EGCG通過PI3-K/Akt信號通路誘導(dǎo)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1增殖和凋亡的影響

趙星智， 胡新華

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血管甲狀腺外科，遼寧 沈陽 110001)

近年來，我國腫瘤患者的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，已成為影響國民身體健康的主要疾病之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌癥最常見的一種，患者的病情發(fā)展緩慢，惡性程度低，因此常常易于忽視，但卻存在較高的轉(zhuǎn)移甚至死亡的風(fēng)險[2-3]。對于腫瘤的治療，目前主要是以手術(shù)為主，但在實際治療中都具有明顯的局限性，因此大量研究致力于甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)防和新藥的研發(fā)。茶飲是我國傳統(tǒng)文化的一部分，有跡象顯示飲茶能夠顯著降低直腸癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌癥的發(fā)生[4-5]，近代藥理研究表明綠茶中富含的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallo-catechingallate，EGCG)是其發(fā)揮抗癌防癌活性的主要原因，近年來EGCG抗腫瘤活性研究引起研究者的廣泛關(guān)注[6-7]，但關(guān)于EGCG在甲狀腺乳頭狀癌預(yù)防和治療的研究鮮有報道，本文主要研究EGCG通過PI3-K/Akt信號通路對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1凋亡的影響，探索其可能的作用機制，為今后EGCG在臨床抗癌防癌應(yīng)用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 EGCG購自Sigma公司，人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1細(xì)胞購自ATCC。

1.1.2 試劑 達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、MTT、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶等(上海生工生物股份有限公司)；胎牛血清、Annexin V-FITC/PI試劑盒、PI試劑(杭州四季青生物工程材料有限公司)；PI3-K、Akt/p-Akt、mTOR、cyclic D1、CDK4、Bcl-2/Bad、cleaved-caspase-3、β-actin、蛋白抑制劑等(Santa Cruz公司，美國)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG(Thermo公司，美國)；細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑及其他試劑、耗材(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(SanYo公司，日本)；XD-202倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)；DNM-9606酶標(biāo)分析儀(北京朗普新技術(shù)有限公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；濕轉(zhuǎn)儀(AB公司，美國)；電泳儀(Bio-red，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(DNR公司，以色列)；其他儀器購自德國eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEN高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2恒溫恒濕。隔天換液1次，細(xì)胞融合度達到75%以上，3次傳代后進行實驗檢測。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制作用 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/mL，100 μL/孔接種于96孔板，37 ℃、5% CO2下過夜培養(yǎng)(約16 h)，實驗前2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理2 h。培養(yǎng)基進行EGCG稀釋，濃度為目標(biāo)濃度的2倍，每孔加入100 μL稀釋藥物，終濃度為5、10、20、40、80 μg/mL，對照孔只加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h，棄盡孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，沉淀完全溶解后，用酶標(biāo)分析儀測定490 nm波長下各孔的OD值。細(xì)胞抑制率(%)=((對照孔A490平均值-各藥物處理孔A490平均值)/對照孔A490平均值)×100%。實驗重復(fù)檢測3次，計算半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/mL，2 mL接種于6孔板，37 ℃、5% CO2下過夜培養(yǎng)(約16 h)。用孔內(nèi)培養(yǎng)基直接稀釋EGCG至20、50、80 μg/mL、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)處理48 h。離心收集細(xì)胞于上樣管，用預(yù)冷的75%乙醇4 ℃條件下固定30 min，PBS清洗后重懸加入PI溶液終濃度為50 mg/L；室溫暗室孵育30 min。加PBS至500 μL混勻過300目篩，30 min內(nèi)上機檢測分析細(xì)胞周期情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/mL，2 mL接種于6孔板，37 ℃、5% CO2下過夜培養(yǎng)(約16 h)。用孔內(nèi)培養(yǎng)基直接稀釋EGCG至20、50、80 μg/mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)處理48 h。離心收集細(xì)胞于上樣管，按照 Annexin V-FITC試劑盒說明書向每管中依次加入150 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，3 μL Annexin V-FITC和2 μL PI染液重懸細(xì)胞，室溫暗室孵育15 min。加PBS至500 μL混勻過300目篩，30 min內(nèi)上機檢測，Cell Quest軟件檢測分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 細(xì)胞蛋白表達檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/mL，2 mL接種于6孔板，37 ℃、5% CO2下過夜培養(yǎng)(約16 h)。次日用孔內(nèi)培養(yǎng)基直接稀釋EGCG至20、50、80 μg/mL，處理細(xì)胞48 h后，PBS清洗1次，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管，細(xì)胞裂解液冰浴裂解30 min。取上清，酶標(biāo)儀490 nm波長蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，4 ℃條件依次加入封閉液孵育2 h，一抗孵育過夜(稀釋比例均為1∶1 000)，二抗孵育2 h(稀釋比例均為1∶5 000)。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶，蛋白表達定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，內(nèi)參采用β-actin。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1增殖的影響

不同濃度的EGCG處理人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1，通過MTT法檢測人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1的增殖活性。結(jié)果顯示不同劑量的EGCG分別作用24、48、72 h，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為(68.97±5.62)、(51.95±4.78)、(34.355±4.21) μg/mL，差異統(tǒng)計學(xué)分析有意義(P<0.001)。EGCG處理K1細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示隨著藥物濃度增加，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；表明EGCG能夠?qū)θ思谞钕偃轭^狀癌細(xì)胞K1產(chǎn)生劑量、時間依賴性的增殖抑制作用，見圖1。

2.2 EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測不同劑量的EGCG處理人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞48 h分析對凋亡影響，結(jié)果顯示：隨著藥物作用時間的增加，與對照組相比，G1期細(xì)胞比例顯著增加，進入S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)，同時當(dāng)EGCG劑量達到50 μg/mL時，在G1期出現(xiàn)一個亞二倍體凋亡峰(P<0.05)，預(yù)示著EGCG可能具有誘導(dǎo)K1細(xì)胞凋亡的作用；當(dāng)EGCG劑量達到80 μg/mL時，基本不存在G2/M期細(xì)胞。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG劑量的增加，甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞中Cyclin D1和CDK4蛋白的表達量顯著降低，且呈顯著劑量依賴，差異統(tǒng)計學(xué)分析有意義(P<0.05)，表明EGCG能夠通過下調(diào)Cyclin D1和CDK4蛋白表達，將K1細(xì)胞阻滯在G1期，見圖2。

圖1 MTT檢測EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of EGCG on proliferation of human papillary thyroid carcinoma cell line K1 detected by MTT

2.3 EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測劑量EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1凋亡影響，結(jié)果顯示：與對照組比，隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞凋亡總量逐漸增加，當(dāng)EGCG的劑量為20 μg/mL時，凋亡細(xì)胞量為(32.48±2.51)% (P<0.001)；當(dāng)EGCG的劑量達到50 μg/mL和80 μg/mL時，人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1的凋亡率分別為(47.62±2.57)% (P<0.001)和(59.34±2.79)%(P<0.001)；組間比較差異統(tǒng)計學(xué)分析有意義(F=64.672，P<0.001)。通過Westernblot對相關(guān)凋亡蛋白表達量檢測發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG劑量的增加，K1細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低，促凋亡蛋白Bad和cleaved-caspase-3的表達量明顯增高(P<0.05)，且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，組間差異統(tǒng)計學(xué)分析有意義(P<0.05)。表明EGCG能夠通過調(diào)控凋亡蛋白的表達量，誘導(dǎo)K1細(xì)胞的凋亡，見圖3。

圖2 EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Effects Of EGCG on cycle and related protein expression of human thyroid papillary carcinoma K1 cellsA：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；B：不同細(xì)胞周期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)；C：不同蛋白的Westernblot結(jié)果圖；D：蛋白定量分析；與對照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，下圖同A：Flow cytometry for cell cycle detection；B：Percentage of cells in different cell cycle；C：Westernblot results of different proteins；D：Proteins quantitative analysis；Compared with control group，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001,same the following Figure

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析EGCG對K1細(xì)胞的凋亡作用Fig.3 Apoptosis of K1 cells was analyzed by flow cytometry (EGCG)

2.4 EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1蛋白表達的影響

通過Westernblot分析EGCG對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1的蛋白表達影響，結(jié)果顯示：與對照組相比，EGCG處理后人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞對AKT蛋白的表達量無影響(P>0.05)，而PI3-K表達和p-AKT的表達隨著EGCG劑量的增加，表達量顯著降低(P<0.05)；同時下游調(diào)控蛋白m TOR的表達也明顯受到抑制(P<0.05)，組內(nèi)差異統(tǒng)計學(xué)分析有意義(P<0.05)。表明EGCG能夠通過PI3-K/AKT信號通路調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能，見圖4。

圖4 Westernblot檢測蛋白表達及分析Fig.4 Expression and analysis of protein detected by WesternblotA：PI3-K/AKT相關(guān)蛋白Westernblot分析結(jié)果；B：蛋白定量分析A：Westernblot analysis results of PI3-K/AKT related protein；B：Proteins quantitative analysis

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌是最常見、惡性度最低的甲狀腺癌，約占甲狀腺癌的85%。該疾病病程發(fā)展緩慢，因而難以做到早期的診斷和治療，統(tǒng)計顯示甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率呈逐年增加趨勢。由于甲狀腺乳頭狀癌對放射線外照射及化療不敏感，手術(shù)治療存在很大副反應(yīng)，且影響美觀，因此尋求針對甲狀腺乳頭狀癌新的治療方法顯得十分迫切。有研究顯示在喜歡飲茶的東亞地區(qū)，部分癌癥如前列腺癌、直腸癌等的發(fā)病率顯著低于其他地區(qū)，這可能與該地區(qū)的茶飲文化相關(guān)，綠茶含有豐富的茶多酚，主要成分是表沒食子兒茶素沒食子酸酯，研究指出EGCG能夠?qū)Πㄆつw癌、乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥具有顯著的抗腫瘤作用；通過構(gòu)建腫瘤模型裸鼠，表明EGCG對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移發(fā)揮明顯的抑瘤作用[8]，目前關(guān)于EGCG對甲狀腺乳頭狀癌的治療及作用機制鮮有報道。因此本文主要研究EGCG通過PI3-K/Akt信號通路誘導(dǎo)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1增殖和凋亡的影響。

本研究結(jié)果顯示，通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，EGCG分別作用24、48、72 h，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1的半數(shù)抑制濃度IC50值顯著降低(P<0.05)，同時隨著劑量增加，細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.01)，表明EGCG能夠?qū)θ思谞钕偃轭^狀癌細(xì)胞K1產(chǎn)生劑量、時間依賴性的增殖抑制作用。引起細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制的途徑有很多，主要包括周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡和自噬等。其中細(xì)胞周期是一個完整而又復(fù)雜的系統(tǒng)，受到多種調(diào)節(jié)因子和蛋白的調(diào)控，其中主要是細(xì)胞周期素(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKIs)，其中cyclins起正調(diào)控作用，CKIs為負(fù)調(diào)控因子。在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過程中，Cyclin Dl與CDK4首先結(jié)合形成復(fù)合體，同時激活抑癌基因pRb的表達及磷酸化，從而促進細(xì)胞的增殖[9-11]。腫瘤細(xì)胞由于cyclin Dl與CDK4的高表達，縮短G1期促使細(xì)胞提前進入S期導(dǎo)致自身增殖失控。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)研究EGCG對K1細(xì)胞周期影響，結(jié)果顯示，隨著EGCG劑量的增加，G1期細(xì)胞比例顯著上升，而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯降低。通過Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG劑量增加，Cyclin Dl與CDK4蛋白表達量呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性降低(P<0.05)，這表明EGCG可能是通過抑制Cyclin Dl與CDK4的表達，將K1細(xì)胞阻滯于G1期。

在研究EGCG對K1細(xì)胞周期影響時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)EGCG的劑量達到50 μg/mL時，在G1期出現(xiàn)一個亞二倍體凋亡峰；劑量達到80 μg/mL時，亞二倍體凋亡峰顯著增高，由于亞二倍體峰凋亡峰往往出現(xiàn)在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，其比例反映了細(xì)胞凋亡的程度[12]，預(yù)示著EGCG可能對K1細(xì)胞存在誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分析EGCG對K1細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，隨著劑量的增加，人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1的凋亡率顯著增加(P<0.05)。由于細(xì)胞凋亡往往涉及凋亡信號的傳遞及相關(guān)蛋白表達，其中caspase家族和Bcl-2家族蛋白作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要蛋白[13-15]，caspase-3作為caspase家族的主要成員，其在細(xì)胞信號的傳遞和凋亡執(zhí)行中具有重要作用，當(dāng)細(xì)胞進入凋亡程序，抑凋亡蛋白Bcl-2顯著降低，促凋亡蛋白Bad的表達明顯升高，放大凋亡信號并進一步通過caspase-9的活化激活caspase-3蛋白活性并執(zhí)行細(xì)胞凋亡，而凋亡信號一旦激活caspase-3，細(xì)胞凋亡將進入不可逆的狀態(tài)[16-17]。本研究通過Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG劑量的增加，K1細(xì)胞抑凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯降低，而促凋亡蛋白Bad和cleaved-caspase-3的表達量顯著增加。表明EGCG能夠通過調(diào)控凋亡蛋白的表達量，誘導(dǎo)人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的凋亡。

PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、分化、生存中扮演著十分重要的角色[18-19]，在PI3K信號通路中，AKT的磷酸化是整個信號傳遞過程的核心，上游PI3k蛋白的表達能夠調(diào)控AKT的磷酸，從而抑制Bcl-2家族蛋白Bad的活化，阻礙細(xì)胞凋亡[20]；同時活化下游蛋白mTOR的表達，參與細(xì)胞生長及能量代謝[21]。本研究發(fā)現(xiàn)EGCG對K1細(xì)胞總AKT蛋白的表達量沒有變化，但能夠降低PI3K蛋白的表達量并抑制ATK蛋白的磷酸化，進一步下調(diào)mTOR蛋白的表達量(P<0.05)。這表明EGCG能夠通過下調(diào)PI3K蛋白的表達，抑制AKT的磷酸化，通過調(diào)控Bad蛋白的表達誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時通過降低mTOR蛋白表達量，抑制細(xì)胞的能量代謝途徑，實現(xiàn)對K1細(xì)胞的增殖抑制。由于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡存在多種信號傳遞途徑，而EGCG是否能夠同時激活多條信號通路，共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，值得后續(xù)研究探討。

綜上所述，EGCG能夠通過PI3-K/Akt信號通路，下調(diào)PI3-K蛋白表達，抑制AKT蛋白磷酸化和mTOR表達，同時下調(diào)cyclin D1、CDK4、Bcl-2的表達，促進Bad表達及caspase-3 蛋白活化，誘導(dǎo)G1阻滯及細(xì)胞凋亡，抑制人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1增殖。