大種量流加式高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵工藝的研究

吳 杰 ， 王 團(tuán) ， 王 柯 ， 張建華 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

我國(guó)從2002年起開(kāi)始大力發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)，生產(chǎn)技術(shù)不斷提高，產(chǎn)量也已躍居為全球第三位[1]。但是，常濃度乙醇生產(chǎn)工藝存在發(fā)酵濃度低，能耗高和設(shè)備利用率低，污染嚴(yán)重等問(wèn)題，制約了行業(yè)的發(fā)展[2]。而高濃度乙醇發(fā)酵 （Very high gravity，VHG）工藝的提出有望解決這些問(wèn)題[3]。該工藝可有效提高設(shè)備利用率和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)能耗和廢水處理負(fù)荷[4]。

在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，乙醇發(fā)酵主要采用間歇式工藝，發(fā)酵的酒度一般在10%~11%（體積分?jǐn)?shù)）。簡(jiǎn)單提高發(fā)酵酒度的后果是殘?zhí)巧仙矸劾寐氏陆?。由于乙醇生產(chǎn)中，原料成本占直接生產(chǎn)成本的80%以上，淀粉利用率降低直接導(dǎo)致乙醇生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益降低，這也是國(guó)內(nèi)乙醇高濃度發(fā)酵一直沒(méi)有能夠很好推廣的主要原因。造成殘?zhí)巧仙?，淀粉利用率下降的主要原因是，發(fā)酵前期的高濃度底物（葡萄糖）和發(fā)酵后期的高濃度產(chǎn)物（乙醇）會(huì)對(duì)釀酒酵母產(chǎn)生抑制作用，降低釀酒酵母吸收營(yíng)養(yǎng)的能力。另外，高濃度乙醇還會(huì)改變酵母的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其通透性，導(dǎo)致發(fā)酵延遲或者提前終止，進(jìn)而造成殘?zhí)歉?、淀粉利用率低[5-7]。因此，學(xué)者們主要從酵母改造和工藝優(yōu)化2個(gè)方面來(lái)解決這一問(wèn)題。申乃坤等

[8]通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定主要因素為淀粉酶用量、底物濃度、初始發(fā)酵pH，并采用響應(yīng)面優(yōu)化研究主要因素的相互影響，并通過(guò)對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行梯度降溫，最終使發(fā)酵后酒度在16.24%（體積分?jǐn)?shù)），殘總糖控制在18.8 g/L。唐艷艷等[9]在研究高濃發(fā)酵過(guò)程發(fā)現(xiàn)，采用先糖化再發(fā)酵工藝會(huì)抑制酵母發(fā)酵，提出采用邊糖化邊發(fā)酵工藝有效解決了高濃發(fā)酵糖濃過(guò)高問(wèn)題，發(fā)酵效率明顯提高。LIU等[10]通過(guò)向發(fā)酵液中添加水溶性聚乙二醇，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)可以對(duì)酵母形成外保護(hù)，達(dá)到提高細(xì)胞活力和乙醇產(chǎn)量的效果。WANG等[11]通過(guò)基因工程改造的手段獲得胞內(nèi)積聚高濃海藻糖酵母菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株在高濃發(fā)酵工程中的細(xì)胞活力和發(fā)酵能力明顯高于出發(fā)菌株，并揭示了高濃乙醇發(fā)酵過(guò)程中海藻糖對(duì)酵母的保護(hù)作用。WANG等[12]通過(guò)計(jì)算獲得了高濃酒精發(fā)酵氮源及其他微量物質(zhì)的用量。ZHANG等[13]通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化和多元回歸分析降低了以紅薯為原料高濃酒精發(fā)酵醪的粘度。潘豐等[14]通過(guò)設(shè)計(jì)發(fā)酵過(guò)程乙醇濃度在線監(jiān)控設(shè)備，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度反饋流加方式對(duì)于提高發(fā)酵效果有明顯幫助。

我們提出了大種量流加式來(lái)解決傳統(tǒng)間歇式高濃度乙醇發(fā)酵工藝存在的問(wèn)題。該工藝是在間歇式發(fā)酵前期將部分糖液接種培養(yǎng)一定時(shí)間，以提高發(fā)酵液中酵母數(shù)量，再流加剩余的糖液，這樣可縮短發(fā)酵體系中酵母生長(zhǎng)的延滯期，加快產(chǎn)物合成速度[15]。在流加剩余糖液時(shí)，可通過(guò)控制流加速度，避免發(fā)酵體系出現(xiàn)糖濃度過(guò)高的問(wèn)題。同時(shí)，新鮮的糖液擴(kuò)大了發(fā)酵體系，降低了發(fā)酵液中的乙醇濃度[16]。本文作者對(duì)大種量流加式高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵工藝中的接種量（體積分?jǐn)?shù)）、初始接種時(shí)間、流加時(shí)長(zhǎng)和流加方式進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了大種量流加式高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵的最優(yōu)工藝，并對(duì)其機(jī)理作初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母（S.cerevisiae）：湖北宜昌安琪酵母有限公司產(chǎn)品；木薯：江蘇金茂源生物化工有限責(zé)任公司產(chǎn)品；耐高溫α-淀粉酶（136000 U/mL）和糖化酶（10000 U/mL）：無(wú)錫杰能科生物工程有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純市售商品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉 8.5，MgSO4·7H2O 0.1，NH4Cl 1.3，CaCl20.06。 培養(yǎng)條件：搖床培養(yǎng)，200 r/min，30 ℃，17.5 h。

木薯培養(yǎng)基：不同料水比的液化液，添加尿素和糖化酶。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖 50，MgSO4·7H2O 0.75，KH2PO41.7，CaCl20.06。

高糖培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖質(zhì)量濃度分別為180、230、260、290 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

高乙醇培養(yǎng)基（g/L）：乙醇質(zhì)量濃度分別為0、38、75、110的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均pH自然，115℃滅菌15 min。

1.2.2 液化液制備 分別按 1∶3、1∶2.7、1∶2.5、1∶2.3、1∶2（g∶L）5 個(gè)料水比將木薯粉（過(guò) 50 目篩子，平均粒徑0.22 mm）與去離子水混合，用氫氧化鈉或硫酸溶液將料液pH調(diào)節(jié)至5.5，加入耐高溫α-淀粉酶（15 U/g木薯粉）。加熱至88℃，維持100 min。冷卻至室溫，添加去離子水補(bǔ)充液化過(guò)程水分的損失。

1.2.3 乙醇發(fā)酵 間歇式乙醇發(fā)酵：將不同料水比液化液各取900 mL裝入3 L的三角瓶中，加入糖化酶 （180 U/g木薯粉）、種子培養(yǎng)基 （體積分?jǐn)?shù)為10%）和尿素（450 mg/L）啟動(dòng)乙醇發(fā)酵。30℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵50 h。

大種量流加式高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵 （料水比1 g∶2 L）： 分別將 100、200、300 mL 料水比為 1 g∶2 L的液化液分裝到3 L的三角瓶中，加入糖化酶（180 U/g木薯粉）、種子培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)10%）和尿素（450 mg/L），30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 2、8、12 h后，分別將800、700、600 mL 液化液，加入糖化酶（180 U/g 木薯粉）和尿素（450 mg/L），用 10、20、30 h 按勻速，梯度加速，梯度減速3種方式流加到裝有不同體積發(fā)酵液的3 L的三角瓶中。30℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵50 h。

1.2.4 分析方法 還原糖和總糖質(zhì)量濃度采用采用菲林試劑滴定法測(cè)定[17]。糊精質(zhì)量濃度測(cè)定是將發(fā)酵液離心（10000g，10 min），測(cè)定上清液中的殘總糖（清液殘總糖）質(zhì)量濃度，減去發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度即為糊精質(zhì)量濃度。乙醇、葡萄糖采用高效液相色譜法（HPLC，Dionex，U-3000，USA）測(cè)定。色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm，Hercules，CA）；RI 檢測(cè)器 （Shodex RI-101，Japan）和UV檢測(cè)器 （Dionex，USA）；流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸；柱溫65℃；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。 樣品預(yù)處理：發(fā)酵液離心（10000g，10 min）后，上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾，取濾液用于HPLC分析。酵母細(xì)胞數(shù)采用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同料水比對(duì)間歇式乙醇發(fā)酵的影響

分別用料水比為 1∶3、1∶2.7、1∶2.5、1∶2.3、1∶2 （g∶L）的液化液進(jìn)行乙醇發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，隨著拌料質(zhì)量濃度的增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)明顯上升，但與此同時(shí)發(fā)酵結(jié)束后的殘總糖質(zhì)量濃度也隨之增加。當(dāng)料水比為1 g∶2 L時(shí)，酒度高達(dá)15.8%（體積分?jǐn)?shù)），而殘總糖質(zhì)量濃度也增至22 g/L。通過(guò)對(duì)殘總糖的構(gòu)成分析發(fā)現(xiàn)（圖1），隨著拌料質(zhì)量濃度的增加，殘還原糖和殘糊精也不斷增加。殘還原糖質(zhì)量濃度的增加說(shuō)明，隨著拌料質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵后期酵母活力逐步下降，耗糖能力隨之減弱，這主要是由于在高的拌料質(zhì)量濃度下，釀酒酵母出現(xiàn)了較強(qiáng)的底物（葡萄糖）和產(chǎn)物（乙醇）抑制作用[18]。殘糊精質(zhì)量濃度的增加說(shuō)明，隨著拌料質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵過(guò)程糖化酶的活力降低，抑制了糖化過(guò)程。

表1 不同料液比間歇式乙醇發(fā)酵效果Table 1 Effect of different material-water ratio on batch ethanol fermentation

圖1 不同料液比間歇式乙醇發(fā)酵液中，殘還原糖、殘糊精的質(zhì)量濃度Fig.1 Concentrations of residual reducing sugar and residue dextrin in the batch ethanol fermentation with different material-water ratio

2.2 大種量流加式高濃乙醇發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.2.1 接種量對(duì)發(fā)酵的影響 目前，實(shí)際生產(chǎn)中主要采用同步糖化發(fā)酵工藝。在高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母的延滯期較長(zhǎng)，在此過(guò)程，料液中糊精被糖化釋放出大量葡萄糖，會(huì)抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)與繁殖。這一問(wèn)題可通過(guò)在發(fā)酵前期添加部分糖液后培養(yǎng)一定時(shí)間，作為含有較高酵母數(shù)量的種子來(lái)解決。本文作者選擇料水比為1 g∶2 L，將種子分別擴(kuò)培到發(fā)酵體積的20%、30%、40%，培養(yǎng)8 h后將剩余料液通過(guò)10 h勻速流加到發(fā)酵瓶中。發(fā)酵過(guò)程及結(jié)束后的總糖及還原糖如圖2與表2所示。Puligundla等[18]報(bào)道，高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵過(guò)程中的高糖質(zhì)量濃度和高乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響發(fā)酵效果的主要因素，因此應(yīng)選擇較低的糖質(zhì)量濃度作為工藝優(yōu)化的目標(biāo)。當(dāng)接種量為20%時(shí)，初始糖質(zhì)量濃度很低，但是開(kāi)始流加糖液后，發(fā)酵液中的糖質(zhì)量濃度迅速上升。這是因?yàn)榻臃N量過(guò)小，新流加的糖不能被迅速消耗，造成糖的積累。接種量30%，40%時(shí)，發(fā)酵液中總糖質(zhì)量濃度增長(zhǎng)緩慢，但是接種量40%的還原糖質(zhì)量濃度明顯高于接種量30%的。從糖醇轉(zhuǎn)化率和殘?zhí)莵?lái)看，經(jīng)過(guò)50 h發(fā)酵后，接種量為20%、30%、40%的糖醇轉(zhuǎn)化率、清液殘總糖分別為 89.1%、90.5%、90.3%和 10.8、8.8、10.3 g/L。 因此，接種量為30%更適合大種量流加式高濃乙醇發(fā)酵過(guò)程。

圖2 不同接種量流加發(fā)酵過(guò)程中的總糖和還原糖變化情況Fig.2 Changeoftotalsugarand reducing sugar concentration in fed batch ethanol fermentation with different inoculum concentration

表2 不同大種量流加式發(fā)酵工藝對(duì)高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵效果的影響Table 2 Effect of different massive inocula fed-batch processes on very high gravity ethanol fermentation

2.2.2 初始流加時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響 合適的數(shù)量及出芽率的酵母能快速地將發(fā)酵液中的糖轉(zhuǎn)化為乙醇，確保較高的糖醇轉(zhuǎn)化率。圖3是在料水比為1 g∶2 L，30%接種量下，酵母培養(yǎng)過(guò)程中的酵母數(shù)及出芽率情況。接種后第0~2 h，酵母處于延滯期，酵母增殖緩慢；在第2~10 h，酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酵母迅速增殖；第10 h后，酵母進(jìn)入平穩(wěn)期，酵母數(shù)基本維持不變。分別選擇接種后的第2、8、14 h研究初始流加時(shí)間對(duì)大種量流加發(fā)酵的影響。發(fā)酵過(guò)程中總糖及還原糖質(zhì)量濃度如圖4所示，在接種后2 h開(kāi)始流加糖液，流加過(guò)程中總糖和還原糖一直維持在220 g/L和105 g/L左右。在接種后8 h開(kāi)始流加糖液，流加前5 h的總糖和還原糖一直維持在150 g/L和75 g/L左右。在接種后14 h開(kāi)始流加糖液，流加過(guò)程中總糖和還原糖分別從75 g/L上升到150 g/L和25 g/L上升到75 g/L。從發(fā)酵效果來(lái)看 （表2），初始流加時(shí)間為第2、8、14 h下的發(fā)酵后的糖醇轉(zhuǎn)化率分別為89.8%、90.5%、90%，清液殘總糖分別為10.7、7.2、10.6 g/L。因此，選擇初始流加時(shí)間為接種后的第8 h。

圖3 種子培養(yǎng)過(guò)程中的酵母數(shù)及出芽率變化情況Fig.3 Change of yeast number and budding rate in the process of seed cultivation

圖4 不同初始接種時(shí)間下，流加發(fā)酵過(guò)程中的總糖和還原糖變化情況Fig.4 Changeoftotalsugarand reducing sugar concentration in fed-batch fermentation with different initial inoculation time

2.2.3 流加時(shí)長(zhǎng)對(duì)發(fā)酵的影響 接種量為30%，種子培養(yǎng)8 h后，將剩余料液分別通過(guò)5、10、20、30 h勻速流加到發(fā)酵體系中。發(fā)酵過(guò)程中的糖變化情況及發(fā)酵結(jié)果如圖5和表2所示。從發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度變化情況來(lái)看，流加時(shí)長(zhǎng)為5 h或10 h，總糖出現(xiàn)明顯的積累現(xiàn)象，還原糖維持在100 g/L左右；流加時(shí)長(zhǎng)為20 h，流加過(guò)程中的總糖迅速下降，還原糖也逐步降低，流加結(jié)束后的總糖和還原糖在120 g/L和60 g/L左右；流加時(shí)長(zhǎng)為30 h，在發(fā)酵后期出現(xiàn)糖累積上升的情況。這說(shuō)明流加時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，料液補(bǔ)加較慢，導(dǎo)致酵母在25 h左右處于缺少糖的狀態(tài)，發(fā)酵50 h后酒度和殘?zhí)侨匀缓芨?。從發(fā)酵效果來(lái)看，流加時(shí)長(zhǎng)5、10、20、30 h發(fā)酵后的糖醇轉(zhuǎn)化率分別為90.2%、90.5%、91.7%、85.5%，清液殘總糖分別11.0、10.6、6.9、13.8 g/L。 因此，選擇流加周期為 20 h最為適宜。

圖5 不同流加時(shí)長(zhǎng)下，流加發(fā)酵過(guò)程中的總糖和還原糖變化情況Fig.5 Changeoftotalsugarand reducing sugar concentration in fed batch fermentation with different feeding duration

2.2.4 流加方式對(duì)發(fā)酵的影響 30%接種量，種子培養(yǎng)8 h后，將剩余料液在20 h內(nèi)分別采用勻速、梯度減速和梯度加速流加到發(fā)酵瓶中。其中勻速流加以35 mL/h的速度流加；梯度加速流加按18、27、35、44、53 mL/h 流加；梯度減速速流加按 53、44、35、27、18 mL/h流加，每個(gè)流速流加4 h。發(fā)酵過(guò)程中的糖質(zhì)量濃度變化及發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖6和表2。流加發(fā)酵前期，采用勻速和加速流加，總糖質(zhì)量濃度維持在150 g/L左右。發(fā)酵前期流加速率稍慢，確保補(bǔ)充的糖能被酵母利用。在流加后期，隨著發(fā)酵體系逐漸擴(kuò)大，此刻流加速度變大不會(huì)再導(dǎo)致糖積累。相反的，糖液的快速補(bǔ)充反而可以稀釋發(fā)酵液中的乙醇，從而延緩高體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)酵母的脅迫作用。而減速流加方式補(bǔ)糖則會(huì)糖積累。從表2可知，勻速、加速和減速3種流加方式后的酒度分別為91.7%、91.5%、90.5%， 清液殘總糖分別 6.9、6.9、7.5 g/L。從發(fā)酵過(guò)程及發(fā)酵結(jié)束后的情況分析可知，流加過(guò)程中采用勻速或加速流加策略均適于高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵。但是考慮到操作的簡(jiǎn)便性，選擇勻速流加方式更加合理。

2.3 大種量流加式與間歇式高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵工藝對(duì)比及優(yōu)勢(shì)分析

為了研究大種量流加式與間歇式工藝在高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵中的區(qū)別，本文對(duì)2個(gè)工藝發(fā)酵過(guò)程情況進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖7所示。大種量流加式工藝按接種量為30%，種子培養(yǎng)8 h后，按勻速流加方式流加20 h。發(fā)酵前20 h，間歇式和流加式發(fā)酵過(guò)程中的還原糖質(zhì)量濃度分別維持在125 g/L和75 g/L。流加式發(fā)酵中的糖質(zhì)量濃度明顯低于間歇式，這可以有效避免在發(fā)酵初期高質(zhì)量濃度糖對(duì)酵母的抑制作用。

從乙醇生成情況來(lái)看，發(fā)酵前7 h內(nèi)，大種量流加式發(fā)酵乙醇生成速率為5.91 g/（L·h），間歇式發(fā)酵過(guò)程中乙醇生成速率為3.04 g/（L·h）。在發(fā)酵7~50 h內(nèi)，大種量流加發(fā)酵一直保持穩(wěn)定的乙醇生成速率（2.00 g/（L·h））。 在間歇式發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵的第7~20 h，20~40 h和40~50 h階段，乙醇生成速率分別 4.7、13.8、0.39 g/（L·h）。 在主發(fā)酵期，大種量流加式發(fā)酵的乙醇生成速率基本維持恒定。間歇式發(fā)酵過(guò)程中，乙醇生成速率先快后慢。發(fā)酵15 h后，間歇式發(fā)酵乙醇質(zhì)量濃度高于流加式，而高乙醇質(zhì)量濃度會(huì)破壞酵母細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，降低發(fā)酵速率，延長(zhǎng)或中止發(fā)酵。采用大種量流加式發(fā)酵工藝，可以有效避免前期高質(zhì)量濃度糖和中后期高質(zhì)量濃度乙醇對(duì)酵母的脅迫和毒害作用，使得酵母在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中有較高活力，從而提高乙醇產(chǎn)量。

2.4 不同初始糖和乙醇質(zhì)量濃度對(duì)間歇式乙醇發(fā)酵的影響

為了進(jìn)一步證明這一結(jié)論，本文作者研究了不同初始糖質(zhì)量濃度和乙醇質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響。由圖8可以看出，當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度從180 g/L上升到290 g/L，酵母最大耗糖速率降低了41.2%（從 1.7 g/（L·h）到 1.0 g/（L·h））。 與此同時(shí)，乙醇最大生成速率降低了 40%（從 1.0 g/（L·h）到 0.6 g/（L·h））。此外，糖質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)抑制酵母的生長(zhǎng)和繁殖（圖8（b）），導(dǎo)致耗糖速率和乙醇生成速率降低（圖8（a））。因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度葡萄糖導(dǎo)致發(fā)酵液滲透壓增大，抑制酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的正常進(jìn)行[19]。

由圖8（c）可以看出，初始乙醇質(zhì)量濃度從0 g/L上升到38 g/L后，酵母最大耗糖速率降低了48%（從 2.5 g/（L·h）到 1.3 g/（L·h））。同時(shí)，乙醇最大生成速率降低了 19%（從 1.0 g/（L·h）到 0.81 g/（L·h））。進(jìn)一步增加初始乙醇質(zhì)量濃度時(shí)，發(fā)酵基本停止。高質(zhì)量濃度乙醇會(huì)抑制酵母的生產(chǎn)和繁殖（圖8（d）），導(dǎo)致耗糖速率和乙醇生成速率降低（圖8（c））。這與張強(qiáng)等之前關(guān)于乙醇耐受性的研究是一致的[20]。

圖8 不同初始葡萄糖和乙醇質(zhì)量濃度下，間歇式發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖消耗，乙醇生成速率和酵母數(shù)，出芽率的變化情況Fig.8 Change of glucose consumption，ethanol production rate and number，budding rate of yeast in batch fermentation process under different initial glucose and ethanol concentration

3 結(jié)語(yǔ)

間歇式稀醪乙醇發(fā)酵過(guò)程中，糖質(zhì)量濃度和乙醇質(zhì)量濃度都比較低，酵母生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵不會(huì)受到抑制，發(fā)酵效果良好。高濃度乙醇發(fā)酵中，采用間歇式工藝雖然酒度可以提高，但會(huì)出現(xiàn)發(fā)酵殘還原糖和殘糊精質(zhì)量濃度高，糖醇轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題。其原因是發(fā)酵前期糖質(zhì)量濃度和發(fā)酵后期乙醇質(zhì)量濃度較高[21]。PANCHAL等[22]提出，當(dāng)酵母處在高滲透壓環(huán)境下，會(huì)出現(xiàn)胞內(nèi)乙醇積累現(xiàn)象，這會(huì)對(duì)乙醇合成相關(guān)酶造成不利影響。本文實(shí)驗(yàn)證明，隨著初始糖質(zhì)量濃度和乙醇質(zhì)量濃度的提高，酵母的合成速率和生長(zhǎng)繁殖都受到抑制。PULIGUNDL等[20]報(bào)道，高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵過(guò)程中的高糖質(zhì)量濃度和高乙醇質(zhì)量濃度是影響發(fā)酵效果的主要因素，因此應(yīng)選擇較低的糖質(zhì)量濃度作為工藝優(yōu)化的目標(biāo)。采用大種量流加式高濃度乙醇發(fā)酵工藝可以顯著降低清液殘總糖質(zhì)量濃度。

研究接種量對(duì)工藝影響中發(fā)現(xiàn)：流加過(guò)程出現(xiàn)還原糖增高，且不隨著接種量的增大而消除。主要有以下幾個(gè)原因：1）前期種子數(shù)量較少，不能迅速消耗新補(bǔ)給的糖；2）流加速度過(guò)快，糖補(bǔ)給太迅速，同樣會(huì)導(dǎo)致糖無(wú)法被迅速消耗[23]；3）新料液在添加糖化酶后，前期糖化十分迅速，會(huì)產(chǎn)生大量還原糖，同時(shí)發(fā)酵液中也存在糖化過(guò)程，這兩者協(xié)同作用造成發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度上升。初始流加時(shí)間過(guò)早，會(huì)因?yàn)榉N子液本身糖質(zhì)量濃度較高，流加發(fā)酵降低糖質(zhì)量濃度效果不明顯；過(guò)晚可能會(huì)出現(xiàn)碳源匱乏，不利于種子增殖及發(fā)酵?？疾炝骷訒r(shí)長(zhǎng)對(duì)工藝影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：流加時(shí)長(zhǎng)過(guò)短會(huì)導(dǎo)致流加過(guò)程糖積累現(xiàn)象嚴(yán)重，發(fā)酵前期酵母仍處于高糖環(huán)境中；流加時(shí)長(zhǎng)過(guò)長(zhǎng)則會(huì)出現(xiàn)酵母耗糖速率大于補(bǔ)糖速率，酵母發(fā)酵中后期碳源匱乏，導(dǎo)致發(fā)酵中止。本文優(yōu)化后的大種量流加工藝為：30%接種量下，培養(yǎng)8 h后將剩余料液通過(guò)20 h勻速流加到發(fā)酵體系。發(fā)酵結(jié)束后酒度明顯提高的同時(shí)，發(fā)酵殘?zhí)敲黠@降低，殘?zhí)撬竭_(dá)到了稀醪發(fā)酵下的水平。岳雷[24]提出，在谷氨酸發(fā)酵中采用低初糖，流加高糖工藝可避免發(fā)酵初期高滲透壓對(duì)菌體的影響，菌體生長(zhǎng)旺盛，有利于發(fā)酵產(chǎn)物的生成。大種量流加式高體積分?jǐn)?shù)乙醇發(fā)酵工藝發(fā)酵前期的糖質(zhì)量濃度和發(fā)酵中后期的乙醇質(zhì)量濃度均較低，有效避免了高質(zhì)量濃度糖及乙醇對(duì)酵母的脅迫和毒害作用，促進(jìn)了酵母對(duì)糖的利用，提高了酵母發(fā)酵力。該工藝操作簡(jiǎn)單，無(wú)需添加設(shè)備或改動(dòng)管路，可基于目前大部分工廠現(xiàn)有的發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行發(fā)酵，有望在今后的乙醇發(fā)酵行業(yè)得到推廣。