生物工程強(qiáng)化微生物電合成轉(zhuǎn)化CO2的研究進(jìn)展

鄒 龍， 金熠樵， 吳 賢， 黃運(yùn)紅， 龍中兒

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022)

能源短缺、環(huán)境污染和氣候變化等問題已成為當(dāng)今實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展所面臨的重要挑戰(zhàn)。國際能源署(International Energy Agency)發(fā)布的《World Energy Outlook 2015》指出，2013年全球能源需求總量是18 TW，其中化石能源(煤炭、石油、天然氣)約占80%；隨著世界人口增長和工業(yè)化程度提升，全球能源需求預(yù)計(jì)在2040年增長至24～26 TW，屆時(shí)二氧化碳(CO2)排放量將從2013年的32 Gt增長至37～44 Gt。因此，發(fā)展綠色可再生新能源替代傳統(tǒng)化石燃料受到全球格外關(guān)注。近年來，由于諸多的微生物被發(fā)現(xiàn)具有與外界環(huán)境交換電子的能力(即胞外電子傳遞過程)及相關(guān)機(jī)制研究的不斷深入，微生物電化學(xué)系統(tǒng)作為一種新型綠色能源轉(zhuǎn)換體系備受科技界青睞[1-2]，可為能源短缺和環(huán)境退化問題提供新的解決思路和技術(shù)平臺(tái)。

微生物電化學(xué)系統(tǒng)以電活性微生物作為催化劑，依賴于微生物與胞外固相電極間的電子交換，主要包括用于氧化降解有機(jī)廢物并同時(shí)產(chǎn)生電能的微生物燃料電池(Microbial fuel cells，MFCs)[3-5]、用于生物制氫的微生物電解池(Microbial electrolysis cells，MECs)[6]和用于同化CO2生產(chǎn)有機(jī)化合物的微生物電合成(Microbial electrosynthesis，MES)[7-9]等。其中，作為新型電驅(qū)動(dòng)微生物合成技術(shù)，MES中的微生物能夠以電極為電子供體驅(qū)動(dòng)胞內(nèi)代謝，將CO2還原為乙酸、乙醇等有機(jī)化學(xué)制品?？梢?，MES既是可再生儲(chǔ)能技術(shù)(將電能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能)，又是CO2同化固定平臺(tái)，具有十分重要的能源效益和生態(tài)意義。盡管MES的研究近年來取得了較為快速的發(fā)展，但是離實(shí)際應(yīng)用還有以下兩個(gè)關(guān)鍵的瓶頸需要突破：①微生物與電極間的胞外電子傳遞(Extracellular electron transfer，EET)速率較低，尚難以達(dá)到工業(yè)化要求；②產(chǎn)生的有機(jī)化合物主要以C2-化合物為主，品位較低，商業(yè)價(jià)值不高。依賴于現(xiàn)代分子生物學(xué)和現(xiàn)代工程技術(shù)的生物工程可提供解決上述兩個(gè)主要問題的方案，比如優(yōu)化微生物胞外電子傳遞鏈和構(gòu)建高品位化合物的合成代謝途徑。本文將在闡明MES陰極微生物吸收胞外電子機(jī)制的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)綜述近5年生物工程在促進(jìn)微生物電合成轉(zhuǎn)化CO2的策略和研究進(jìn)展，并就今后研究方向進(jìn)行探討。

1 微生物電合成

MES由Nevin等[10]于2010年首次提出，將其定義為微生物(作為生物催化劑)利用電能將CO2還原為多碳有機(jī)化合物的過程。不過，有學(xué)者認(rèn)為利用胞外電極實(shí)現(xiàn)有機(jī)底物的轉(zhuǎn)化或碳鏈延伸的微生物電化學(xué)催化過程也屬于MES的范疇[7]。常見的MES系統(tǒng)(圖1)由陽極室和陰極室組成，兩室被離子交換膜分隔，陽極發(fā)生微生物氧化還原態(tài)無機(jī)/有機(jī)底物或簡單電化學(xué)水解產(chǎn)生電子的反應(yīng)，陰極室中的親電微生物吸收陰極電子還原CO2或其他氧化態(tài)有機(jī)物，從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化過程?？梢?，除了直接以溫室氣體CO2作為碳源這一獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)外，MES所需的能量來源十分豐富，既可以是太陽能和風(fēng)能等可再生能源所衍生的電能，也可以是生物氧化有機(jī)廢物或還原態(tài)的無機(jī)物所產(chǎn)生的生物電能，因而兼具了生態(tài)環(huán)境修復(fù)功能。另外，MES具有很高的能源轉(zhuǎn)換效率，其將電能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能(有機(jī)產(chǎn)物中的化學(xué)鍵能)的效率超過80%[10-12]；將MES與光解水系統(tǒng)整合后，利用光能還原CO2效率可高達(dá)10%，明顯超過許多農(nóng)作物的光能利用率[13]。在MES中研究較多的微生物為自養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌，如Sporomusaovata和Clostridumljungdahlii，它們以CO2作為電子受體，通過Wood-Ljungdahl途徑還原為乙酰-CoA，進(jìn)而產(chǎn)生乙酸等有機(jī)化合物，通常具有較高的產(chǎn)率和電能轉(zhuǎn)化效率[11,14-16]。污水、活性淤泥和沉積物等來源的混合微生物菌群也常用作MES的接種物，相比于純培養(yǎng)物而言，混合接種物的MES運(yùn)行不需要嚴(yán)格的無菌條件，但是其代謝產(chǎn)物專一性較差，不僅會(huì)降低某一特定產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率而且不利于后續(xù)目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化[17]。雖然，由于近幾年在接種物、電極材料和器件等的優(yōu)化改造方面的提升，MES還原CO2生產(chǎn)多碳有機(jī)物的產(chǎn)率得到了顯著提高，比如乙酸的產(chǎn)率可高達(dá)2.48×103M/(d·m3)[18]；但是據(jù)估算，目前MES生產(chǎn)乙酸的能耗和成本均顯著高于傳統(tǒng)的工業(yè)制備方法即甲醇碳基化法[19-20]，尚不具備商業(yè)化的條件。

圖1 微生物電合成系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic of microbial electrosynthesis system

2 陰極微生物胞外電子傳遞機(jī)制

陰極微生物吸收電極上的電子驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)還原(合成)代謝是MES的關(guān)鍵過程，EET速率是MES效率的決定性因素之一。因此，MES陰極EET機(jī)制的解析是提高陰極微生物吸收電極電子速率和實(shí)現(xiàn)MES高產(chǎn)率的基礎(chǔ)。目前，已知的陰極電活性微生物的EET過程可分為兩類[21]：基于電子介體的間接傳遞和基于膜結(jié)合蛋白的直接傳遞(圖2)。

圖2 陰極微生物吸收胞外電子的機(jī)制示意圖Fig.2 Mechanism schematic of extracellular electron transfer in cathodic microorganisms

2.1 間接電子傳遞

間接EET是由外源或內(nèi)源的氧化還原活性小分子物質(zhì)作為可逆電子介體所實(shí)現(xiàn)的微生物與電極間的電子傳遞過程。人工合成的外源電子介體如中性紅和甲基紫精已被證明可以介導(dǎo)陰極微生物胞外電子傳遞，添加甲基紫精或中性紅可將接種梭狀芽胞桿菌ClostridiumtyrobutyricumBAS 7的MES陰極產(chǎn)丁酸的產(chǎn)率提高1.3倍[22]，中性紅可顯著增加MES陰極還原CO生產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸的庫倫效率[23]，它們的引入顯著增加電子交換速率或者通過改變電子流向而調(diào)節(jié)胞內(nèi)還原力(NADH水平)[22,24]。

2.2 直接電子傳遞

直接EET是指不需要依賴任何電子介體，附著在電極上生長的微生物可憑借細(xì)胞外膜或周質(zhì)中的氧化還原蛋白與電極直接接觸而實(shí)現(xiàn)電子交換。目前，關(guān)于陰極電活性微生物直接EET機(jī)制的研究尚較為鮮見，并且主要集中在異化金屬還原菌Geobatersulfurreducens和Shewanellaoneidensis，它們是研究EET機(jī)制的模式菌株，均被證實(shí)具有雙向EET特性(通常將產(chǎn)電微生物輸出胞內(nèi)電子稱為正向EET，親電微生物吸收胞外電子稱為反向EET)。G.sulfurreducens電極生物膜中細(xì)胞在吸收電極電子時(shí)，其編碼細(xì)胞外膜色素蛋白和鞭毛的基因表達(dá)水平要低于輸出電子時(shí)的水平，但是編碼周質(zhì)色素蛋白PCCH的基因在吸收電子時(shí)轉(zhuǎn)錄水平卻較高，而且缺失該基因會(huì)嚴(yán)重抑制電極生物膜吸收胞外電子的能力，然而對(duì)輸出電子過程沒有明顯影響，提示G.sulfurreducens的雙向EET過程可能涉及兩條不同的路徑[31]。與此不同的是，Mtr(CymA-MtrABC/OmcA)途徑被證明同時(shí)參與S.oneidensis的雙向EET過程，其吸收胞外電子的路徑很可能為輸出胞內(nèi)電子的逆轉(zhuǎn)[32]。產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌被報(bào)道可以在相對(duì)高電勢(-0. 4～-0.5 V)下吸收電極電子驅(qū)動(dòng)乙酸或甲烷的合成，由于該電勢條件下不利于電極產(chǎn)生H2作為電子介體，因而推測它們也可能存在直接EET機(jī)制[33-34]，但仍然存在爭議，需要對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。另外，產(chǎn)電微生物還可憑借被稱為“細(xì)菌納米線”的菌毛直接輸出胞內(nèi)電子并實(shí)現(xiàn)較長距離的電子傳遞[35]，但是尚未見“細(xì)菌納米線”介導(dǎo)反向EET過程的報(bào)道。

相比于間接電子傳遞，基于電極與細(xì)胞直接接觸的電子傳遞途徑通常被認(rèn)為具有更快的動(dòng)力學(xué)和更低的能量損耗[36]，但是對(duì)于一個(gè)特定的MES而言，有限的器件和電極尺寸往往無法提供足夠大的接觸面積，從而限制了直接電子傳遞的利用率。另外，在較厚的電極生物膜中，外層微生物細(xì)胞通常比包裹在生物膜內(nèi)部的細(xì)胞具有更高的代謝活力，而直接電子傳遞途徑似乎無法保證其快速交換電子的需求。間接電子傳遞的速率往往依賴于電子介體的濃度，因而可通過提高M(jìn)ES電解液中電子介體的量，實(shí)現(xiàn)快速的EET，但是間接電子傳遞在MES實(shí)際應(yīng)用中面臨著“洗出”及二次環(huán)境污染的問題。通過基因改造或代謝工程手段提高M(jìn)ES中電活性微生物自身產(chǎn)生的內(nèi)源性電子介體的分泌量，或者采用固定化技術(shù)將電子介體控制在電極界面周圍等策略，也許既可以較大提高EET速率，又可有效解決間接電子傳遞在實(shí)際應(yīng)用過程中所面臨的困難。

3 生物工程強(qiáng)化MES策略與應(yīng)用

陰極微生物的胞外電子吸收速率和代謝途徑是決定MES產(chǎn)物及其轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵，理想的MES微生物催化劑不僅需要快速地吸收胞外電極電子并將其與胞內(nèi)還原代謝偶聯(lián)，還需要具備捕獲固定CO2的代謝途徑。但是，具有高EET速率的天然電活性菌(如Geobaterspp.和Shewanellaspp.)通常缺乏還原CO2合成高附加值產(chǎn)物的代謝途徑，而大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)菌一般又不具有EET能力，所以需要通過適當(dāng)?shù)牟呗院褪侄芜M(jìn)行調(diào)控或改造，使兩者有機(jī)整合(圖3)。

圖3 MES陰極微生物特性需求Fig.3 The properties of cathodic microorganisms for MES

3.1 增強(qiáng)胞外電子傳遞能力

近年來對(duì)產(chǎn)電微生物EET分子機(jī)制的研究不斷深入以及基因編輯工具的發(fā)展，在通過基因工程和代謝調(diào)控手段增強(qiáng)天然產(chǎn)電菌EET方面取得了一定研究進(jìn)展[37]。比如，通過過表達(dá)綠膿菌素合成途徑中的甲基轉(zhuǎn)移酶基因phzM，增強(qiáng)了Pseudomonasaeruginosa分泌綠膿菌素(即電子介體)的能力，從而使得該菌株的正向EET能力得到了較大提高[38]。最近，Yang等[39]通過合成生物策略將Bacillussubtilis中編碼核黃素的核心基因簇(ribADEHC)引入S.oneidensisMR-1中進(jìn)行異源表達(dá)，使得其核黃素分泌量提高了25.7倍，顯著增強(qiáng)了核黃素介導(dǎo)的間接電子傳遞，該工程菌雙向胞外電子傳遞速率均得到了10倍以上的提高。另外，Min等[40]通過同源過表達(dá)核黃素合成基因簇(ribDCBAE)和金屬還原酶基因簇(mtrCAB)也使得S.oneidensisMR-1的雙向胞外電子傳遞速率得到了較大提升。通過基因調(diào)控改變細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量水平(NADH/NAD+比值)從而提高正向EET速率在S.oneidensisMR-1和P.aeruginosa等產(chǎn)電菌中也同樣得到實(shí)現(xiàn)[41-42]。盡管已有多種策略可用于提高S.oneidensis等天然電活性菌的正、反向EET過程，但是這些電活菌一般缺乏利用胞外電子合成高附加值產(chǎn)物的代謝途徑。有報(bào)道稱S.oneidensisMR-1可吸收電極電子實(shí)現(xiàn)延胡索酸還原為琥珀酸的過程[32]，但是該反應(yīng)不涉及CO2的同化，并非真正意義上的微生物電合成。

在工業(yè)生產(chǎn)菌中引入外源EET傳遞通路將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娀钚跃?，可能是拓展微生物電化學(xué)技術(shù)應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)高效電驅(qū)動(dòng)微生物合成的重要渠道。Jensen等[43]通過異源表達(dá)色素蛋白MtrCAB編碼基因，在大腸埃希菌(Escherichiacoli)中重塑了S.oneidensisMR-1的部分胞外電子傳遞鏈，使得E.coli還原可溶性Fe3+離子和不溶性α-Fe2O3的速率分別提高了8倍和4倍，實(shí)現(xiàn)了E.coli的胞外電子傳遞過程。在該工程菌中繼續(xù)引入外源CymA蛋白可進(jìn)一步提高E.coli的正向EET速率和細(xì)胞生長量[44]。有研究表明，在E.coli中引入CymA-MtrCAB胞外電子傳遞鏈不僅將電流輸出提高8倍，而且會(huì)對(duì)胞內(nèi)代謝流的分布產(chǎn)生一定影響[45]，這為代謝調(diào)控的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。在E.coli中成功重塑外源胞外電子傳遞通路為開發(fā)具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的電活性生產(chǎn)菌提供了新思路，盡管該領(lǐng)域的研究暫時(shí)聚焦于正向EET途徑，但相信隨著反向EET分子機(jī)制研究的不斷深入，在工業(yè)生產(chǎn)菌中構(gòu)建反向EET通路從而實(shí)現(xiàn)真正意義上的電驅(qū)動(dòng)微生物合成將成為可能。

3.2 調(diào)控胞內(nèi)合成代謝

親電微生物在獲得快速吸收胞外電極電子的基礎(chǔ)上，要實(shí)現(xiàn)高效的微生物電合成還需具備將所吸收的電子轉(zhuǎn)化為還原力驅(qū)動(dòng)胞內(nèi)合成代謝的能力；同時(shí)，反向EET過程所偶聯(lián)的代謝途徑的類型決定了最終的產(chǎn)物種類。模式電活性菌S.oneidensisMR-1除了被證明可利用胞外電子還原延胡索酸生成琥珀酸外，Jeon等[46]研究證實(shí)提供胞外電流還可將S.oneidensisMR-1工程菌(異源表達(dá)Ehrlich途徑中2-酮異戊酸脫羧酶基因kivD和乙醇脫氫酶adh)的異丁醇產(chǎn)量提高近1倍，提示可通過有效的代謝調(diào)控策略將天然電活性微生物改造為產(chǎn)高附加值生物制品的宿主菌。產(chǎn)乙酸菌以CO2作為電子受體的主要產(chǎn)物為C2-化合物乙酸，通過基因工程手段可調(diào)控其胞內(nèi)代謝流從而獲得其他多碳化合物如丙酮、異丙醇和丁酸等(圖4)[47-49]，具有更高的應(yīng)用價(jià)值。產(chǎn)乙酸菌能夠利用Wood-Ljungdahl途徑同化兩個(gè)CO2分子合成一個(gè)乙酰-CoA，乙酰-CoA的代謝流向是決定MES終產(chǎn)物的關(guān)鍵。Ueki等[49]通過基因改造對(duì)C.ljungdahlii進(jìn)行多重代謝調(diào)控，包括引入異源的乙酰-CoA合成丁酸途徑、失活乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇的途徑等，從而使得該菌株能將約50%碳源或70%電子流用于丁酸的生產(chǎn)，說明可通過遺傳改造產(chǎn)乙酸菌的Wood-Ljungdahl途徑從而電化學(xué)合成比乙酸價(jià)值更高的有機(jī)化合物。

化能無機(jī)自養(yǎng)型細(xì)菌Cupriavidusnecator(又名Ralstoniaeutropha)具有豐富多樣的代謝途徑，是生物工程常用宿主菌，也已被成功改造應(yīng)用于MES。Li等[51]將異源異丁醇和3-甲基-1-丁醇生物合成基因?qū)隦.eutrophaH16菌株中，同時(shí)敲除其原有的聚羥基丁酸酯合成途徑，所構(gòu)建的工程菌可在以電能和CO2為唯一能源和碳源的生物電化學(xué)裝置中，利用電化學(xué)還原CO2所產(chǎn)生的甲酸進(jìn)而合成C4-和C5-醇。Grousseau等[50]通過在聚羥基丁酸酯合成能力缺失突變株C.necatorRe2133中過表達(dá)自身的β-酮硫解酶基因phaA和CoA-轉(zhuǎn)移酶基因ctf以及異源表達(dá)Clostridium屬來源的乙酰乙酸脫羧酶基因adc和乙醇脫氫酶基因adh，從而構(gòu)建了能以果糖為唯一碳源的異丙醇生物合成途徑。該工程菌株隨后被應(yīng)用于微生物電化學(xué)裝置中，能以CO2作為碳源，同時(shí)以電化學(xué)產(chǎn)生的H2作為能源，合成滴度高達(dá)216 mg/L的異丙醇[52]。最近，Krieg等[53]的研究表明，在C.necator中引入外源甲戊二羥酸途徑和α-蛇麻烯合成酶，可使該菌株在直接以電極電流作為電子供體和CO2作為電子受體及碳源的條件下合成α-蛇麻烯，每克細(xì)胞干重的α-蛇麻烯產(chǎn)量可高達(dá)17 mg，從而開辟了微生物電合成生產(chǎn)萜烯類物質(zhì)的綠色途徑。因此可以看出，通過巧妙的代謝調(diào)控可實(shí)現(xiàn)多種有機(jī)化合物的微生物電合成，從而解決目前微生物電合成產(chǎn)物(乙酸為主)品位低、商業(yè)應(yīng)用價(jià)值不高的瓶頸。

3.3 構(gòu)建有限的混合微生物群體

單一菌株用于MES的接種物有利于闡述電子傳遞機(jī)制等基礎(chǔ)問題，但是其通常只能實(shí)現(xiàn)一些相對(duì)簡單或單一的物質(zhì)轉(zhuǎn)化。另外，過度的基因改造和代謝修飾往往又會(huì)對(duì)菌株的生長速度、抗性等產(chǎn)生不利影響。有些菌株具有的較好電化學(xué)活性或特殊物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的，但其不清楚的遺傳背景或缺乏相應(yīng)的基因操作手段往往會(huì)限制其在MES中的應(yīng)用潛力。雖然，活性淤泥等天然混合微生物菌群用于MES接種物可實(shí)現(xiàn)多種的電子傳遞過程和較豐富的代謝流，但是其菌群組成復(fù)雜且在MES運(yùn)行過程中不穩(wěn)定，所形成的副產(chǎn)物多，不利于體系的可控運(yùn)行和后續(xù)的產(chǎn)物分離純化。人為構(gòu)建有限的混合微生物群體可能是一種有效的解決方案，通過不同的微生物在該體系中扮演著特定的角色以及它們間的相互關(guān)聯(lián)，不僅可以利用不同的代謝途徑實(shí)現(xiàn)生物合成產(chǎn)物種類的多樣性，還可以提高電子流和物質(zhì)流的速度和可控化進(jìn)程。Marshall等[54]通過分析MES陰極微生物群體的轉(zhuǎn)錄活性和模擬電驅(qū)動(dòng)合成代謝通路，發(fā)現(xiàn)不同菌株在該體系中充當(dāng)不同的生態(tài)位，比如Acetobacterium是群體中主要的固碳者，Sulfurospirillum通過呼吸作用消耗溶液中少量氧氣，而Desulfovibrio被認(rèn)為在電極上產(chǎn)生氫化酶、甲酸脫氫酶和細(xì)胞色素等參與質(zhì)子還原產(chǎn)氫的過程。

氫營養(yǎng)細(xì)菌可高效利用H2作為能源驅(qū)動(dòng)生物合成反應(yīng)，但是它們不能直接從電極吸收電子作為能源或這種能力較弱?；诖?，Deutzmann等[55]將鐵腐蝕菌IS4與Methanococcusmaripaludis或Acetobacteriumwoodii組成有限混合培養(yǎng)群體分別用于產(chǎn)甲烷和產(chǎn)乙酸，其中鐵腐蝕菌IS4從陰極電極吸收電子并產(chǎn)生H2供給M.maripaludis或A.woodii利用，從而實(shí)現(xiàn)CO2的固定。Puig等[28]以Rhodobacter(作為產(chǎn)氫菌)和Clostridium(作為固碳菌)構(gòu)建了電驅(qū)動(dòng)合成有機(jī)酸和醇的有限混合培養(yǎng)菌群，并通過電化學(xué)手段在電極上檢測到Rhodobacter的產(chǎn)氫蛋白，從而進(jìn)一步證實(shí)了生物合成的H2在MES中的關(guān)鍵作用。最近，Xiang等[56]將醋酸桿菌和脫硫弧菌共同接種于MES陰極，發(fā)現(xiàn)在添加6 mmol/L硫酸鹽的條件下乙酸產(chǎn)量和電子捕獲量比未添加硫酸鹽時(shí)分別提高了2.7倍和2.4倍。他們推測，脫硫弧菌還原硫酸根所形成的S2-(如H2S)可能具有電子介體的功能，從而提高了醋酸桿菌吸收陰極電子的能力?？梢姡瑯?gòu)建有限的混合微生物群體在MES中的應(yīng)用，目前主要體現(xiàn)在提高生產(chǎn)菌與電極間胞外電子傳遞(通過電活性菌產(chǎn)生可利用的電子介體)，鮮見通過調(diào)控不同微生物菌株間物質(zhì)代謝流的偶聯(lián)從而拓展終產(chǎn)物種類的報(bào)道。

4 展 望

生物工程的理論和相關(guān)技術(shù)為突破MES兩大瓶頸，即陰極微生物EET速率慢和產(chǎn)品附加值低提供了機(jī)遇，并且在增強(qiáng)EET速率和提高產(chǎn)品合成效率方面取得了一定進(jìn)展，但是要達(dá)到實(shí)際應(yīng)用仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。①M(fèi)ES陰極EET機(jī)理尚不清晰，限制了提高電子傳遞效率的理性設(shè)計(jì)。盡管對(duì)于電活性模式菌株S.oneidensis和G.sulfurreducens的正向EET過程有相對(duì)清楚的理解，但是對(duì)其反向EET過程的分子機(jī)制的研究卻不夠深入。然而這些模式菌株并非MES宿主菌的最佳選擇，對(duì)MES陰極親電微生物(包括Sporomusa屬和Clostridum屬)的吸收胞外電子機(jī)理、電生理特征和能量代謝模式知之甚少，不利于MES宿主菌的遺傳改造和代謝調(diào)控。②MES陰極微生物吸收胞外電子與胞內(nèi)代謝的偶聯(lián)機(jī)制不清楚。電合成宿主菌如何將所吸收的胞外電子與胞內(nèi)能量代謝匹配關(guān)聯(lián)，這是實(shí)現(xiàn)MES的能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，其關(guān)聯(lián)模式?jīng)Q定了MES合成的產(chǎn)物種類和能量轉(zhuǎn)化效率，也是實(shí)現(xiàn)MES全局調(diào)控的分子基礎(chǔ)。③可用基因工具箱有限，缺乏精準(zhǔn)、高效的定量分析手段，限制了MES宿主菌開發(fā)利用的廣度和深度，難以獲得高附加值產(chǎn)品的高效生產(chǎn)。

針對(duì)MES發(fā)展所面臨的上述問題，建議在今后研究過程中應(yīng)著重從以下幾方面入手。①加快基因組工具箱的開發(fā)，深入研究MES陰極EET的分子機(jī)制?；蚬ぞ呤巧钊胙芯课⑸顴ET過程并對(duì)其進(jìn)行分子改造的基礎(chǔ)，缺乏可用的基因操作工具箱通常是限制電活性微生物研究的重要原因。②利用系統(tǒng)生物學(xué)綜合分析MES宿主菌EET路徑及其組裝和調(diào)控機(jī)制、物質(zhì)與能量代謝偶聯(lián)機(jī)制等，挖掘代謝調(diào)控改造的靶位，實(shí)現(xiàn)全局調(diào)控策略。EET過程以及胞內(nèi)物質(zhì)能量代謝途徑是相對(duì)復(fù)雜的非線性生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，需要從細(xì)胞整體水平和分子水平進(jìn)行綜合分析，因此需要高度整合組學(xué)技術(shù)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等)和各種定量定性分析技術(shù)(電化學(xué)分析、同位素示蹤、質(zhì)譜學(xué)、原位分析手段等)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，并結(jié)合數(shù)學(xué)模型進(jìn)行功能預(yù)測分析，深入挖掘調(diào)控位點(diǎn)和重要反應(yīng)途徑。③研究MES宿主菌能量代謝流(所吸收的胞外電子)和物質(zhì)代謝流(CO2固定途徑)的耦合關(guān)系，通過相關(guān)途徑的改造與調(diào)控使電子流向特定產(chǎn)物合成，實(shí)現(xiàn)能量的高效利用。④研究MES內(nèi)部環(huán)境(包括電極材料)和操作條件對(duì)宿主菌能量和物質(zhì)代謝的影響，為開發(fā)高性能電極材料和選擇最佳操作參數(shù)奠定基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)工程化應(yīng)用。