高壓均質(zhì)對(duì)脂質(zhì)體囊泡特性和穩(wěn)定性的影響

邰克東，趙蘇茂，楊紫恒，毛立科，高彥祥，袁 芳*

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

作為近年來發(fā)展迅速的功能活性成分傳遞載體，脂質(zhì)體在食品工業(yè)領(lǐng)域中的研究受到越來越多的關(guān)注。該載體以磷脂和膽固醇為主要壁材，通過磷脂分子在水相體系中的自組裝，形成與細(xì)胞膜類似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，包括由磷脂非極性尾部交聯(lián)組成的疏水性區(qū)域和磷脂極性頭部包圍形成的水相內(nèi)核，具有同時(shí)包埋脂溶性和水溶性活性物質(zhì)的能力，極大提高了活性物質(zhì)的傳遞效率[1-2]。此外，脂質(zhì)體還具有控釋緩釋[3]、良好的吸收性和生物相容性[4]以及毒性低[5]等一系列優(yōu)勢，在食品領(lǐng)域中已有包括類胡蘿卜素[6-7]、白藜蘆醇[8]、VC[9]、輔酶Q10[10]、花青素[11]等諸多功能活性成分的包埋應(yīng)用研究。由于磷脂易發(fā)生不可逆的氧化降解和脂質(zhì)體囊泡聚集沉降等現(xiàn)象，容易導(dǎo)致被包埋活性物質(zhì)的滲漏，極大限制了脂質(zhì)體在食品工業(yè)中的應(yīng)用。目前在藥劑學(xué)中有利用特殊分子材料對(duì)脂質(zhì)體膜表面的靶向修飾研究[12]，其提高了脂質(zhì)體的理化穩(wěn)定性，但由于較高的生產(chǎn)成本和材料安全性問題，該技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景不太理想。如何利用食品原料來提高脂質(zhì)體囊泡的穩(wěn)定性是目前食品脂質(zhì)體研究亟待解決的主要問題之一。

目前已有研究利用果膠[9]、蛋白質(zhì)[13]、殼聚糖[14]及其衍生物[15]等食品生物大分子物質(zhì)對(duì)脂質(zhì)體膜表面進(jìn)行修飾，從而提高其理化穩(wěn)定性。但新殼層材料的引入提高了食品脂質(zhì)體的生產(chǎn)成本，使得制備工藝也更加復(fù)雜，規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)容易因設(shè)備的限制導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不理想。膽固醇作為脂質(zhì)體制備常用的輔劑，通過嵌入磷脂雙分子層中來提高脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而對(duì)穩(wěn)定脂質(zhì)體具有重要作用[16-17]。我國居民膳食膽固醇參考攝入量為每天不超過300 mg，膽固醇與眾多人體心腦血管疾病密切相關(guān)，有研究已證實(shí)膳食膽固醇是否長期過量攝入對(duì)高膽固醇血癥的發(fā)生有重要影響[18]；因此如何控制脂質(zhì)體中膽固醇的用量，以期得到穩(wěn)定性良好且膽固醇相對(duì)含量偏低的脂質(zhì)體是本研究的主要目的。高壓均質(zhì)法作為乳劑傳遞體系常用的破碎乳化制備方法，可顯著降低乳劑液滴的平均粒徑，改善乳劑均一性，對(duì)提高乳劑的物理穩(wěn)定性有重要作用，目前已在工業(yè)化生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用；因此在工業(yè)化生產(chǎn)中利用高壓均質(zhì)法制備食品脂質(zhì)體具備實(shí)際應(yīng)用的可能。Chung等在研究高壓均質(zhì)法制備包埋有依芬普司的單一大豆卵磷脂脂質(zhì)體時(shí)，循環(huán)均質(zhì)3 次后，均質(zhì)次數(shù)對(duì)其粒徑和多分散指數(shù)（polydispersion index，PDI）的降低無顯著作用，100 MPa和150 MPa均質(zhì)得到的依芬普司脂質(zhì)體粒徑基本一致[19]。Guner等研究發(fā)現(xiàn)，無論是蛋黃磷脂還是大豆卵磷脂，在利用去離子水、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline ，PBS）和醋酸鹽緩沖液3 種不同的水化介質(zhì)制備脂質(zhì)體時(shí)，提高均質(zhì)壓力可有效降低脂質(zhì)體囊泡的粒徑[20]。

與上述不同的是，本研究利用高壓均質(zhì)法探究均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)以及膽固醇含量對(duì)含膽固醇脂質(zhì)體囊泡特性和穩(wěn)定性的影響。通過將平均粒徑、Zeta電位、PDI、離心物理穩(wěn)定性與磷脂膜和囊泡微結(jié)構(gòu)結(jié)果的綜合分析，明確利用合適的均質(zhì)參數(shù)和膽固醇用量來提高高壓均質(zhì)法制備的大豆卵磷脂脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性，以期為今后開發(fā)包埋有功能活性成分的高穩(wěn)定性食品脂質(zhì)體產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆卵磷脂（純度大于98%） 嘉吉亞太系統(tǒng)（北京）食品有限公司；芘（純度大于99%）、8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（純度大于95%）和1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）（純度98%）美國Sigma公司；膽固醇、三氯甲烷、無水甲醇、丙酮和二甲基亞砜（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；AR1140型分析天平 上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；Ultra-Turrax T25高速剪切儀 德國IKA公司；NS1001L2K型高壓均質(zhì)機(jī) 意大利Niro-Soavi公司；Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度儀 英國Malvern公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；LUMiSizer全功能穩(wěn)定性分析儀 德國LUM公司；3K15型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；F-7000型熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 高壓均質(zhì)法制備脂質(zhì)體

采用薄膜水化結(jié)合高壓均質(zhì)法制備脂質(zhì)體[19-20]。準(zhǔn)確稱取適量的大豆卵磷脂和膽固醇，用25 mL的三氯甲烷將其完全溶解，40 ℃條件下利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)除去三氯甲烷，待有機(jī)相在圓底燒瓶底部形成薄膜后加入100 mL PBS（0.05 mol/L、pH 7.0），利用超聲水浴將磷脂膜洗脫，制成粗脂質(zhì)體混懸液。利用高速剪切儀將粗脂質(zhì)體混懸液高速剪切分散1 min（10 000 r/min），最后經(jīng)由高壓均質(zhì)機(jī)分別在20～80 MPa條件下循環(huán)均質(zhì)1～6 次得到脂質(zhì)體制劑。

1.3.2 脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位測定

利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測定脂質(zhì)體囊泡的流體動(dòng)力學(xué)直徑、Zeta電位和PDI。為減少多散射光所造成的測量誤差，待測樣品用同樣濃度的PBS稀釋10 倍，測量時(shí)取適量稀釋后的樣品裝入聚苯乙烯比色皿中，折光系數(shù)設(shè)定為1.490，25 ℃下保溫平衡1 min，每個(gè)樣品平行測定3 次，記錄樣品的平均粒徑、Zeta電位和PDI[20]。

1.3.3 脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性測定

利用LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀，通過加速分層和量化沉淀、懸浮的方法考量脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性。參照Tan Chen等的方法[14]，取脂質(zhì)體樣品約0.8 mL，均勻注射至測試管底部，溫度設(shè)定為25 ℃，離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，光散射系數(shù)1.00，樣品透射光特征線每20 s記錄一次，總測定時(shí)長2 h。通過軟件繪制出不穩(wěn)定系數(shù)隨時(shí)間的變化曲線以表示樣品在高速離心過程中的失穩(wěn)狀態(tài)，不穩(wěn)定系數(shù)越大，變化越劇烈，說明樣品物理穩(wěn)定性越差。

1.3.4 不同因素對(duì)高壓均質(zhì)法制備脂質(zhì)體囊泡特性和穩(wěn)定性的影響

1.3.4.1 不同均質(zhì)壓力對(duì)脂質(zhì)體囊泡的影響

參考文獻(xiàn)[19,21]，準(zhǔn)確稱取1 g大豆卵磷脂和0.25 g膽固醇，按照1.3.1節(jié)中的方法制備脂質(zhì)體，均質(zhì)壓力分別為20、30、40、50、60、70、80 MPa，所有樣品均質(zhì)1 次，考察脂質(zhì)體囊泡的粒度特性和物理穩(wěn)定性。

1.3.4.2 不同均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體囊泡的影響

準(zhǔn)確稱取1 g大豆卵磷脂和0.25 g膽固醇，按照1.3.1節(jié)中的方法制備脂質(zhì)體，均質(zhì)壓力固定為50 MPa，樣品循環(huán)均質(zhì)1～6 次，考察脂質(zhì)體囊泡的粒度特性和物理穩(wěn)定性。

1.3.4.3 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)脂質(zhì)體囊泡的影響

準(zhǔn)確稱取1 g大豆卵磷脂和一定量的膽固醇，使得二者質(zhì)量比分別為2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，按照1.3.1節(jié)中的方法制備脂質(zhì)體，均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)分別為50 MPa和3 次，考察脂質(zhì)體囊泡的粒度特性和物理穩(wěn)定性。

1.3.5 熒光探針法分析脂質(zhì)體膜特性

1.3.5.1 脂質(zhì)體膜微極性的測定

采用芘熒光探針法研究脂質(zhì)體膜微極性[22]。取0.1 mL配制好的芘-丙酮溶液（2×10－3mol/L）加入到稀釋10 倍的5 mL脂質(zhì)體樣品中，4 ℃避光靜置12 h。25 ℃條件下于熒光分光光度計(jì)中測定樣品，激發(fā)波長338 nm，記錄350～450 nm發(fā)射波長范圍內(nèi)樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)電壓為450 V，狹縫寬度均為5 mm。在373 nm和385 nm波長處記錄芘特征熒光光譜第1個(gè)和第3個(gè)峰的熒光強(qiáng)度，分別記為I1和I3，并計(jì)算二者比值I1/I3，用以表征芘熒光探針在脂質(zhì)體膜內(nèi)部環(huán)境的微極性。

1.3.5.2 脂質(zhì)體膜表面疏水性的測定

采用ANS探針法研究脂質(zhì)體膜表面疏水性[23]。取0.1 mL配制好的ANS-PBS溶液（8×10－3mol/L ）加入到稀釋10 倍的5 mL脂質(zhì)體樣品中，避光靜置30 min。25 ℃條件下于熒光分光光度計(jì)中測定樣品，激發(fā)波長350 nm，記錄375～600 nm發(fā)射波長范圍內(nèi)樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)電壓為450 V，狹縫寬度均為5 mm。通過比較ANS在不同脂質(zhì)體樣品中的光譜峰強(qiáng)度變化，表征脂質(zhì)體膜表面疏水性強(qiáng)度。

1.3.5.3 脂質(zhì)體膜流動(dòng)性的測定

采用DPH探針法[24]研究脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性。取1 mL配制好的DPH-二甲基亞砜溶液（2×10－6mol/L）加入到稀釋10 倍體積的5 mL脂質(zhì)體樣品中，避光靜置60 min。25 ℃條件下于熒光分光光度計(jì)中測定樣品，設(shè)定激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長430 nm、激發(fā)電壓600 V、狹縫寬度均為5 mm，按照公式（1）、（2）計(jì)算熒光偏振度P。

式中：I0,0和I90,90代表兩個(gè)偏振器設(shè)定方向平行；I0,90和I90,0代表兩個(gè)偏振器設(shè)定方向垂直；G為光柵校正因子。

通過計(jì)算出偏振度P來表征脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性，偏振度P越大，脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性越小。

1.3.6 透射電子顯微鏡觀察高壓均質(zhì)法制備脂質(zhì)體的微觀形貌

利用PBS將脂質(zhì)體樣品稀釋至合適濃度，將稀釋樣品滴入銅網(wǎng)中，用磷鎢酸溶液染色，濾紙吸除多余的液體并在室溫下自然干燥銅網(wǎng)，用透射電子顯微鏡觀察脂質(zhì)體樣品。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，采用Origin 9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，運(yùn)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 均質(zhì)壓力對(duì)脂質(zhì)體粒度特性的影響

傳統(tǒng)薄膜水化法形成的脂質(zhì)體囊泡粒徑較大且均一性較差，長期放置易形成沉淀，因此降低粒徑的諸多方法成為薄膜水化法最常用的輔助制備手段，其中高壓均質(zhì)法作為常用的乳化均質(zhì)手段，既避免了超聲破碎法可能導(dǎo)致的制劑金屬殘留問題，又比常用的膜擠出器法在樣品處理量上有較大優(yōu)勢。

圖1 均質(zhì)壓力對(duì)脂質(zhì)體粒徑、Zeta電位（A）和PDI（B）的影響Fig. 1 Effect of homogenization pressure on vesicle size,zeta potential (A) and PDI (B) of liposomes

由圖1A可知，隨著均質(zhì)壓力的增大，脂質(zhì)體粒徑逐漸減小。當(dāng)均質(zhì)壓力大于50 MPa時(shí)，脂質(zhì)體的粒徑無明顯變化，粒徑基本維持在130～140 nm范圍內(nèi)。圖1B顯示，當(dāng)均質(zhì)壓力為30 MPa時(shí)，脂質(zhì)體平均粒徑和PDI均有所上升，說明此時(shí)脂質(zhì)體易產(chǎn)生囊泡破碎后又重新融合聚集的現(xiàn)象，導(dǎo)致較大脂質(zhì)體囊泡的產(chǎn)生。當(dāng)均質(zhì)壓力高于50 MPa時(shí)，體系PDI增大，說明脂質(zhì)體在經(jīng)過較高均質(zhì)壓力處理后，雖然平均粒徑仍有所降低，但過小脂質(zhì)體囊泡因表面張力過大而重新聚集融合，且脂質(zhì)體樣品因均質(zhì)作用，樣品溫度顯著升高，從而加速體系內(nèi)流動(dòng)性脂質(zhì)體囊泡的聚集現(xiàn)象，使脂質(zhì)體均一性變差，對(duì)脂質(zhì)體的長期貯藏有不利影響。均質(zhì)壓力對(duì)脂質(zhì)體的Zeta電位無顯著影響，所有脂質(zhì)體的Zeta電位均在－30～－35 mV范圍內(nèi)。劉會(huì)曉在對(duì)番茄紅素納米脂質(zhì)體的研究中發(fā)現(xiàn)，番茄紅素脂質(zhì)體的平均粒徑和PDI在均質(zhì)壓力為30～70 MPa范圍內(nèi)均隨均質(zhì)壓力的升高而逐漸降低，主要原因可能是番茄紅素的載入提高了脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而降低了脂質(zhì)體囊泡因溫度升高而產(chǎn)生的聚集現(xiàn)象[25]。Chung等在高壓均質(zhì)法制備陽離子聚合物包覆脂質(zhì)體的理化特性研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)均質(zhì)壓力高于100 MPa時(shí)，脂質(zhì)體囊泡粒徑無明顯變化，即高壓均質(zhì)的微通道剪切、撞擊和空穴效應(yīng)所產(chǎn)生的脂質(zhì)體分散作用降低[19]。

2.2 均質(zhì)壓力對(duì)脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性的影響

圖2 不同均質(zhì)壓力制備的脂質(zhì)體LUMiSizer樣品透光率圖譜（A）及不穩(wěn)定系數(shù)隨時(shí)間的變化曲線（B）Fig. 2 Effect of homogenization pressure on transmittance (A) and instability coefficient (B) of liposomes in LUMiSizer

圖2 A、B分別表示不同均質(zhì)壓力處理的脂質(zhì)體經(jīng)LUMiSizer快速穩(wěn)定性分析儀測試的樣品透光率圖譜以及不穩(wěn)定系數(shù)隨時(shí)間的變化曲線。從圖2A透光率圖譜中可以看出，20 MPa和30 MPa處理后的脂質(zhì)體經(jīng)高速離心2 h后，樣品整體的透光率均有所增大，且不穩(wěn)定系數(shù)隨時(shí)間的延長而顯著增大，說明脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性較差。其中30 MPa處理樣品離心前后的透光率變化最大，與其粒徑和PDI增大的結(jié)果一致，脂質(zhì)體因更容易發(fā)生聚集沉淀而導(dǎo)致物理穩(wěn)定性降低。均質(zhì)壓力高于40 MPa時(shí)，脂質(zhì)體樣品在離心過程中的透光率幾乎無明顯變化，且不穩(wěn)定系數(shù)的變化幅度也降低，說明脂質(zhì)體粒徑的降低對(duì)樣品物理穩(wěn)定性的提高有促進(jìn)作用。雖然在2.1節(jié)中當(dāng)均質(zhì)壓力高于50 MPa時(shí)，脂質(zhì)體PDI有所提高，但樣品整體物理穩(wěn)定性仍保持良好，證明脂質(zhì)體整體粒徑與樣品物理穩(wěn)定性有直接關(guān)系。Guner等在研究溶劑、均質(zhì)和貯藏條件對(duì)脂質(zhì)體影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，降低脂質(zhì)體的粒徑可提高其在室溫條件下的貯藏穩(wěn)定性[20]。

2.3 均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體粒度特性的影響

經(jīng)不同的均質(zhì)次數(shù)后脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位和PDI變化情況如圖3所示。在50 MPa均質(zhì)壓力下，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，脂質(zhì)體的平均粒徑逐漸降低。當(dāng)均質(zhì)次數(shù)超過4 次后，脂質(zhì)體的平均粒徑不再顯著降低，說明過多均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體粒度降低無明顯作用。同時(shí)，均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體的Zeta電位和PDI均無顯著影響。在保證脂質(zhì)體均質(zhì)效果的前提下，研究適當(dāng)均質(zhì)壓力（50 MPa）處理?xiàng)l件下均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體粒徑的影響，對(duì)降低工業(yè)化高壓均質(zhì)法生產(chǎn)脂質(zhì)體的能耗具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

圖3 均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體粒徑、Zeta電位（A）和PDI（B）的影響Fig. 3 Effect of homogenization cycles on vesicle sizes, zeta potential (A)and PDI (B) of liposomes

2.4 均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性的影響

圖4 不同均質(zhì)次數(shù)制備的脂質(zhì)體LUMiSizer樣品透光率圖譜（A）及不穩(wěn)定系數(shù)隨時(shí)間的變化曲線（B）Fig. 4 Effect of homogenization cycles on transmittance (A) and instability coefficient (B) of liposomes in LUMiSizer

由圖4可知，在考察不同均質(zhì)次數(shù)處理后脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn)，無高壓均質(zhì)處理的脂質(zhì)體，其在高速離心下的物理穩(wěn)定性極差，當(dāng)經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后，脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性顯著提高。但在50 MPa均質(zhì)壓力下，經(jīng)不同均質(zhì)次數(shù)形成的脂質(zhì)體，LUMiSizer圖譜中樣品各處的透光率無顯著變化，說明提高均質(zhì)次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性無顯著影響，與PDI無顯著性差異的結(jié)果相一致。綜合不同均質(zhì)壓力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)高壓均質(zhì)形成脂質(zhì)體的粒徑低于150 nm時(shí)，脂質(zhì)體樣品在離心過程中的物理穩(wěn)定性均無明顯差異。

2.5 m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)脂質(zhì)體粒度特性的影響

圖5 大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體粒徑、Zeta電位（A）和PDI（B）的影響Fig. 5 Effect of soybean lecithin/cholesterol ratio on vesicle sizes, zeta potential (A) and PDI (B) of liposomes

由圖5中可知，隨著大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比的提高，可導(dǎo)致脂質(zhì)體粒徑的顯著減小，主要是由于膽固醇的載入占據(jù)了脂質(zhì)體磷脂膜中的空間，使磷脂膜厚度增大，從而影響了脂質(zhì)體整體粒徑的大小，這與Abe等的研究結(jié)果保持一致[26]。Zeta電位絕對(duì)值隨著大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比的降低而增大，可能是脂質(zhì)體膜中膽固醇相對(duì)含量的提高使帶電磷脂在脂質(zhì)體膜表面暴露程度提高，從而使脂質(zhì)體表面的負(fù)電荷增多。范明輝等在研究紅景天苷脂質(zhì)體時(shí)將這一現(xiàn)象歸因于膽固醇的極性頭部在脂質(zhì)體膜表面易與膽堿結(jié)合，將膽堿基團(tuán)拉向膜內(nèi)，從而增強(qiáng)膜表面的負(fù)電效應(yīng)[27]。還有研究認(rèn)為，由于膽固醇的載入使磷脂分子極性頭部間的距離增大，減少了脂質(zhì)體膜表面的單位面積結(jié)合位點(diǎn)，降低了反離子與其結(jié)合的可能性，從而使脂質(zhì)體膜表面的負(fù)電荷特性增強(qiáng)[28]。隨著膽固醇相對(duì)含量的提高，脂質(zhì)體的PDI卻無顯著變化，說明膽固醇的乳化特性對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。

2.6 m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性的影響

圖6 不同大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比的脂質(zhì)體LUMiSizer樣品透光率圖譜（A）及不穩(wěn)定系數(shù)隨時(shí)間的變化曲線（B）Fig. 6 Effect of soybean lecithin/cholesterol ratio on transmittance (A)and instability coefficient (B) of liposomes in LUMiSizer

由圖6可知，m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）＝2∶1脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性最差，說明過多膽固醇的載入不利于高壓均質(zhì)后脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性的提高。從不穩(wěn)定系數(shù)曲線中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）從10∶1降低至3∶1時(shí)，曲線變化的斜率逐漸降低，說明適當(dāng)提高磷脂膜中膽固醇的相對(duì)含量對(duì)高壓均質(zhì)脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性的提高有促進(jìn)作用。

2.7 m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)脂質(zhì)體膜特性的影響

圖7 m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)脂質(zhì)體膜特性的影響Fig. 7 Effect of soybean lecithin/cholesterol ratio on membrane characteristics of liposomes

芘作為一種易進(jìn)入磷脂雙分子層中的脂溶性熒光探針，可被用來研究脂質(zhì)體膜內(nèi)的微極性環(huán)境。由于脂質(zhì)體膜是由磷脂分子通過疏水相互作用自發(fā)形成的分子有序組合體，其主要驅(qū)動(dòng)力是盡可能減少磷脂疏水性尾部與水相環(huán)境的接觸。當(dāng)磷脂膜結(jié)構(gòu)越致密時(shí)，內(nèi)部疏水性越高，載入其中的芘探針周圍環(huán)境的微極性越低。由圖7A可知，隨著m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）降低，芘探針熒光峰I1/I3總體逐漸降低，說明脂質(zhì)體膜內(nèi)微極性逐漸降低，膜結(jié)構(gòu)緊密性有所提高。當(dāng)m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）＝10∶1～6∶1時(shí)，膽固醇含量提高使芘的微極性有所增大，可能是少量膽固醇的載入對(duì)脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)緊密性產(chǎn)生不利影響，隨著膽固醇含量的繼續(xù)提高，膜結(jié)構(gòu)因膽固醇的骨架效應(yīng)，分子間排列緊密性顯著提高。

ANS在水相環(huán)境中幾乎無熒光強(qiáng)度，與磷脂膜結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。由于ANS只吸附于脂質(zhì)體膜和水相環(huán)境的交界面，與磷脂膜表面暴露的疏水區(qū)域結(jié)合，可間接反映脂質(zhì)體膜表面的結(jié)構(gòu)變化。由圖7B可知，隨著m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）的降低，ANS的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說明脂質(zhì)體膜上可與ANS結(jié)合的疏水區(qū)域逐漸減少，磷脂極性頭部所組成的膜表面結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有所提高。

DPH作為一種疏水性極強(qiáng)的熒光探針，因其結(jié)構(gòu)近似桿狀，可與磷脂分子在膜中平行排列，可用來研究脂質(zhì)體磷脂膜的流動(dòng)性。當(dāng)DPH因磷脂膜的流動(dòng)性產(chǎn)生不同程度的傾斜時(shí)，經(jīng)熒光激發(fā)可產(chǎn)生水平和垂直方向不同的偏振分量，并通過計(jì)算從而反映脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性。由圖7C可知，隨著m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）的降低，熒光偏振度逐漸增大，說明DPH在磷脂膜內(nèi)的運(yùn)動(dòng)逐漸受到限制，脂質(zhì)體磷脂膜的流動(dòng)性逐漸降低。通過上述3 種熒光探針對(duì)脂質(zhì)體磷脂膜不同區(qū)域的熒光標(biāo)記分析可知，膽固醇載入量的增大提高了經(jīng)高壓均質(zhì)形成的脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對(duì)物理穩(wěn)定性的提高有促進(jìn)作用。綜合脂質(zhì)體粒度特性和物理穩(wěn)定性結(jié)果，當(dāng)m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）＝3∶1時(shí)，經(jīng)高壓均質(zhì)（50 MPa均質(zhì)3 次）的空載脂質(zhì)體的穩(wěn)定性最好，且由于其穩(wěn)定的囊泡結(jié)構(gòu)，在包埋功能活性物質(zhì)上具有良好的潛質(zhì)。

2.8 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）脂質(zhì)體微觀結(jié)構(gòu)觀察

圖8 不同大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比的脂質(zhì)體透射電子顯微鏡微觀形貌Fig. 8 Transmission electron micrographs of liposomes with different soybean lecithin/cholesterol mass ratios

由圖8可以看出，不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）的脂質(zhì)體均呈規(guī)則球形囊泡結(jié)構(gòu)，說明高壓均質(zhì)法對(duì)含膽固醇脂質(zhì)體樣品的制備具有良好效果。隨著m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）的降低，脂質(zhì)體囊泡變大，與平均粒徑的變化結(jié)果相一致。

3 結(jié) 論

通過高壓均質(zhì)法對(duì)傳統(tǒng)薄膜水化法形成的粗脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì)處理，增加均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)可顯著降低脂質(zhì)體囊泡的粒徑并提高脂質(zhì)體的離心物理穩(wěn)定性，但均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)分別高于50 MPa和3 次后，脂質(zhì)體囊泡粒度的降低以及其物理穩(wěn)定性的提高效果不再顯著，甚至當(dāng)均質(zhì)壓力大于50 MPa時(shí)，PDI有所增大，說明脂質(zhì)體囊泡的均勻性變差。膽固醇的載入可提高脂質(zhì)體膜微結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，但脂質(zhì)體粒徑隨著膽固醇載入量的提高而顯著增大。當(dāng)m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）＝2∶1時(shí)，脂質(zhì)體的離心物理穩(wěn)定性最差，說明在高壓均質(zhì)過程中，過高膽固醇的載入不利于脂質(zhì)體離心物理穩(wěn)定性的提高，而適量膽固醇的載入對(duì)其物理穩(wěn)定性無顯著影響，所形成的脂質(zhì)體均呈球形囊泡結(jié)構(gòu)。綜上所述，m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）＝3∶1對(duì)未來利用高壓均質(zhì)法制備包埋有活性物質(zhì)的脂質(zhì)體在提高樣品穩(wěn)定性上有一定的參考價(jià)值。