分散性增強(qiáng)[22]。

圖3 微流化對(duì)豆乳粉粒徑分布的影響Fig. 3 Effect of high-pressure microfluidization on particle size distribution of soymilk powder

表1 微流化對(duì)豆乳粉粒徑的影響Table 1 Effect of high-pressure microfluidization on particle size of soymilk powder

2.4 微流化對(duì)豆乳粉的蛋白分散指數(shù)和溶解度的影響

溶解特性是噴霧干燥產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，是評(píng)價(jià)噴霧干燥產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)劣的基礎(chǔ)，蛋白分散指數(shù)和溶解度是判定溶解特性的重要因素。微流化處理壓力對(duì)豆乳粉的蛋白分散指數(shù)和溶解度的影響見圖4，當(dāng)微射流處理壓力在0～123.5 MPa時(shí)，隨著微流化壓力逐漸增加，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和溶解度均顯著增加（P＜0.05），當(dāng)微射流壓力為123.5 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)分散指數(shù)和溶解度均達(dá)到最大，分別為83.26%和79.47%。推測這種現(xiàn)象可能是由于微流化處理的高速剪切、高頻振蕩、空穴效應(yīng)和對(duì)流撞擊等機(jī)械力作用和相應(yīng)的熱效應(yīng)，誘使蛋白聚集物解聚，增加了蛋白分子的擴(kuò)散性，使蛋白質(zhì)分子的肽鏈或氨基酸側(cè)鏈與水分子發(fā)生水合作用，宏觀上主要表現(xiàn)為溶解性增加[22-23]；另一方面高壓動(dòng)態(tài)微射流處理使蛋白質(zhì)內(nèi)部的極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)暴露出來，蛋白質(zhì)分子表面電荷發(fā)生改變，使水化作用增強(qiáng)，以致蛋白質(zhì)分散指數(shù)提高[24]。但隨著微流化壓力繼續(xù)增加（152.0 MPa），蛋白質(zhì)分散指數(shù)和溶解度稍有降低（P＞0.05），樣品溶解度降低可能是因?yàn)槎谷榈鞍仔纬刹蝗苄跃酆衔颷25]。沈蘭等[26]發(fā)現(xiàn)高壓微流化微射流均質(zhì)壓力下，大量活性基團(tuán)暴露，使得蛋白質(zhì)分子間又相互形成新的化學(xué)鍵，導(dǎo)致溶解度變化不大甚至略有降低。Mao Xueying等[16]研究發(fā)現(xiàn)溶解度與表面疏水性沒有嚴(yán)格的關(guān)系，但當(dāng)樣品溶解度最高時(shí)其表面疏水性最高，本實(shí)驗(yàn)也出現(xiàn)了類似結(jié)果。

圖4 微流化對(duì)豆乳粉的蛋白分散指數(shù)和溶解度的影響Fig. 4 Effect of high-pressure microfluidization on protein dispersibility index and solubility of soymilk powder

3 結(jié) 論

經(jīng)微流化處理后，豆乳粉中蛋白質(zhì)的表面疏水性、游離巰基含量、蛋白分散指數(shù)及溶解度均發(fā)生了改變，且均高于未處理樣品，豆乳粉體積平均粒徑及粒徑分布寬度均低于未處理樣品。當(dāng)微流化壓力從0 MPa增加到123.5 MPa時(shí)，豆乳粉蛋白的表面疏水性、游離巰基含量、蛋白分散指數(shù)及溶解度逐漸增加。微流化處理破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水相互作用，蛋白質(zhì)分子解折疊，暴露出更多的疏水性基團(tuán)；高剪切作用也引起蛋白質(zhì)二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，巰基游離到分子的表面，同時(shí)將豆乳粉顆粒破碎成更小的粒子，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子與水分子發(fā)生水合作用，增加其溶解性。當(dāng)微流化為壓力152.0 MPa時(shí)，微流化處理產(chǎn)生的高壓及熱效應(yīng)會(huì)破壞維系蛋白聚合物之間的次級(jí)相互作用力，誘導(dǎo)豆乳粉蛋白中不溶性聚集物解聚，從而導(dǎo)致樣品的溶解度略有下降。