紅茶菌發(fā)酵黃漿水的體外抗氧化活性

唐思頡，涂傳海，胡文秀，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

紅茶菌也被稱為康普茶、“海寶”，是一種味道酸甜可口的純天然保健飲品[1]，對于多種胃病具有一定保健作用，在亞洲已有2 000多年的食用歷史。傳統(tǒng)紅茶菌制備方法為以茶糖水為基質(zhì)，添加紅茶菌菌液及菌膜經(jīng)自然發(fā)酵而成。最新研究表明，紅茶菌菌膜是一種液面生物膜，其中包含醋酸菌、酵母菌和少量的乳酸菌。紅茶菌的功能特性主要取決于發(fā)酵液中含有的茶葉浸出物、活的微生物及其代謝產(chǎn)物。由于菌種的差異性和培養(yǎng)方法的不同，紅茶菌的代謝途徑復(fù)雜，所得到菌液中功能成分的種類、含量也有所不同，其功能特性主要歸因于在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸和酚類等抗氧化物質(zhì)[2]。

黃漿水是豆腐生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品，其中含有大量的低聚糖、大豆異黃酮及少量的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[3]。隨著豆制品在世界范圍內(nèi)產(chǎn)量的增加，黃漿水的排放所造成的資源浪費和環(huán)境污染備受關(guān)注。已有研究表明，經(jīng)過益生菌發(fā)酵黃漿水的營養(yǎng)價值和功能活性有所提高，尤其是經(jīng)過微生物發(fā)酵后，糖苷型的異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型的異黃酮，其體外抗氧化能力有所提高，微生物發(fā)酵有可能為黃漿水的利用提供新的途徑[4-6]，實現(xiàn)黃漿水資源的利用，減少排污，為豆制品企業(yè)帶來良好的經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水 南京市豆果果豆制品有限公司；紅茶菌發(fā)酵母液由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物研究室保存；紅茶茶包、白砂糖 南京市蘇果超市。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、抗壞血酸 南京雙領(lǐng)化玻有限公司；大豆異黃酮標準品（色譜級） 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、三氟乙酸（色譜級） 南京大光明器化玻及供應(yīng)部；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40AI型立式電熱壓力滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；64RL高速冷凍離心機 美國Beckman公司；SYG-1220數(shù)顯恒溫水浴鍋 美國Crystal有限公司；AUY-120分析天平、UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；IS128 pH計 上海儀邁儀器科技有限公司；Synergy-2酶標儀 美國Biotek公司；UP-250-HE數(shù)控超聲波清洗器 南京壘君達超聲電子儀器設(shè)備有限公司；1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶菌發(fā)酵液的制備

將紅茶以5 g/L添加到沸水中，煮沸5 min，加入質(zhì)量分數(shù)10%白砂糖，充分溶解后過濾，待茶糖水冷卻至室溫后，按質(zhì)量分數(shù)10%接入紅茶菌發(fā)酵母液，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)8 d，發(fā)酵好的紅茶菌用于后續(xù)黃漿水的發(fā)酵。

1.3.2 紅茶菌發(fā)酵黃漿水的制備

黃漿水于108 ℃滅菌15 min后冷卻至室溫。參照謝惠青[7]、Vitas[8]等的方法，在無菌環(huán)境下，按質(zhì)量分數(shù)10%接入紅茶菌，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)8 d，每隔1 d無菌操作取樣，樣品經(jīng)12 000 r/min離心10 min后放置于4 ℃冰箱，用于后續(xù)實驗測定。

1.3.3 pH值和總酸濃度的測定

用pH計測定發(fā)酵過程中pH值的變化；用0.1 mol/L NaOH溶液滴定發(fā)酵黃漿水，總酸濃度的計算如式（1）所示。

式中：c2為發(fā)酵黃漿水總酸濃度/（mol/L）；c1為NaOH溶液濃度/（mol/L）；V1為NaOH滴定發(fā)酵液后的體積/mL；V2為NaOH滴定發(fā)酵液前的體積/mL；V3為待測發(fā)酵液體積/mL。

1.3.4 還原糖質(zhì)量濃度的測定

參照Sengupta等[9]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定黃漿水發(fā)酵過程中還原糖質(zhì)量濃度。

1.3.5 樣品提取

參照Fei Yongtao等[10]的方法，采用體積分數(shù)80%甲醇溶液提取樣品，其中一部分提取液經(jīng)0.45 μm無菌微孔濾膜過濾后用于高效液相色譜測定大豆異黃酮質(zhì)量濃度；另一部分提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，并按實驗需要用體積分數(shù)80%甲醇溶液復(fù)溶，稀釋至不同質(zhì)量濃度，用于體外抗氧化活性測定。

1.3.6 總酚和總黃酮質(zhì)量濃度的測定

參照Chakravorty等[11]的方法，采用福林-酚比色法測定總酚質(zhì)量濃度，以沒食子酸質(zhì)量計，根據(jù)標準曲線計算?？傸S酮質(zhì)量濃度的測定參照Jia Zhishen等[12]的方法，以蘆丁質(zhì)量計，根據(jù)標準曲線計算。

1.3.7 大豆異黃酮組分的測定

采用高相液相色譜法測定黃漿水中大豆異黃酮質(zhì)量濃度。參考Xiao Yu等[4]的實驗方法。實驗條件為：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為體積分數(shù)0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為乙腈；流速：0.7 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。梯度洗脫條件為：0～10 min，體積分數(shù)90%～75%流動相A；10～12 min，體積分數(shù)75%～70%流動相A；12～25 min，體積分數(shù)70%～45%流動相A；25～30 min，體積分數(shù)45%～90%流動相A。

大豆異黃酮的種類通過將未知峰與標準品在完全相同條件下的保留時間進行對比而確定。通過大豆異黃酮標準品的標準曲線計算發(fā)酵黃漿水中各大豆異黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.8 體外抗氧化能力測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力測定

參照丁艷如等[13]的方法，配制不同質(zhì)量濃度的樣品及生育酚，向2 mL樣品中加入2 mL DPPH溶液（0.5 mmol/L），振蕩搖勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率如式（2）所示計算。

式中：ADPPH為DPPH和甲醇溶液的吸光度；Asample為DPPH和樣品溶液的吸光度；Ablank為樣品和甲醇溶液的吸光度。

1.3.8.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考Xiao Yu等[4]的方法，配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，按體積比1∶2混勻后置于黑暗環(huán)境16 h。使用前用乙醇稀釋ABTS溶液，使其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。配制不同質(zhì)量濃度的樣品和生育酚溶液0.3 mL，加入1.2 mL ABTS溶液，在室溫下反應(yīng)6 min，測定734 nm波長處的吸光度。ABTS陽離子自由基清除率如式（3）所示計算。

式中：Asample為ABTS和樣品溶液的吸光度；Acontrol為ABTS和甲醇溶液的吸光度。

1.3.8.3 亞鐵離子還原力測定

參照Xiao Yu等[14]方法，配制0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH 3.6），用40 mmol/L HCl溶液配制濃度為10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液，按體積比10∶1∶1將上述溶液混勻制得亞鐵離子還原力溶液。配制不同質(zhì)量濃度的樣品和生育酚溶液0.2 mL，加入1 mL亞鐵離子還原力溶液，在37 ℃下放置20 min，測定593 nm波長處的吸光度。配制梯度FeSO4標準溶液（100～1 400 μmol/L），于593 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線：y＝0.002 1x＋0.202 5（R2＝0.999），通過標準曲線計算亞鐵離子濃度以表示亞鐵離子還原力。

1.3.8.4 還原力測定

參照朱曉慶等[15]方法，將0.2 mL樣品、1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液混勻，于50 ℃反應(yīng)30 min。冷卻后加入體積分數(shù)10%三氯乙酸溶液1 mL，混勻，3 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液加入0.2 mL質(zhì)量分數(shù)1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min。以蒸餾水為空白對照，于700 nm波長處測定吸光度。以樣品溶液與空白對照吸光度的差表示還原力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 黃漿水發(fā)酵過程中pH值和總酸濃度的變化

圖1 黃漿水發(fā)酵過程中pH值和總酸濃度的變化Fig. 1 Changes in pH and titratable acidity during soy whey fermentation

如圖1所示，pH值下降伴隨著總酸濃度的增加。8 d發(fā)酵期間出現(xiàn)兩個明顯的轉(zhuǎn)折點。第1個轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)在第1天，pH值由為初始的4.89降至4.16，其后pH值穩(wěn)定在4.15左右。第3天，pH值再次下降到3.28，此后pH值穩(wěn)定在3.24～3.30之間。與此相反，總酸濃度持續(xù)增加至第6天，在第3～6天之間增加幅度最明顯，從0.049 mol/L增加至0.121 mol/L，在第8天略下降至0.093 mol/L。pH值下降是由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸所致。有研究發(fā)現(xiàn)，紅茶菌發(fā)酵過程中存在兩個階段，即乙醇發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段[16]。在發(fā)酵初期為乙醇發(fā)酵階段，主要由酵母發(fā)揮重要作用，酵解果糖產(chǎn)生乙醇和二氧化碳；此后為醋酸發(fā)酵階段，其間醋酸菌利用葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸或葡萄糖醛酸等活性物質(zhì)，并利用乙醇產(chǎn)生乙酸等多種有機酸，其中乙酸被公認為紅茶菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的最主要的有機酸。Jayabalan等[17]證明紅茶菌發(fā)酵液具有緩沖作用，因其產(chǎn)生的二氧化碳溶于水中產(chǎn)生HCO3－，與有機酸釋放的H＋反應(yīng)，導(dǎo)致即使在醋酸發(fā)酵階段產(chǎn)生大量有機酸時pH值仍然保持穩(wěn)定。

2.2 還原糖質(zhì)量濃度的變化

如圖2所示，第1天還原糖質(zhì)量濃度略增加，第1～3天還原糖質(zhì)量濃度從9.68 mg/mL急速下降至1.37 mg/mL，此后在1.24～1.83 mg/mL之間波動。結(jié)合2.1節(jié)pH值和總酸濃度在發(fā)酵過程中的變化情況，可推斷前3 d為乙醇發(fā)酵階段，其間酵母菌為主要生長代謝的菌種，消耗了大量還原糖，并將其轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，所產(chǎn)生的乙醇在發(fā)酵后期被醋酸菌迅速氧化為乙酸及其他有機酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中H＋濃度升高，在酸性環(huán)境中加速蔗糖水解產(chǎn)生葡萄糖和果糖；同時，醋酸菌消耗水解產(chǎn)生還原糖，進而使發(fā)酵體系中還原糖的產(chǎn)生和代謝維持平衡，表現(xiàn)為發(fā)酵第3天之后還原糖質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定。

圖2 黃漿水發(fā)酵過程中還原糖質(zhì)量濃度的變化Fig. 2 Changes in reducing sugar content during soy whey fermentation

2.3 總酚和總黃酮質(zhì)量濃度的變化

表1 發(fā)酵前后黃漿水體積分數(shù)80%甲醇溶液提取物中總酚和總黃酮質(zhì)量濃度Table 1 Contents of total phenols and total flavonoids in 80% methanol extracts from unfermented and fermented soy whey

如表1所示，發(fā)酵黃漿水中總酚和總黃酮質(zhì)量濃度都有顯著提升。黃漿水提取物中總酚質(zhì)量濃度從（387.50±5.10）mg/L提高至發(fā)酵第8天的（584.80±4.63）mg/L，總黃酮質(zhì)量濃度由（111.61±2.94）mg/L持續(xù)增加至發(fā)酵第6天的（268.45±2.20）mg/L。結(jié)果表明，發(fā)酵后黃漿水中新生成了酚類、黃酮類物質(zhì)。許多研究表明酚類物質(zhì)（包括黃酮類物質(zhì)）多與蛋白、脂肪等物質(zhì)相結(jié)合，以復(fù)雜且不可溶的形式存在于植物中[18]，在發(fā)酵過程中由于微生物分泌的各種酶或發(fā)酵環(huán)境酸堿度的變化等，結(jié)合酚被釋放出來[19-20]；另一方面，微生物的代謝活動也可以作用于某些生物活性物質(zhì)，改變其性質(zhì)，從而產(chǎn)生新的酚類和黃酮類化合物[21]。

2.4 大豆異黃酮質(zhì)量濃度的變化

表2 4 種大豆異黃酮標準品的線性方程Table 2 Standard curves for various soybean isoflavonoids

圖3 大豆異黃酮的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of extracts rich in soybean isoflavonoids

如圖3、表2所示，本實驗測定了4 種主要的大豆異黃酮，其中黃豆黃苷和染料木苷屬于結(jié)合型的糖苷，黃豆黃素和染料木素屬于游離型的苷元。如表3所示，總體而言，在紅茶菌發(fā)酵黃漿水過程中，糖苷型異黃酮總質(zhì)量濃度逐漸降低，從（86.49±1.61）mg/L減少至（47.65±3.74）mg/L，苷元型異黃酮總質(zhì)量濃度提高，從（28.17±2.96）mg/L增加至（150.11±2.50）mg/L，發(fā)酵至第6天時大豆異黃酮總質(zhì)量濃度比接種第0天增加約86.05 mg/L。綜合上述實驗結(jié)果，發(fā)酵至第6天的黃漿水中大豆異黃酮質(zhì)量濃度達到最大值，因此確定發(fā)酵終點為第6天。

表3 發(fā)酵前后黃漿水體積分數(shù)80%甲醇溶液提取物中大豆異黃酮的質(zhì)量濃度Table 3 Soybean isoflavonoids composition of 80% methanol extracts from unfermented and fermented soy whey

表3結(jié)果表明，苷元型的物質(zhì)是由發(fā)酵前糖苷型的物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。已有很多研究表明，在微生物發(fā)酵后，大豆制品中苷元型物質(zhì)的含量顯著提高，這可能是由于微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶或是酸水解的作用，導(dǎo)致了苷元型物質(zhì)含量的增加[22-24]；另一方面，與蛋白、脂肪等物質(zhì)相結(jié)合的黃酮類物質(zhì)可能在發(fā)酵前無法被檢測出，在發(fā)酵過程中逐漸被釋放，轉(zhuǎn)化成游離型的異黃酮，從而導(dǎo)致異黃酮總質(zhì)量濃度增加[25]。由于游離型的苷元已被證實具有更高的生物活性，且更易被人體小腸吸收利用[26]。因此，黃漿水可作為紅茶菌的一種新型發(fā)酵基質(zhì)，從而為其賦予更高的營養(yǎng)價值。

2.5 發(fā)酵黃漿水的抗氧化活性

如圖4A所示，與未發(fā)酵黃漿水相比，發(fā)酵黃漿水對DPPH自由基的清除能力明顯提高，在樣品質(zhì)量濃度為0.25～10 mg/mL時，未發(fā)酵黃漿水的DPPH自由基清除率從5.22%提高至58.25%，而發(fā)酵黃漿水則從15.19%提高至93.19%。結(jié)果表明，發(fā)酵過程對提高DPPH自由基清除能力起著重要作用。Marazza等[27]利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵豆?jié){，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆?jié){內(nèi)苷元型異黃酮質(zhì)量濃度增加，導(dǎo)致DPPH自由基清除率也隨之增加；苷元型異黃酮相較于其對應(yīng)的β-葡萄糖苷型前體具有更高的抗氧化活性。因此，推測苷元型大豆異黃酮質(zhì)量濃度的提高是DPPH自由基清除率提高的重要原因。

如圖4B所示，未發(fā)酵黃漿水和發(fā)酵黃漿水的ABTS陽離子自由基清除能力在0.25～4 mg/mL之間明顯提高。當(dāng)質(zhì)量濃度超過4 mg/mL時，兩者對ABTS陽離子自由基的清除能力分別維持在55%和80%左右。Dani等[28]認為酚類化合物的抗氧化能力具有濃度飽和上限，這意味著當(dāng)濃度超過飽和上限的時候，酚類化合物對ABTS陽離子自由基的清除能力不再增加。

如圖4C所示，未發(fā)酵黃漿水和發(fā)酵黃漿水的亞鐵離子還原力與樣品質(zhì)量濃度成正比。發(fā)酵黃漿水的亞鐵離子濃度從7.70 μmol/L增加至681.03 μmol/L，而未發(fā)酵黃漿水僅從15.37 μmol/L增加至253.24 μmol/L，可以看出經(jīng)過發(fā)酵的黃漿水明顯增強了亞鐵離子還原力。

從圖4D可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，未發(fā)酵黃漿水和發(fā)酵黃漿水的還原力均增強。4～10 mg/mL時，發(fā)酵黃漿水的還原力明顯強于未發(fā)酵黃漿水。在6 mg/mL下，未發(fā)酵黃漿水的還原力為0.08，而發(fā)酵黃漿水為0.27，是未發(fā)酵黃漿水的3.4 倍。研究表明，發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的一些還原酮物質(zhì)可以向自由基提供電子而使其更加穩(wěn)定，進而有利于終止自由基鏈式反應(yīng)的進行[29]，因此發(fā)酵后的黃漿水具有更強的還原力。

圖4 發(fā)酵前后黃漿水體積分數(shù)80%甲醇溶液提取物體外抗氧化活性Fig. 4 In vitro antioxidant activity of 80% methanol extracts from unfermented and fermented soy whey

事實上，紅茶菌發(fā)酵體系復(fù)雜，發(fā)酵液抗氧化活性的提高取決于多種因素，在發(fā)酵過程中，存在多種次級代謝產(chǎn)物，包括葡萄糖酸和葡萄糖醛酸。已有研究證明這些物質(zhì)具有鈣離子和鐵離子螯合劑的特性[30]。除此之外，發(fā)酵過程中的一些物理化學(xué)變化也會給黃漿水發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性帶來一定的影響[31-32]。

黃漿水的抗氧化活性與其EC50成反比。發(fā)酵黃漿水的DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力和還原力的EC50分別為1.660、1.306、11.339 mg/mL，顯著低于未發(fā)酵黃漿水（分別為9.108、4.584、821.722 mg/mL）（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，利用紅茶菌發(fā)酵黃漿水可明顯提高其抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本研究以紅茶菌為菌種、以黃漿水為基質(zhì)進行發(fā)酵，得到具有功能活性的新型黃漿水發(fā)酵產(chǎn)品。本研究結(jié)果可支持一種改善營養(yǎng)價值和功能特性的紅茶菌發(fā)酵飲品的開發(fā)。經(jīng)發(fā)酵后的黃漿水營養(yǎng)和功能特性相比未發(fā)酵黃漿水明顯提高。相比于未發(fā)酵黃漿水，發(fā)酵至第6天黃漿水中的游離型苷元質(zhì)量濃度增加至（150.95±0.79）mg/L，是未發(fā)酵黃漿水的5.3 倍；黃豆黃素質(zhì)量濃度從（9.69±1.32）mg/L增加至（77.61±1.72）mg/L；染料木素質(zhì)量濃度從（18.49±1.67）mg/L增加至（73.34±1.46）mg/L。經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后的黃漿水抗氧化活性明顯提高。本研究結(jié)果表明，苷元型大豆異黃酮質(zhì)量濃度的增加是發(fā)酵黃漿水抗氧化活性提高的重要原因。