植物乳桿菌B02012對(duì)酸面團(tuán)小麥蛋白結(jié)構(gòu)和免疫特性的影響

廖 蘭，文曉艷，陳林萍，張風(fēng)麗，林維杰，楊彥紅，陳雪芹，張連岳，倪 莉*

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

乳酸菌是食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛的一類益生菌。在老酵頭和酸面團(tuán)等傳統(tǒng)發(fā)酵劑中，包含20余種酵母菌、50余種乳酸菌，主要以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）等為優(yōu)勢菌種[1-4]。乳酸菌主要作用于糖類和蛋白質(zhì)降解，產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸以及小肽和游離氨基酸[5-6]。它在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中對(duì)提高面團(tuán)風(fēng)味、營養(yǎng)價(jià)值、抗菌性及改善面團(tuán)流變學(xué)特性至關(guān)重要。此外，乳酸菌發(fā)酵可以減少乳糜瀉人群對(duì)小麥面制品的致敏性[7-8]。乳糜瀉是基因易感人群因攝入來自小麥、大麥、黑麥和衍生食品中的麩質(zhì)而誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性腸炎疾病[9]。麥醇溶蛋白是乳糜瀉免疫反應(yīng)的主要抗原蛋白[10]，富含大量谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），難以被人體完全消化吸收。目前，加入乳酸菌長時(shí)（＞24 h）發(fā)酵酸面團(tuán)降敏策略得到業(yè)界的認(rèn)同，可對(duì)面團(tuán)整體發(fā)揮降敏作用，被認(rèn)為是一種安全無害、便捷有效的降敏方法，已應(yīng)用于無麩質(zhì)食品研制中并備受關(guān)注[11-13]。

不同種類的乳酸菌在面團(tuán)發(fā)酵期間產(chǎn)生一系列特殊的蛋白水解酶，例如氨肽酶、羧肽酶和內(nèi)肽酶等可以水解富含脯氨酸等肽段，消除致敏性表位，降低小麥面制品對(duì)乳糜瀉人群的致敏性[14]。植物乳桿菌是酸面團(tuán)中最具競爭力的菌種[15]，Rollán[16]、Gerez[17]等從自然酸面團(tuán)中分離的植物乳桿菌CRL759和CRL778能夠水解α-醇溶蛋白中的致乳糜瀉肽段p31～43和p62～75；舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）7A、LS3、LS10、LS19、LS23、LS38、LS47、短乳桿菌14G、消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）15M和希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）51B等多種乳桿菌先后被報(bào)道用于長時(shí)發(fā)酵制備酸面團(tuán)，降低了小麥蛋白致敏性和炎癥因子表達(dá)[18-19]。

本研究以與麥醇溶蛋白降敏程度顯著相關(guān)的產(chǎn)酸速率、酸化性能和蛋白質(zhì)水解度為依據(jù)，篩選出具有相似表現(xiàn)的兩株乳酸菌——植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998制備長時(shí)發(fā)酵面團(tuán)，其中植物乳桿菌B02012由本實(shí)驗(yàn)室前期紫外誘變獲得，具有高產(chǎn)酸和耐消化的特點(diǎn)，可作為一種乳酸菌制劑廣泛應(yīng)用于微生態(tài)制劑中。同時(shí)，以可食性有機(jī)酸脫酰胺降敏小麥蛋白制備的發(fā)酵面團(tuán)（化學(xué)酸化面團(tuán)）和傳統(tǒng)酵母菌長時(shí)發(fā)酵面團(tuán)為對(duì)照，探究兩株乳桿菌長時(shí)發(fā)酵對(duì)酸面團(tuán)麥醇溶蛋白二、三級(jí)分子結(jié)構(gòu)和免疫特性的影響及其相關(guān)性，以期初步篩選出可應(yīng)用于開發(fā)低敏面食品的優(yōu)勢乳酸菌。本研究可為揭示乳酸菌發(fā)酵面團(tuán)降敏機(jī)理提供一定理論依據(jù)，對(duì)于初步構(gòu)建低敏長時(shí)發(fā)酵酸面團(tuán)工業(yè)化生產(chǎn)體系有著重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌B02012由實(shí)驗(yàn)室自主誘變篩選后貯藏；消化乳桿菌20998 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；酵母菌 安琪酵母股份有限公司；周麥28 河南周園種業(yè)有限公司。

一抗Wheat Gliadin 武漢華美生物工程有限公司；二抗免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、BCA試劑盒上海貝博生物公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD5-3真空冷凍干燥機(jī) 美國西蒙國際公司；Nikon-E100顯微鏡 日本Nikon公司；PHS-3C pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DYCZ-24DN電泳儀北京六一儀器廠；JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；8210E傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國尼高力儀器公司；FluoroMax-4熒光分光光度計(jì)法國HORIBA Jobin Yvon公司；MULTIAKAMK3酶標(biāo)儀芬蘭雷勃集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌生長曲線和pH值變化曲線的測定

取植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液，按照體積比1∶100的接種量接種于3 瓶MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、21、24 h取菌液5 mL，在600 nm波長處測定各菌液光密度值（OD600nm）。以各時(shí)間點(diǎn)菌液OD600nm為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制乳酸菌生長曲線。同樣條件下，采用pH計(jì)測定pH值，以各時(shí)間點(diǎn)菌液的pH值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制乳酸菌生長期間pH值變化曲線。

1.3.2 乳酸菌活化及酸面團(tuán)制備

乳酸菌的活化：參照王金水等[20]的方法并適當(dāng)修改。無菌條件下分別取植物乳桿菌B02012、消化乳桿菌20998菌液，接入MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃、pH 6.8條件下培養(yǎng)24 h使乳酸菌活化。當(dāng)用于面團(tuán)發(fā)酵時(shí)，將活化的乳酸菌于37 ℃、pH 6.8條件下培養(yǎng)約14 h，再以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量轉(zhuǎn)接到75 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)20 h，直至后期指數(shù)生長到成熟階段（約OD600nm＝2.3），菌體密度達(dá)到109CFU/mL。

酸面團(tuán)的制備：取6 g小麥面粉、6 mL蒸餾水、1.1%的酵母菌（以小麥面粉質(zhì)量計(jì)，后同）和/或8 mL乳酸菌懸浮液（菌體密度109CFU/mL），按以下方案混合得20 g面團(tuán)，于37 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵24 h后，冷凍干燥備用。各菌種發(fā)酵面團(tuán)具體為：1）CK組：面團(tuán)中不添加接種菌，添加0.05 mg/g紅霉素；2）SY組：面團(tuán)中只添加1.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的酵母菌；3）SCA組：面團(tuán)中不添加接種菌，采用乳酸和乙酸（物質(zhì)的量比為4∶1）的混合物化學(xué)酸化至pH 3.9；4）SLB02012組：面團(tuán)中只添加植物乳桿菌B02012懸浮液；5）SYLB02012組：面團(tuán)中添加1.1%的酵母菌和植物乳桿菌B02012懸浮液；6）SL20998組：面團(tuán)中只添加消化乳桿菌20998懸浮液；7）SYL20998組：面團(tuán)中添加1.1%的酵母菌和消化乳桿菌20998懸浮液。將上述各組發(fā)酵0 h和24 h的面團(tuán)冷凍干燥，磨粉備用。

1.3.3 發(fā)酵過程中面團(tuán)pH值的測定

按照上述方法制備酸面團(tuán)，各組面團(tuán)分別于發(fā)酵0、3、6、9、12、15、18、21、24 h取樣1 g，均勻分散于3 mL水中，采用pH計(jì)測定發(fā)酵面團(tuán)的pH值。

1.3.4 麥醇溶蛋白的提取

將面團(tuán)等分試樣（每份12.75 g）用30 mL 50 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.8）溶液稀釋，4 ℃條件下每15 min漩渦混合1 次，每次持續(xù)1 h，20 000×g下離心20 min。蒸餾水洗滌去除緩沖液離子，沉淀物懸浮于30 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液中，25 ℃下攪拌2 h，按上述條件進(jìn)行離心。所得上清液即為麥醇溶蛋白，冷凍干燥保存。發(fā)酵面團(tuán)中提取的麥醇溶蛋白簡寫為CK、SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998（同1.3.2節(jié)）。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)Laemmli[21]的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），并略作改動(dòng)。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠。取發(fā)酵0 h和24 h的冷凍干燥面團(tuán)粉末于2 mL離心管中，加入pH 6.8、0.0625 mol/L Tris-HCl溶液，用體積分?jǐn)?shù)5% β-巰基乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SDS、體積分?jǐn)?shù)10%丙三醇和體積分?jǐn)?shù)0.002%溴酚藍(lán)組成的緩沖液配制2 mg/mL蛋白溶液，煮沸5 min。取10 μL上清液進(jìn)樣，電泳結(jié)束后凝膠染色及脫色，于凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

參照Wang Yu等[22]的方法進(jìn)行FTIR測定。將各麥醇溶蛋白樣品和溴化鉀以質(zhì)量比1∶100進(jìn)行研磨，壓成1～2 cm薄片。全波長掃描（4 000～400 cm－1），每個(gè)光譜的掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm－1。用Omnic和PeakFit v4.12軟件計(jì)算酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）峰面積比例，分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.7 內(nèi)源性熒光光譜測定

參照Wang Kaiqiang等[23]的方法進(jìn)行內(nèi)源性熒光光譜（intrinsic fluorescence scanning，IFS）測定。采用0.01 mol/L、pH 4.4的磷酸鹽緩沖液配制得到30 mL 0.2 mg/mL麥醇溶蛋白樣品溶液。于280 nm波長處激發(fā)，發(fā)射波長在300～400 nm范圍內(nèi)記錄光譜，發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度均為5 nm。

1.3.8 酶聯(lián)免疫吸附測定分析

參照宋宏新[24]、Dupont-Deshorgue等[25]的方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），并略作修改。1）抗原包被：將麥醇溶蛋白樣品用碳酸鹽緩沖液（0.015 mol/L碳酸鈉和0.027 mol/L碳酸氫鈉）稀釋至10 μg/mL。各取100 μL/孔加入96 孔酶標(biāo)板中，4 ℃過夜；2）洗滌：次日傾去酶標(biāo)板96 孔板內(nèi)的包被液，用磷酸鹽-吐溫緩沖液（phosphate buffered saline-Tween-20，PBST）洗板3 次；3）封閉：加入3%～55%的脫脂牛乳封閉液封阻，200 μL/孔，37 ℃封閉1 h，洗板；4）一抗孵育：根據(jù)前期探索的最佳稀釋度，采用1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）＋PBST按體積比1∶1 000稀釋一抗，將稀釋后的一抗以100 μL/孔加入96 孔酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h；5）采用1% BSA＋PBST按體積比1∶2 500稀釋二抗，將稀釋后的二抗以100 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h；6）四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色：棄酶標(biāo)二抗，將TMB底物A、B等體積混合均勻，100 μL/孔，37 ℃恒溫箱中避光反應(yīng)15 min；7）終止顯色：加入1 mol/L HCl終止液，100 μL/孔，終止顯色反應(yīng)，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次平行實(shí)驗(yàn)計(jì)算所得平均值。結(jié)果應(yīng)用SPSS軟件中最小顯著性差異多維分析法進(jìn)行方差和顯著性分析（P＜0.05）。使用數(shù)據(jù)軟件XL-Stat（2016）進(jìn)行聚類分析，以對(duì)麥醇溶蛋白二、三級(jí)分子結(jié)構(gòu)和免疫特性數(shù)據(jù)歸類，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998的生長曲線和pH值變化曲線

圖1 植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998的生長曲線（A）和pH值變化曲線（B）Fig. 1 Growth curves (A) and pH curves (B) of Lactobacillus plantarum B02012 and Lactobacillus alimentarius 20998

由圖1可知，植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998兩株菌的生長曲線和pH值變化趨勢相似。0～2 h為乳酸菌生長延滯期，此時(shí)乳酸菌正在復(fù)蘇；4～15 h為對(duì)數(shù)生長期，乳酸菌呈指數(shù)型生長，大量繁殖；15～24 h為穩(wěn)定期，由于營養(yǎng)物質(zhì)不足，乳酸菌的生長和死亡處于動(dòng)態(tài)平衡。因此，兩株乳桿菌用于酸面團(tuán)發(fā)酵的最佳收獲時(shí)間為20 h左右。從pH值變化情況來看，植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998在生長24 h內(nèi)pH值降低，且pH值下降趨勢與乳酸菌生長曲線相符合，乳酸菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)pH值下降迅速，24 h后兩株菌的pH值均為3.6左右。

2.2 發(fā)酵過程中面團(tuán)pH值變化

圖2 面團(tuán)發(fā)酵過程中pH值變化Fig. 2 Changes in pH during dough fermentation

由圖2可知，添加植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998面團(tuán)的pH值變化趨勢接近，SLB02012、SYLB02012、SL20998和SYL20998組面團(tuán)的pH值隨著發(fā)酵的進(jìn)行開始迅速降低，發(fā)酵9 h后趨于平緩。此外，SLB02012、SL20998組面團(tuán)的pH值最終至3.0，發(fā)酵6 h后始終低于SYLB02012和SYL20998組。CK和SCA組面團(tuán)pH值在發(fā)酵過程中變化較小。面團(tuán)SY的pH值在發(fā)酵前期緩慢降低，穩(wěn)定在pH 5左右，當(dāng)發(fā)酵16 h后pH值由5快速降低至約3.5。以上結(jié)果說明，乳酸菌在面團(tuán)發(fā)酵期間對(duì)pH值的變化起到主導(dǎo)作用，相對(duì)于酵母菌產(chǎn)酸速率更快。這是由于乳酸菌一方面可以產(chǎn)生以乳酸為主的有機(jī)酸，使面團(tuán)快速酸化，pH值下降；另一方面較低的pH值可以促進(jìn)溶解酸溶化合物。王金水等[8]在研究乳酸菌對(duì)發(fā)酵酸面團(tuán)pH值的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，植物乳酸菌M616發(fā)酵期間可將面團(tuán)的pH值從6.0降低至3.73，相比之下，植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998酸化能力更強(qiáng)，酸化對(duì)于面團(tuán)的風(fēng)味至關(guān)重要。

2.3 全蛋白的SDS-PAGE變化

由圖3A可知，面團(tuán)在發(fā)酵0 h時(shí)CK、SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998組的全蛋白亞基條帶保持完好，說明此時(shí)蛋白質(zhì)還未開始水解。與發(fā)酵0 h相比，面團(tuán)發(fā)酵24 h（圖3B）變化較為明顯，部分高分子質(zhì)量麥谷蛋白（high molecular weight glutenin subunits，HMW-GS）和麥醇溶蛋白條帶明顯變淺。CK組在整個(gè)發(fā)酵過程中各蛋白質(zhì)條帶無明顯變化，SY和SCA組面團(tuán)中HMW-GS和部分麥醇溶蛋白條帶變淡。SCA組面團(tuán)中可食性有機(jī)酸會(huì)電離產(chǎn)生H＋，作為催化劑對(duì)小麥蛋白進(jìn)行脫酰胺改性，導(dǎo)致蛋白肽鏈的斷裂和酰胺鍵水解反應(yīng)，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)發(fā)生部分降解[26]。2 種乳桿菌發(fā)酵面團(tuán)的蛋白質(zhì)條帶較其他組變化顯著。SL20998和SYL20998組面團(tuán)，分子質(zhì)量在66.2 kDa以上的條帶幾乎完全解離，而50 kDa左右的低分子質(zhì)量亞基條帶和35 kDa處的條帶保持較好。植物乳桿菌B02012降解蛋白質(zhì)能力大于消化乳桿菌20998，因此SLB02012、SYLB02012組面團(tuán)在50 kDa左右及低分子質(zhì)量麥醇溶蛋白的條帶變淡，且SLB02012中的蛋白質(zhì)條帶相比SYLB02012更淡，這可能是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的酸性環(huán)境在一定程度上抑制了酵母菌的生長，酵母菌同其競爭營養(yǎng)物質(zhì)也影響了乳酸菌的生長[27]。小麥面粉中的蛋白酶主要是天冬氨酸蛋白酶及羧肽酶，它們?cè)谒嵝詶l件下活力較強(qiáng)，由圖1、2可知，乳酸菌生長發(fā)酵過程中pH值下降，這為蛋白酶的最大活力提供了適宜條件，促進(jìn)了蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解[28]；同時(shí)，乳酸菌中復(fù)雜的酶系對(duì)蛋白質(zhì)也有降解作用，由于乳酸菌酶系的差異，各樣品蛋白質(zhì)降解程度表現(xiàn)不同。

圖3 酸面團(tuán)發(fā)酵0 h（A）和24 h（B）后小麥總蛋白條帶變化Fig. 3 SDS-PAGE of whole wheat proteins in sourdough after fermentation for 0 h (A) and 24 h (B)

2.4 麥醇溶蛋白的FTIR分析結(jié)果

為進(jìn)一步研究乳酸菌發(fā)酵面團(tuán)對(duì)麥醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，利用FTIR對(duì)從發(fā)酵24 h面團(tuán)中提取的麥醇溶蛋白進(jìn)行測定。前人研究表明，3 200～3 600 cm－1代表—OH的伸縮振動(dòng)，而2 800～3 000 cm－1代表—CH的伸縮振動(dòng)。酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）主要為C＝O的伸縮振動(dòng)，用來表征麥醇溶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，5 個(gè)峰位置對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，1 604.5、1 625.7、1 693.2 cm－13 個(gè)峰代表β-折疊，1 658.6 cm－1和1 679.7 cm－1分別代表α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角[29]，結(jié)果如表1所示。

圖4 發(fā)酵24 h酸面團(tuán)中麥醇溶蛋白的FTIR圖Fig. 4 FTIR spectra of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

表1 發(fā)酵24 h酸面團(tuán)中麥醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structures of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

由圖4可知，經(jīng)長時(shí)發(fā)酵處理后，蛋白質(zhì)分子的很多特征吸收峰都發(fā)生了偏移。CK的—OH伸縮振動(dòng)特征吸收峰為3 421.15 cm－1，而SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998特征峰發(fā)生偏移，SLB02012和SYLB02012移動(dòng)范圍分別為109 cm－1和112 cm－1，說明植物乳酸桿菌B02012對(duì)蛋白質(zhì)中—OH影響顯著，這可能是其發(fā)酵過程中對(duì)氫鍵的作用所導(dǎo)致。SLB02012的—CH伸縮振動(dòng)特征吸收峰從2 924.47 cm－1偏移到2 929.15 cm－1。與SL20998相比，SCA、SLB02012在酰胺I帶振動(dòng)強(qiáng)度較大，表明可食性有機(jī)酸酸化和植物乳酸桿菌B02012發(fā)酵面團(tuán)中麥醇溶蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生了變化，相比消化乳酸桿菌20998更能促進(jìn)麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)中的酰胺I帶伸縮振動(dòng)。此外，SLB02012、SL20998相比SYLB02012和SYL20998在酰胺I帶振動(dòng)強(qiáng)度更大，說明加入酵母菌后能夠減少2 種乳桿菌對(duì)麥醇溶蛋白中酰胺I帶的影響，這可能是因?yàn)榧尤氲慕湍妇c乳酸菌之間相互影響，兩者表現(xiàn)出一定的拮抗作用。

2.5 麥醇溶蛋白的IFS分析結(jié)果

在蛋白質(zhì)分子中，發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）以及苯丙氨酸（Phe）。Trp、Tyr以及Phe由于其側(cè)鏈生色基團(tuán)的不同，表現(xiàn)出的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜也不同[27]。蛋白質(zhì)中Tyr和Phe殘基對(duì)環(huán)境變化不敏感，而Trp殘基的天然熒光及其變化值可直接反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)本身和周圍環(huán)境的變化，可作為探針廣泛用于檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[30]。

圖5 發(fā)酵24 h酸面團(tuán)中麥醇溶蛋白的IFS圖Fig. 5 Intrinsic fluorescence spectra of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

由圖5可知，不同的發(fā)酵處理?xiàng)l件對(duì)麥醇溶蛋白IFS光譜的最大發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度有一定影響。SL20998熒光強(qiáng)度最大，SCA和SLB02012相對(duì)較小。表2列出了樣品IFS掃描峰的波長及峰值（熒光強(qiáng)度）。

表2 發(fā)酵24 h酸面團(tuán)中麥醇溶蛋白的IFS出峰波長和峰值Table 2 IFS maximum wavelengths and peak heights of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

由表2可知，SL20998的λmax發(fā)生紅移（從342 nm到343 nm），可能是因?yàn)樵谔烊坏鞍踪|(zhì)中，色氨酸一般處于分子內(nèi)部，被非極性氨基酸包圍，經(jīng)消化乳桿菌20998長時(shí)發(fā)酵后，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開，聚集程度降低，處于分子內(nèi)部的色氨酸逐漸暴露出來；因此，熒光強(qiáng)度增加，λmax發(fā)生紅移。相對(duì)于CK，SY、SLB02012和SYLB02012的λmax發(fā)生了藍(lán)移（從342 nm分別到341、341、340 nm），表明植物乳桿菌B02012發(fā)酵的面團(tuán)中麥醇溶蛋白發(fā)生三級(jí)結(jié)構(gòu)聚集，色氨酸暴露程度減少。

2.6 麥醇溶蛋白的ELISA分析結(jié)果

由圖6可知，SCA、SY、SLB02012、SYLB02012組面團(tuán)經(jīng)過24 h發(fā)酵后麥醇溶蛋白免疫反應(yīng)性相對(duì)于CK組呈下降趨勢，SLB02012中麥醇溶蛋白的免疫反應(yīng)性降低了35%，下降最顯著，該降敏程度高于可食性有機(jī)酸酸化發(fā)酵面團(tuán)和傳統(tǒng)酵母菌發(fā)酵面團(tuán)。而SL20998和SYL20998組面團(tuán)中麥醇溶蛋白免疫反應(yīng)性非但沒有降低反而增強(qiáng)，分別增加了30%和14%。由IFS分析可知，SCA、SLB02012和SYLB02012的λmax發(fā)生藍(lán)移，蛋白質(zhì)聚集，抗原表位被覆蓋，暴露程度小，被抗體識(shí)別的可能性小，從而使得免疫反應(yīng)性降低。由SDS-PAGE分析可知，SLB02012組面團(tuán)中的HMW-GS、中分子質(zhì)量蛋白及麥醇溶蛋白條帶較其他各組面團(tuán)的蛋白質(zhì)水解程度更大，這可能使得原本可以被抗體識(shí)別的免疫表位由于蛋白發(fā)生了更大程度的水解，隨機(jī)去除抗原活性位點(diǎn)或增加了活性位點(diǎn)空間位阻，抗原暴露量減少，免疫反應(yīng)性降低。FTIR結(jié)果表明，SCA組分子內(nèi)β-折疊含量顯著減小，蛋白質(zhì)可能發(fā)生了有機(jī)酸脫酰胺反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)，脫酰胺反應(yīng)可使麥醇溶蛋白免疫反應(yīng)性降低具有降敏的效果[31]。消化乳桿菌20998引起免疫反應(yīng)性增加，可能是由于麥醇溶蛋白降解成肽段反而暴露出更多的免疫性原位，從而受到抗體的識(shí)別，導(dǎo)致免疫反應(yīng)性增加。SL20998、SYL20998組中β-轉(zhuǎn)角的含量明顯增加，有研究發(fā)現(xiàn)，β-轉(zhuǎn)角主要是天冬氨酸和谷氨酸構(gòu)成的處于分子表面的二級(jí)結(jié)構(gòu)[32]，面團(tuán)經(jīng)過消化乳桿菌20998長時(shí)發(fā)酵后天冬氨酸和谷氨酸暴露程度增加，進(jìn)而導(dǎo)致抗原表位增加，故免疫反應(yīng)性較CK組呈現(xiàn)增強(qiáng)的現(xiàn)象。SL20998的λmax發(fā)生紅移，蛋白質(zhì)聚集程度減小，結(jié)構(gòu)伸展，更易暴露出免疫表位，這也導(dǎo)致了消化乳桿菌20998發(fā)酵面團(tuán)免疫反應(yīng)性增強(qiáng)[33]。

圖6 發(fā)酵24 h各面團(tuán)中麥醇溶蛋白的酶聯(lián)免疫吸附能力Fig. 6 ELISA measurement of wheat gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

2.7 層次聚類分析結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)果，采用層次聚類分析對(duì)各發(fā)酵面團(tuán)樣品中麥醇溶蛋白二、三級(jí)分子結(jié)構(gòu)與其酶聯(lián)免疫吸附能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。

由圖7可知，7 個(gè)樣品分為3 類：第1類樣品是加入了消化乳桿菌20998發(fā)酵的面團(tuán)（SL20998、SYL20988），免疫反應(yīng)性增強(qiáng)大于23%；第2類樣品為SY和SYLB02012，免疫反應(yīng)性下降約14%；第3類樣品為SCA和SLB02012，免疫反應(yīng)性降低約30%。該結(jié)果說明，相同聚類的樣品免疫反應(yīng)性變化表現(xiàn)出相似性，且本研究中植物乳桿菌B02012發(fā)酵面團(tuán)表現(xiàn)出和可食性有機(jī)酸酸化面團(tuán)相近的降敏效果。有機(jī)酸脫酰胺雖然有大量文獻(xiàn)報(bào)道其降敏效果，但現(xiàn)有的酸隨機(jī)脫酰胺改性小麥蛋白方法仍存在爭議和不足。Denery-Papini等[34]研究指出，脫酰胺小麥蛋白仍對(duì)乳糜瀉敏感患者帶來強(qiáng)烈的致敏反應(yīng)。Rahaman等[35]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脫酰胺條件無降敏效果，當(dāng)溫度高于100 ℃的中酸性條件時(shí)小麥蛋白的抗原性才會(huì)降低。相比之下，植物乳酸菌B02012在面團(tuán)品質(zhì)改善和降敏穩(wěn)定性表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。

圖7 層次聚類分析譜系圖Fig. 7 Dendrogram of agglomerative hierarchical clustering

3 結(jié) 論

通過對(duì)7 種長時(shí)發(fā)酵面團(tuán)（CK、SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998）中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化測定發(fā)現(xiàn)，乳桿菌是面團(tuán)中蛋白質(zhì)降解的主導(dǎo)者。兩株乳桿菌雖然具有相似的產(chǎn)酸速率和酸化性能，但其發(fā)酵面團(tuán)中蛋白質(zhì)分子二、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)差異。與CK組相比，SLB02012組面團(tuán)中β-折疊含量減少，α-螺旋含量下降最明顯，且α-螺旋含量/β-折疊含量的比值最小；SL20998和SYL20998中β-轉(zhuǎn)角含量明顯增加；SY、SLB02012和SYLB02012的λmax發(fā)生藍(lán)移，蛋白質(zhì)聚集程度增加，SL20998熒光發(fā)生紅移，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開，聚集程度降低。

對(duì)7 種長時(shí)發(fā)酵面團(tuán)中麥醇溶蛋白免疫性的研究表明，消化乳桿菌20998引起免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，植物乳酸菌B02012具有顯著降低免疫反應(yīng)的效果。

植物乳桿菌B02012是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)紫外誘變后用于微生態(tài)制劑的乳酸菌，在酸面團(tuán)長時(shí)發(fā)酵過程中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，產(chǎn)生的小分子肽段、氨基酸和乳酸等物質(zhì)可以豐富面團(tuán)風(fēng)味，而且表現(xiàn)出較好的降低免疫反應(yīng)性的效果。植物乳桿菌B02012可作為優(yōu)勢菌用于開發(fā)低敏食品，對(duì)于構(gòu)建低敏長時(shí)發(fā)酵酸面團(tuán)工業(yè)化生產(chǎn)體系有著重要的實(shí)際意義。