清肝明目丸抗炎抗菌作用研究*

石敏娟，何侃亮，李 博，甘雪峰，袁秋貞，任 嘯，宋 瑞，李 芳，王衛(wèi)峰，姜姍姍△

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)；2.西電集團(tuán)醫(yī)院(西安 710077)；3.陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

角膜炎是眼科常見(jiàn)病，屬中醫(yī)“聚星障”、“花翳白陷” 范疇，其致盲率和復(fù)發(fā)率居角膜病變的首位。西醫(yī)常以抗菌治療為主 ,但由于藥物毒副作用和細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生，臨床療效受到一定影響。近年來(lái)中醫(yī)藥在治療此類疾病方面取得了較好的效果，清肝明目丸由板藍(lán)根、谷精草、木賊等15位藥材加工制成，具有清肝瀉火，明目退翳的功效。其在臨床中已使用多年，在治療肝火上炎引起的目赤腫痛，眼生星翳，畏光流淚等方面有很好療效，為進(jìn)一步明確該制劑的藥效機(jī)制，以及為臨床使用提供理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)行了清肝明目丸抗炎及抗菌方面的實(shí)驗(yàn)研究。

材料和方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，雌雄各半，體重(18～22 g)，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(陜)2007-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：清肝明目丸 (陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑室，20140812)；阿司匹林腸溶緩釋片，(國(guó)藥準(zhǔn)字 H20030396，產(chǎn)品批號(hào)1407253，規(guī)格：50 mg/片)。實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成2 mg/ml的混懸液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?；生理鹽水。菌種：乙型溶血性鏈球菌(CMCC32210)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)、福氏志賀氏菌 (CMCC51573)、金黃色葡萄球菌(ATCC25925)、綠膿假單胞菌(ATCC57853)、白色假絲酵母菌(CMCC85021)。以上菌株從西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院引進(jìn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑：AL104型電子天平METTLER TOLEDO公司； LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)；721型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；303型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；H2Q-X100型恒溫?fù)u床(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)；麥?zhǔn)媳葷峁?溫州康泰生物科技有限責(zé)任公司)。打孔器；冰醋酸、二甲苯均為分析純。

2 研究方法

2.1 清肝明目丸對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響：昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機(jī)分為5組，每組10只。模型組阿司匹林(200 mg/kg)，清肝明目丸低劑量組(0.6 g/kg)、中劑量組(1.2 g/kg)、高劑量組(2.4 g/kg)，每組動(dòng)物以20 ml/kg,連續(xù)灌胃5 d，1次/d，模型組動(dòng)物灌胃同體積生理鹽水。末次給藥后45 min給每只小鼠右耳兩側(cè)均勻涂抹二甲苯20μl，致炎20 min后，將小鼠脫頸處死，順著耳廓基線剪下雙耳，在左右耳同一部位用7 mm打孔器打孔，分別稱重，計(jì)算左右兩個(gè)耳片的質(zhì)量差即為腫脹度，同時(shí)計(jì)算各組腫脹抑制率，腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%。

2.2 清肝明目丸對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響:50只昆明種小鼠，分組同2.1項(xiàng)給藥，末次給藥45 min后尾靜脈注射0.5%伊文斯藍(lán)0.01 ml/10g，后即刻0.7%冰醋酸(0.2 ml/只)腹腔注射，20 min后將小鼠脫椎處死，剪開(kāi)腹部皮膚用6 ml生理鹽水分?jǐn)?shù)次沖洗，吸出洗滌液，合并后加生理鹽水，稀釋至10 ml，混勻，3000 r/min,離心15 min，再取上清液于590 nm處測(cè)光密度(OD)值，并計(jì)算各組抑制率，抑制率(%)=(模型組平均OD值-給藥組平均OD值)/模型組平均OD值×100%。

3 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

菌液制備：將大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、白色假絲酵母菌接種于2 ml的MH肉湯培養(yǎng)基中，乙型溶血性鏈球菌接種于血清MH肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6 h后，用標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁?1.5×108cfu/ml)的實(shí)驗(yàn)菌液，再用無(wú)菌肉湯稀釋150倍，得濃度1×106cfu/ml菌液，入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。藥液制備：?zhǔn)確稱取清肝明目丸20 g，加去離子水200 ml，浸泡溶解后，常規(guī)煎煮30 min，8層紗布過(guò)濾藥液，藥渣再加水100 ml，同法煎煮30 min，合并兩次濾液，離心去渣，水浴濃縮成20 ml，即成1 g/ml清肝明目丸，調(diào)pH7.2～7.4，115℃，20 min高壓滅菌后置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

配制好的清肝明目藥液先用MH肉湯倍比稀釋，取1 ml不同濃度的稀釋藥液，分別加入106cfu/ml大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、白色假絲酵母菌0.1 ml,乙型溶血性鏈球菌每管各加羊血1滴，最終接種細(xì)菌量每管105cfu/ml。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照管(加入藥液0.1 ml，不加細(xì)菌)和陽(yáng)性對(duì)照管(加入細(xì)菌0.1 ml，不加藥液)。37℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，與陰性對(duì)照管和陽(yáng)性對(duì)照管進(jìn)行比較，不發(fā)生混濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)即藥物最小抑菌濃度(MIC)。將未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)管中液體0.1 ml接種到瓊脂培養(yǎng)基平板上(乙型溶血性鏈球菌接種血瓊脂培養(yǎng)基平板)，置37℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將含有≤5個(gè)菌落數(shù)的瓊脂平皿中藥物濃度判為最低殺菌濃度(MBC)。

4 體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)

感染菌液的制備：根據(jù)體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果，選擇金黃色葡萄球菌進(jìn)行體內(nèi)抗菌試驗(yàn)。在2 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中接種金黃色葡萄球菌，于37℃培養(yǎng)8 h后，取1 ml轉(zhuǎn)種于100 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)18 h，721型分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處比色，同時(shí)取0.1 ml做細(xì)菌計(jì)數(shù)。菌液3000 r/min，離心10 min后,取沉淀用5%胃膜素依次稀釋為10-1,10-2,10-3等不同濃度菌液。以能引起小鼠腹腔注射菌液( 0.5 ml/只) 48 h內(nèi)，引起90%動(dòng)物死亡的濃度作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)濃度，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定為 1.45×109cfu/m。

取昆明小鼠70只，雌雄各半，體重18-22 g，隨機(jī)分為5組，每組14只。模型按照“2.1”項(xiàng)下方法分組給藥，連續(xù)5 d，第5天給藥后1 h分別腹腔注射5%胃膜素稀釋的金黃色葡萄球菌菌液(約1.45×109/ml)，0.5 ml/只，觀察小鼠在2 d內(nèi)存活情況，記錄死亡時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡數(shù)，計(jì)算死亡保護(hù)率。死亡保護(hù)率( % )=( 模型組死亡率-實(shí)驗(yàn)組死亡率) /模型組死亡率×100% 。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 清肝明目丸對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 見(jiàn)表1。造模20 min后小鼠耳廓腫脹明顯。清肝明目丸中、高劑量組耳片腫脹明顯減輕，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明清肝明目丸對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹有一定的抑制作用。

2 清肝明目丸對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 見(jiàn)表2。清肝明目丸高劑量組腹腔通透性O(shè)D值明顯低于模型組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示清肝明目丸對(duì)0.7%冰醋酸致小鼠腹腔通透性增加有抑制作用。

表1 清肝明目丸對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫的影響

注：與模型組比較,*P<0.05；△P<0.01

表2 清肝明目丸對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

注：與模型組比較,*P<0.05；△P<0.01

3 體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究 見(jiàn)表3。清肝明目丸對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌及白色假絲酵母菌均有不同程度的抗菌作用，其抗菌效果依次為：金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌>白色假絲酵母菌>銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌。其對(duì)金黃色葡萄球菌的作用最強(qiáng)，MIC為7.81 mg/ml，MBC為15.63 mg/ml。

表3 清肝明目丸體外最低抑菌濃度和最低殺菌濃度(mg/ml)

4 體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn) 見(jiàn)表4。模型組小鼠感染金黃色葡萄球菌后，活動(dòng)差，飲食喝水減少，48 h死亡率為92.9%，與模型組比較，清肝明目丸2.4 g/kg及1.2 g/kg劑量能明顯降低金黃色葡萄球菌感染所致試驗(yàn)小鼠的死亡率，即清肝明目丸對(duì)金黃色葡萄球菌致死小鼠具有明顯的保護(hù)作用。

表4 清肝明目丸的體內(nèi)抗菌作用

注：與模型組比較,*P<0.05；△P<0.01

討 論

外障眼病是眼科臨床常見(jiàn)病，多發(fā)病，易復(fù)發(fā)[1]。外障是指發(fā)生在胞瞼、兩眥、白睛、黑睛的眼病，多因六淫之邪外襲或外傷所致，亦可由肝腎陰虛、虛火上炎等引起，又稱“聚星障”或“花翳白陷”[2]。其病變部位包括結(jié)膜、角膜、鞏膜、淚器、淚膜，證候特點(diǎn)為起病急、發(fā)展快、自覺(jué)癥狀明顯、外觀癥狀顯露， 如紅赤腫脹、潮濕糜爛、生眵流淚、潰膿結(jié)痂等，其臨床癥狀表現(xiàn)類似于西醫(yī)中的角膜炎。劉衛(wèi)華等[3]總結(jié)了大量中醫(yī)文獻(xiàn)，得出熱、風(fēng)、虛、瘀為角膜炎發(fā)病重要病機(jī)，而肝經(jīng)熱毒、肝風(fēng)熱極常易導(dǎo)致角膜炎發(fā)生。在中醫(yī)學(xué)理論中角膜為黑睛，屬五輪學(xué)說(shuō)之風(fēng)輪，黑睛在臟屬肝，肝與膽相表里，故黑睛疾病常與肝膽相關(guān)，同時(shí)黑睛病位淺表，導(dǎo)致黑睛生翳赤痛之證尤以風(fēng)、火、濕為主，治法常用清熱解毒，疏風(fēng)瀉火，清肝利膽之法[4-5]。

現(xiàn)在醫(yī)學(xué)對(duì)此類疾病的治療主要以抗菌藥物或激素類藥物進(jìn)行抗菌消炎[1]。中醫(yī)認(rèn)為“肝開(kāi)竅于目” “肝藏血，目得血而能視”，且肝經(jīng)行走于目系,故在眼部疾病治療上應(yīng)著清肝、滋陰、養(yǎng)血之法 。清肝明目丸以板藍(lán)根清熱解毒；谷精草、木賊明目退翳，青葙子、蟬脫、白蒺藜加強(qiáng)清肝明目退翳作用；紫草、赤芍、玄參清熱涼血，散瘀止痛；柴胡疏肝解郁并助散邪解毒；生地滋陰養(yǎng)血，使瘀去而正不傷；黃芪、白術(shù)補(bǔ)氣扶正固本；諸藥合用，有清肝瀉火、明目退翳、扶正固本之功效。

本研究以二甲苯致小鼠耳腫脹、冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性為模型，對(duì)清肝明目丸的抗炎作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，清肝明目丸可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹和冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加，其作用與劑量有一定的依賴關(guān)系。

根據(jù)感染的病原菌，可將感染性角膜炎分為細(xì)菌性角膜炎和真菌性角膜炎，以細(xì)菌性角膜炎更為常見(jiàn)[6]。細(xì)菌性角膜炎屬眼科常見(jiàn)疾病，是主要致盲的眼科疾病。不同年齡患者均可發(fā)病，如果在發(fā)病早期得不到及時(shí)有效的治療，極易引起角膜潰瘍穿孔、眼球發(fā)炎等[7]。細(xì)菌性角膜炎病原菌以革蘭氏陽(yáng)性球菌和革蘭氏陰性桿菌為主[8]。常見(jiàn)致病菌包括鏈球菌科、細(xì)球菌科(細(xì)球菌、葡萄球菌)、腸桿菌科(腸桿菌、沙雷菌、變形桿菌屬等)和假單胞菌科[9]。常見(jiàn)的致病菌中，以表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌性角膜潰瘍最為多見(jiàn)[10]。有研究從87例感染性角膜炎患者標(biāo)本中分離到28株病原菌，其中陽(yáng)性球菌占53.5%，陰性桿菌占32.1%，病原菌主要以葡萄球菌屬和大腸埃希菌為主[11]。2856份角膜炎患者眼部分泌物細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性560例，陽(yáng)性率為 19.61%，革蘭陽(yáng)性球菌占53.75%，包括表皮葡萄球菌、鏈球菌、微球菌；革蘭陰性桿菌占26.43%，包括銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙雷菌[12]?，F(xiàn)在對(duì)感染性角膜炎，臨床多以抗菌藥物治療為主，雖能改善癥狀，但近年來(lái)由于抗菌藥物的濫用，病原菌產(chǎn)生了較高耐藥率[13]。體外抗菌試驗(yàn)表明，清肝明目丸對(duì)于多種細(xì)菌具有明顯抑菌及殺滅作用，其抗菌效果依次為：金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌>白色假絲酵母菌>銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌，且有較好保護(hù)金黃色葡萄球菌感染小鼠的作用。綜上所述，清肝明目丸對(duì)角膜炎患者具有一定的抗炎和抗菌作用。