均勻分散的抗菌類藥品供試液及其上清液對菌落回收的影響

佘 凡，高 翔

（1.陜西省楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)藥品檢驗監(jiān)測評價中心微生物室，陜西 楊凌 712100；2.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

微生物限度檢查方法適用性試驗和微生物限度檢查首先均需要均勻分散的供試液及其上清液，2010年版《中國藥典（一部）》對有抑菌性的樣品進行離心沉淀，取上清液混合[1]，但2015年版《中國藥典（四部）》刪除了該方法[2-3]。本研究旨在考察均勻分散的抗菌類藥品供試液與其上清液的抑菌性是否等同，現(xiàn)報道如下。

1 材料

儀器：HTY-601型集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設備有限公司）；FC752型薄膜過濾器、LS-B50L型壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器公司）；HFsafe-760S型生物安全柜（上海精宏實驗設備有限公司）；MJ-250-Ⅲ型霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（上海金楊州惠科電子有限公司）。

試藥：甲硝唑片（金華企業(yè)＜集團＞股份有限公司，批號為170915，規(guī)格為每片0.2 g）；紅霉素腸溶片（西安利君制藥有限責任公司，批號為1608439-1，規(guī)格為每片0.125 g）；鹽酸左氧氟沙星片（山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責任公司，批號為170601，規(guī)格為每片0.1 g）；吐溫80（天津市天理化學試劑有限公司）；無水硫酸鎂（西隴化工股份有限公司）。

培養(yǎng)基、稀釋液、沖洗液、中和劑：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號為150922）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號為 160204）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號為150801），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號為160602），pH6.8 磷酸鹽緩沖液（PBS，批號為20170317），pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號為 20170310），均購自北京路橋技術(shù)有限責任公司。

菌屬：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26003〕、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10104〕、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕、白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98001〕、黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98003〕，均來源于中國醫(yī)學菌種保藏中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌分別接種于TSB中，33℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至SDB中，23℃培養(yǎng)48 h。上述培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至SDA上，23℃培養(yǎng)7 d，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%吐溫80的無菌0.9%氯化鈉溶液制成含菌103～104cfu/mL孢子懸液。

2.2 供試液制備

甲硝唑片供試液上清液（A1液）：取甲硝唑片10 g，加TSB至100mL，40℃條件下水浴振搖10 min，使充分溶解，靜置30min，使出現(xiàn)明顯分層，取上清液，制成1∶10（V/V）的 A1液，用 TSB 進一步稀釋成 1 ∶20，1∶50，1 ∶100（V/V）的系列溶液。

甲硝唑片均勻分散供試液（A2液）：同A1液制備方法，不靜置，吸取前用力振搖，使分散均勻，制成A2系列溶液。

紅霉素腸溶片供試液上清液（B1液）：取紅霉素腸溶片適量，置無菌研缽研成粉末，取10 g，加pH6.8 PBS至100 mL，40 ℃條件下水浴振搖 10 min，靜置30min，取上清液，制成 1∶10（V/V）的 B1液，再用 pH6.8 PBS進一步稀釋成1∶100（V/V）的B1液。

紅霉素腸溶片均勻分散供試液（B2液）：同B1液制備方法，不靜置，吸取前用力振搖，使分散均勻，制成B2液。

鹽酸左氧氟沙星片供試液上清液（C1液）：取供試品10 g，加pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液定容至100 mL，其余同A1液制備方法，制成1∶10（V/V）的C1液，再用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液進一步稀釋成1∶100的C1液。

鹽酸左氧氟沙星片均勻分散供試液（C2液）：同C1液制備方法，不靜置，吸取前用力振搖，使分散均勻，制成C2液。

2.3 方法適用性試驗

2.3.1 A1液及A2液方法適用性試驗（平皿法）

試驗組：取A1系列溶液各9.9 mL，加相應菌液0.1 mL，充分混勻，使小于100 cfu/mL，各取1 mL置平皿中。菌液組：取TSB 9.9 mL，其余同試驗組方法。供試品對照組：取A1系列溶液，加TSB 0.1 mL，充分混勻，各取1 mL置平皿中，加入TSA或SDA，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。同法操作A2系列溶液。甲硝唑片敏感菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌在A1液中的回收比值大于A2液，金黃色葡萄球、銅綠假單胞菌隨著稀釋級的增大，藥物濃度的降低，A1液和A2液回收比值[回收比值=（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]差距逐漸縮小。詳見表1。

2.3.2 B1液及B2液方法適用性試驗（平皿法）

取B1系列溶液及B2系列溶液各9.9 mL，分組及操作均同2.3.1項下方法。B1液中銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，B2液中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的回收比值均不超過0.11，表明此3種菌為紅霉素腸溶片敏感菌株。詳見表2。沖洗液對照組回收比值=沖洗液對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)。

表1 A1液及A2液各組菌落數(shù)及回收比值

表2 B液回收比值（n=3）

2.3.3 B1液及B2液方法適用性試驗（薄膜過濾法）

試驗組：取 1 ∶10（V/V）B1 液 1 mL，加入 100 mL含1%吐溫80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液100 mL的過濾器中，濾過，用含1%吐溫80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液900 mL沖洗，每次100 mL，最后1次沖洗液加入菌落數(shù)小于100 cfu的相應菌液，濾干后取濾膜菌面朝上貼于TSA平板上。菌液組：不加B1液，用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液同法沖洗，其余同試驗組。沖洗液對照組：不加B1液，用含1%吐溫80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液同法沖洗，其余同試驗組；供試品對照組：不加菌液，其余同試驗組；同法操作1∶10（V/V）的 B2液。B1液中3種菌的回收比值大于B2液。結(jié)果見表2。

2.3.4 C1液及C2液方法適用性試驗（平皿法）

試驗組：取C1系列溶液各9.9 mL，加相應菌液0.1 mL，充分混勻，使小于100 cfu/mL，各取1 mL置含有1 moL/L硫酸鎂溶液1 mL平皿中（傾注SDA不加中和劑硫酸鎂溶液）。菌液組：不加供試液，不加中和劑，其余同試驗組。供試品對照組：不加菌液，其余同試驗組。中和劑對照組：同菌液組，置含有1 moL/L硫酸鎂溶液1 mL平皿中。同法操作C2系列溶液。結(jié)果見表3。

表3 C液回收比值（n=3）

2.3.5 C1液及C2液方法適用性試驗（薄膜過濾法）

試驗組：取 1∶10（V/V）C1 液 1 mL，加入 pH7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液100 mL的濾器中，濾過，用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液900 mL沖洗，每次100 mL，最后1次沖洗液加入菌落數(shù)小于100 cfu的菌懸液，濾干后取濾膜貼于含有1 moL/L硫酸鎂溶液（中和液）1 mL的TSA預制平板上；同法操作C2系列液。菌液組：不加供試液，不加中和劑，其余同試驗組。供試品對照組：不加菌液，其余同試驗組。中和劑對照組：同菌液組操作，濾干后取濾膜貼于含有1 moL/L硫酸鎂溶液1 mL的TSA預制平板上。平皿法金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌回收比值均為0，表明此3株菌為鹽酸左氧氟沙星片的敏感菌株。薄膜過濾法C1液的回收比值大于C2液，中和劑對照組回收比值（該值=中和劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌數(shù)）大于0.5，說明1 moL/L的硫酸鎂溶液對微生物無毒性，不影響微生物的回收。結(jié)果見表3。

3 討論

微生物試驗結(jié)果易受試驗條件的影響，特別是藥品中含有對微生物生長有抑制作用的成分時影響更顯著[4-5]?？咕愃幤芬志暂^強，同一樣品同一稀釋級均勻分散的供試液和供試液上清液敏感菌株的回收比值不同，抑菌性也不同，前者回收比值比后者低，表明前者抑菌性更強。平皿法中取均勻分散的供試液時所含藥物固體顆粒及藥物含量較上清液多，注皿時可見較多細小的藥物固體顆粒；薄膜過濾法中取均勻分散的供試液時，相比于上清液有較多藥物固體顆粒被截留在濾膜上，不溶性顆粒無法沖洗干凈，抑菌性不易去除，造成回收比值較上清液低。供試液經(jīng)自然靜置后的沉降作用，上清液中藥物含量明顯低于均勻分散的供試液，導致了回收比值的差異。

本試驗中選取3種抗菌藥品進行方法適用性試驗，取均勻分散的供試液進行需氧菌總數(shù)測定時，抑菌性并未去除，原本污染的微生物難以檢出，導致假陰性結(jié)果，表明供試液的制備和取樣直接影響試驗結(jié)果的準確性[6]。

均勻分散的供試液和供試液上清液中非敏感菌株回收比值無明顯差異，表明不同的供試液均不影響非敏感菌株微生物的回收。因此本試驗中選取的1∶10（V/V）均勻分散的供試液或供試液上清液進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定均可，均不影響檢驗結(jié)果的準確性和可靠性。

常用的抗菌藥物有八大類，本試驗中選取了硝咪唑類的甲硝唑片[7]、大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素腸溶片[8]和喹諾酮類的左氧氟沙星片[9]。2015年版《中國藥典（四部）》規(guī)定，供試品有抗菌活性，應盡可能去除或中和，當回收比值大于0.5，方可消除供試品的抑菌活性，常聯(lián)用增加稀釋液、加入中和劑、采用薄膜過濾法等方法[10]。

文獻報道的 β-內(nèi)酰胺類的阿莫西林膠囊[11]、頭孢類的鹽酸頭孢他美酯干混懸劑[12]、大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素微生物限度方法驗證時均取其上清液進行驗證試驗[13]，若取均勻分散的供試液，則不能有效檢出供試品中污染的微生物，導致試驗結(jié)果無法體現(xiàn)污染的真實情況。

綜上所述，抗菌類藥品均勻分散的供試液抑菌性強于供試液上清液。微生物限度檢查時，應按適用性試驗確定的方法制備供試液，以保證檢驗結(jié)果的準確性[14]。