端粒及其類似物在腫瘤靶向治療中的研究進(jìn)展*

李 翠 綜述，羅 瑛 審校

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實驗室，昆明 650000)

2009年學(xué)界發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶在染色體末端保護(hù)的作用機(jī)制，打開了腫瘤靶向治療的新方向，揭示了端粒和端粒酶的重要性。人端粒是位于真核生物線性染色體末端，由非編碼DNA重復(fù)序列TTAGGG和TRF1、TRF2、POT1、TIN2、PAP1、TPP1(POT1和TIN2結(jié)合蛋白)6種端粒結(jié)合蛋白組成的一種回環(huán)結(jié)構(gòu)，具有保護(hù)染色體完整和維持基因組穩(wěn)定的作用[1]。在經(jīng)典的復(fù)制性衰老學(xué)說中，端粒隨著細(xì)胞分裂而縮短，直至Hayflick界限，細(xì)胞最終進(jìn)入復(fù)制性衰老或死亡。大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞通過重激活端粒酶補(bǔ)償機(jī)制維持端粒長度。端粒酶具有反轉(zhuǎn)錄活性，是真核細(xì)胞中的一種核酸聚合酶。人端粒酶結(jié)構(gòu)包括端粒酶RNA組分(TERC)，端粒反轉(zhuǎn)錄酶TERT，以及TP21、熱休克蛋白(hsp90)、p23等相關(guān)蛋白[2]。端粒酶在正常體細(xì)胞中活性的不可檢測性，使其成為具有研究前景的靶標(biāo)。十多年來，學(xué)者圍繞端粒和端粒酶進(jìn)行了多方面的探索和研究，其中以端粒作為靶標(biāo)成效明顯的有G-四鏈體(G4)穩(wěn)定劑，以端粒酶作為靶標(biāo)成效明顯的有端粒酶免疫治療和端粒酶結(jié)構(gòu)相關(guān)的核苷酸抑制劑。然而，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶陽性細(xì)胞和端粒酶陰性細(xì)胞在治療過程中出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[3]，這就使以端粒酶為直接或間接靶標(biāo)的腫瘤靶向治療易脫靶及腫瘤細(xì)胞對藥物不敏感，從而增加腫瘤治療的難度。本文綜合目前的研究結(jié)果，對效果明顯的端粒和端粒酶的靶向治療進(jìn)行概括，對T-Oligo與G4在腫瘤靶向治療中的作用與可能的機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 端粒、端粒酶與腫瘤靶向治療研究現(xiàn)狀

近20年，靶向端粒和端粒酶的癌癥治療策略研究成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究熱點。端粒的結(jié)構(gòu)比較特殊，在其3′末端有懸出的單鏈序列，使得端粒在一定情況下容易形成G4結(jié)構(gòu)[4]，這種結(jié)構(gòu)不僅會阻礙端粒酶結(jié)合到單鏈末端甚至?xí)苟肆Ｄ┒顺霈F(xiàn)脫環(huán)從而影響端粒的延長。因此，G4結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑的研究具有一定的抑制作用。例如，用穩(wěn)定劑CX-5461處理后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的DNA雙鏈斷裂增加，細(xì)胞增殖受到抑制并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[5]。順鉑衍生物四鉑選擇性穩(wěn)定U2OS ALT腫瘤細(xì)胞中的G4結(jié)構(gòu)，抑制端?；丨h(huán)結(jié)構(gòu)形成，減少姐妹染色體交換，從而誘發(fā)DNA損傷，誘導(dǎo)凋亡，但是對正常細(xì)胞影響甚微[6]。端粒酶結(jié)構(gòu)成分比較復(fù)雜，但是對端粒酶活性起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)主要是TERT亞基[7]，TERT至少有5種剪接體，通過改變TERT的剪接體也能抑制端粒酶的活性。

端粒酶靶向治療的研究主要有以下3個方面：(1)針對TERC亞基的反義寡核苷酸；(2)針對TERT亞基的免疫治療；(3)針對端粒酶活性位點結(jié)構(gòu)的非核苷酸抑制劑。目前，針對端粒酶靶點治療策略中比較有成效的是GRN163L、GV1001、BIBR15312、VX1001[8-10]，但也有局限性：GRN163L是靶向TERC的一種反義寡核苷酸，在臨床Ⅱ期試驗中發(fā)現(xiàn)對固體瘤治療效果有限[11-12]；BIBR1532是靶向端粒酶活性位點的小分子抑制劑，對短端粒腫瘤效果良好，但是對端粒較長的腫瘤治療效果有限；GV1001與VX1001都是利用TERT多肽結(jié)構(gòu)引發(fā)CD4+與CD8+免疫應(yīng)答達(dá)到治療腫瘤的目的，但是目前單一肽段效果有限，多種肽段組合還需要更多的研究[13]。近幾年研究表明，很多腫瘤在端粒酶介導(dǎo)的靶向治療過程中容易由端粒酶陽性轉(zhuǎn)換成端粒延長替代機(jī)制(ALT)維持端粒，這就容易導(dǎo)致脫靶，直接影響藥物療效,但是也有一部分的端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞在治療過程中未出現(xiàn)這種情況，如GRN163L能很好地抑制端粒較短的NSCLC細(xì)胞的增殖[14]，也能誘導(dǎo)鱗狀食管癌細(xì)胞的凋亡并且增加其放療的敏感性[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞中ALT特性的發(fā)展受到抑制，而其抑制的關(guān)鍵不太可能是端粒酶，但是具體的作用機(jī)制還不明確[3]。這也提示靶向端粒及其結(jié)構(gòu)的研究可能會比直接靶向端粒酶相關(guān)成分更長久有效。

2 T-Oligo與腫瘤的靶向治療

T-Oligo是與端粒3′懸出末端同源的寡核苷酸，由十多個核苷酸構(gòu)成，通常為11個，早在21世紀(jì)初就被應(yīng)用于衰老機(jī)制的研究中。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞最終衰老的根本原因是端?？s短到一定長度時，端粒單鏈末端無法侵入雙鏈端粒DNA中形成loop結(jié)構(gòu)，使得染色質(zhì)脫環(huán)，引發(fā)DNA損傷(DDR)，從而走向衰老或凋亡。這與TRF2的缺失所引發(fā)的DDR基本一致，說明TRF2在端粒異常所致衰老或凋亡中具有重要作用。在引入T-Oligo后，隨著T-Oligo在細(xì)胞核中的積累，T-Oligo誘發(fā)同樣的DDR、周期阻滯和凋亡。這可能是由于激活了ATM通路及其下游因子p53、pRb、E2F1、P95/Nbsl、Chk2等[16-17]。

T-Oligo誘發(fā)細(xì)胞衰老和凋亡的特性被廣泛應(yīng)用于腫瘤的靶向治療中。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外來的寡核苷酸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞核內(nèi)時主要發(fā)揮兩方面的作用：(1)與端粒招募的結(jié)合蛋白POT1、TRF2、TRF1等形成復(fù)合物[18]，使端粒不能形成有效的核酸蛋白復(fù)合物，影響端粒結(jié)構(gòu)的完整，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的DDR等應(yīng)激反應(yīng)；(2)因其結(jié)構(gòu)類似于暴露的端粒懸出末端，隨著T-Oligo在細(xì)胞核內(nèi)的積累，細(xì)胞內(nèi)的DDR或凋亡監(jiān)控蛋白結(jié)合并識別T-Oligo直接引發(fā)細(xì)胞內(nèi)周期阻滯、凋亡等應(yīng)激反應(yīng)。如圖1所示，T-Oligo作用機(jī)制圖：T-Oligo進(jìn)入細(xì)胞核后通過WRN蛋白或Mre11/Hrad50/Nbs1復(fù)合物誘發(fā)腫瘤細(xì)胞DDR機(jī)制。通過ATM表達(dá)上調(diào)及其磷酸化，激活p53、p95/Nbs1、p73通路：ATM磷酸化直接促進(jìn)Chk2和p53的磷酸化，并上調(diào)其下游因子p27、p21、p16、Bax誘導(dǎo)細(xì)胞的衰老或凋亡；ATM的磷酸化直接促使p95/Nbs1上調(diào)，誘發(fā)S期阻滯，最終走向衰老或凋亡；ATM磷酸化后促進(jìn)Rb的磷酸化，并上調(diào)下游因子E2F1、p73引發(fā)S期阻滯，最終誘發(fā)細(xì)胞的衰老或凋亡。

圖1 T-Oligo作用機(jī)制圖

在前列腺癌、淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤等腫瘤治療的研究中，T-Oligo展示了良好的抑癌抗癌效應(yīng)[19]。前列腺癌細(xì)胞DU-145在用T-Oligo處理1 d后就可以明顯檢測到細(xì)胞增殖的抑制，在處理4～5 d后檢測到細(xì)胞的凋亡增強(qiáng)[20]。T-Oligo還能通過p53/p73通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的衰老或死亡，而不影響正常的支氣管上皮細(xì)胞[21]。另一項對黑色素瘤細(xì)胞MU、PM-WK、MM-MC的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)T-Oligo(11堿基)處理，細(xì)胞通過WRN蛋白和ATM激酶上調(diào)p53、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體，并激活E2F1通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的周期阻滯和凋亡[22]。在小鼠的黑色素瘤異種移植模型中發(fā)現(xiàn)，T-Oligo處理后，腫瘤轉(zhuǎn)移情況減少90%～95%，腫瘤體積減小84%～88%[23]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，T-Oligo處理黑色素瘤細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率減少75%[18]。T-Oligo還能激活黑色素瘤細(xì)胞中的ATM通路，上調(diào)ATM和ATM的磷酸化，以及下游p53、p73、Bax等相關(guān)因子。T-Oligo在腫瘤的靶向治療中不僅單獨使用有效，還能與其他的抗癌藥物聯(lián)合使用，增強(qiáng)抗癌療效。例如，T-Oligo單獨處理乳腺癌細(xì)胞時，能促進(jìn)癌細(xì)胞的衰老和凋亡，而在用T-Oligo預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，放射治療的敏感性增加，對正常組織幾乎沒有影響[21]。T-Oligo在抗癌過程中并沒發(fā)現(xiàn)依賴于端粒酶，以上充分說明，T-Oligo的運(yùn)用可能成為非常有效的抗癌方法，未來T-Oligo與其他抗癌藥物的聯(lián)合使用將具有較好的臨床應(yīng)用前景。

3 G4與腫瘤的靶向治療

G4是一種在端粒區(qū)自發(fā)形成的二級結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅能阻止端粒酶靠近端粒，還能阻止端粒區(qū)域復(fù)制叉的活動[24]，從而克服端粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞永生化。此外，G4還能抑制通過ALT機(jī)制延長端粒的策略。研究發(fā)現(xiàn)，DNA解旋酶能分解G4，而端粒酶不能分解G4結(jié)構(gòu)，這一特性使G4配體及穩(wěn)定劑的發(fā)展得到廣泛的研究和運(yùn)用。G4配體能與端粒3′懸出端單鏈區(qū)緊密結(jié)合，促進(jìn)G4的形成及其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，G4配體在黑色素瘤細(xì)胞中與c-MYC和BCL-2啟動子序列相結(jié)合，下調(diào)c-MYC和BCL-2的表達(dá)，并抑制其增殖，誘導(dǎo)凋亡[25]。另一項研究顯示，G4配體可以用較低的濃度抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并誘發(fā)DDR[26]。目前，最有前景的G4穩(wěn)定配體包括Telomestatin、BRACO-19和RHPS 4。Telomestatin和RHPS 在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不明確，但有研究發(fā)現(xiàn)RHPS4特異性結(jié)合G4后誘導(dǎo)U251 MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G2/M期的阻滯，增加了放射治療的敏感性[27]。BRACO-19使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)后期橋和端粒融合，這可能是由于BRACO-19引發(fā)端粒T-loop結(jié)構(gòu)的脫環(huán)或端粒結(jié)合蛋白的釋放引發(fā)DNA損傷[28]，而端粒功能失調(diào)最終會引起p53和p21介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯、衰老或凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)，鉀離子濃度在BRACO-19發(fā)揮作用的過程中，也具有重大作用[29]。目前BRACO-19的研究已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，但是BRACO-19對腫瘤細(xì)胞的治療作用依賴于端粒的長度[30]，端粒過長時，BRACO-19的作用效果明顯受阻。G4的研究對腫瘤靶向治療具有重大的意義，但是如何篩選出合適的治療群體，或者與其他治療方式聯(lián)合運(yùn)用還需要進(jìn)一步的研究。

4 小 結(jié)

端粒和端粒酶在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的端粒長度都比正常的體細(xì)胞短，而超過85%的腫瘤細(xì)胞中端粒酶被重新激活，這都使端粒和端粒酶成為腫瘤靶向治療的關(guān)鍵而被廣泛研究。但在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞治療過程中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特性由ALT陰性變?yōu)锳LT陽性，這就容易導(dǎo)致治療效果降低甚至失??；但是也有部分的端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞在治療過程中沒有出現(xiàn)這種情況。因此，對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)變性進(jìn)行篩選將有利于靶向藥物的準(zhǔn)確使用，或者在端粒酶陽性腫瘤治療的后期聯(lián)合引入ALT特性的靶向藥物，這都需要更進(jìn)一步的研究來解決。此外，T-Oligo與G4在腫瘤靶向治療中具有良好的作用，但也都存在一定的缺陷，如T-Oligo因容易被核酸酶降解，在體內(nèi)的傳遞受到阻礙。新發(fā)現(xiàn)的一種陽離子多肽形成的納米復(fù)合物具有良好的生物利用度，或許能幫助T-Oligo在體內(nèi)的傳遞，但這還需要更多的研究證實。G4的使用從結(jié)構(gòu)方面能很好地誘導(dǎo)端粒酶陽性和ALT特性的腫瘤細(xì)胞的衰老或凋亡，但是G4配體或穩(wěn)定劑與G4結(jié)構(gòu)的特異性結(jié)合與結(jié)合度都存在一些問題，還需要設(shè)計和發(fā)現(xiàn)更合適的小分子來穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)，從而為推動腫瘤靶向治療的長期穩(wěn)定發(fā)展奠定基礎(chǔ)。