使用GC/MS和GC-O鑒定皖南煙葉主要呈香組分

倪 偉 ， 陳開波 ， 徐志強(qiáng) ， 徐迎波 ， 周志磊 ， 毛 健 *

（1.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230088；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫214122）

特色煙葉的開發(fā)是我國(guó)烤煙生產(chǎn)發(fā)展的重要方面，“焦甜香”近年來(lái)受到消費(fèi)者和煙草行業(yè)的重視，其獨(dú)特的香氣十分適合生產(chǎn)中式卷煙的需求。皖南煙葉具有焦甜香的風(fēng)格，表現(xiàn)為煙葉的香氣濃郁，回甜感較強(qiáng)，香氣濃郁，透發(fā)性好，具有濃香型的同時(shí)兼具焦甜香，是開發(fā)焦甜香型卷煙的理想材料。

煙葉香氣和香氣成分一直是煙草領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，焦甜香是烤煙的典型香氣之一。國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)卷煙的焦甜香組分進(jìn)行了探索。Matsukura等[1]通過(guò)柱層析對(duì)煙葉烘焙揮發(fā)物進(jìn)行了分析，檢測(cè)到了甲基環(huán)戊烯醇酮、麥芽酚、菠蘿酮等幾種具有焦甜香的成分。張啟東等[2]分析了主流煙氣粒相物水溶性組分中烤甜香成分，認(rèn)為呋喃類、環(huán)戊烯酮類、呋喃酮類和吡喃酮類化合物對(duì)烤甜香有直接貢獻(xiàn)。這些化合物均具有烯醇化平面結(jié)構(gòu)單元，這種結(jié)構(gòu)的化合物通常具有焦甜特征風(fēng)味

[3]。通過(guò)分析化學(xué)成分與感官評(píng)分之間的相關(guān)性尋找香氣的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)是研究人員常用的方法之一。薛超群等[4]使用逐步回歸分析了煙葉理化指標(biāo)與焦甜感程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)糠醛、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃、香葉基丙酮是影響焦甜感程度的主要指標(biāo)。一些研究人員探究了品種、氣候條件、土壤、以及施肥等因素對(duì)皖南烤煙焦甜香的影響[5-9]。但是，總體來(lái)說(shuō)人們對(duì)于皖南煙葉香氣的主要貢獻(xiàn)組分依然不明確。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)，香氣由多個(gè)化學(xué)組分貢獻(xiàn)。如何在眾多的化學(xué)成分中找出主要呈香組分是風(fēng)味化學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。氣相色譜-質(zhì)譜/嗅覺測(cè)量法（GC-MS/O）是解決這個(gè)問(wèn)題的有效手段之一。在色譜流出物進(jìn)質(zhì)譜分析的同時(shí)以人的鼻子做為檢測(cè)器，對(duì)流出峰進(jìn)行氣味特征和強(qiáng)度評(píng)價(jià)。它有效結(jié)合了氣質(zhì)聯(lián)用儀高效分離、定性和定量的優(yōu)勢(shì)以及人鼻子靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，可以幫助人們從復(fù)雜的混合物質(zhì)中篩選出對(duì)香氣有重要貢獻(xiàn)的組分。

GC-O在食品、環(huán)保、醫(yī)學(xué)、香妝品化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但是目前其在煙草研究中的應(yīng)用很少，僅有寥寥數(shù)篇文獻(xiàn)。Higashi等[10]使用GC-O和預(yù)濃縮技術(shù)分析了卷煙側(cè)流煙氣的VOC，鑒定出30多個(gè)香氣成分。Bazemore等[11]使用頂空固相微萃?。℉S-HPME）和GC-O分析了雪茄消費(fèi)者呼出的氣體中的香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)吡啶類和吡嗪類物質(zhì)是主要的呈香物質(zhì)。隨后Cotte等[12]建立了使用GC-O分析卷煙煙氣的方法，鑒定了6個(gè)關(guān)鍵的呈香物質(zhì)。國(guó)內(nèi)研究人員也開始將GC-O用于煙草分析，陳麗君等[13]使用GC-O對(duì)煙草精油和津巴布韋煙葉的主要呈香物質(zhì)進(jìn)行了鑒定。隨著近幾年煙草行業(yè)對(duì)香型風(fēng)格的重視及煙草風(fēng)味研究的深入[14]，GC-O有望成為幫助研究人員揭示煙草香型和風(fēng)格差異的重要手段之一。

本實(shí)驗(yàn)作者嘗試采用氣相色譜-質(zhì)譜/嗅覺測(cè)量法（GC-MS/O）對(duì)皖南焦甜香煙葉中的主要呈香物質(zhì)進(jìn)行鑒定，為客觀的進(jìn)行焦甜香煙葉的篩選和評(píng)價(jià)提供借鑒和思考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 煙葉 皖南焦甜香型煙葉，由安徽中煙工業(yè)公司提供。

1.1.2 試劑 香味成分標(biāo)準(zhǔn)參照樣：4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、苯乙醛、芳樟醇、β-二氫大馬酮、香葉基丙酮、2-戊基呋喃、β-紫羅蘭酮、苯乙酮、正己醛、苯乙醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、甲基環(huán)戊烯醇酮、2-糠醛、苯甲醛、2-甲基四氫呋喃-3-酮、3-羥基-2-丁酮、2，3-戊二酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯甲醛、反式-2-戊烯醛、5-甲基呋喃醛、吡啶、2-乙?；秽Ⅺ溠糠?、2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪以及2-乙酰吡咯，內(nèi)標(biāo)為2-乙酸苯乙酯，以上試劑均為分析純，購(gòu)于百靈威科技有限公司（中國(guó)，北京）；溶劑為二氯甲烷（色譜純），購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；無(wú)水硫酸鈉（分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中用到的其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

SHZ型水循環(huán)真空泵，上海亞榮生化儀器廠制造；Trace ISQ氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)熱電公司產(chǎn)品；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠制造；ODP嗅辯儀，德國(guó) Gerstel公司產(chǎn)品；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（2 cm）及萃取裝置，美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理 煙絲放入烘箱內(nèi)，在40℃下干燥2 h，粉碎過(guò)40目篩。

1）頂空-固相微萃取。取1 g煙末，放入20 mL頂空瓶中，密封后在70℃平衡14 h，然后于相同溫度下吸附60 min，萃取頭為30/50 μm CAR/DVB/PDMS，然后于氣相色譜進(jìn)樣口250℃解析6 min。

2）同時(shí)蒸餾萃取。稱取25.0 g煙末置于SDE裝置一端的1000 mL平底燒瓶中，并向其中加入350 mL飽和NaCl溶液，用調(diào)溫電熱器加熱；裝置的另一端接盛有60 mL二氯甲烷的250 mL圓底燒瓶，用 60℃的水浴加熱；調(diào)節(jié)加熱溫度使水相和二氯甲烷相的餾出速度相等，萃取2.5 h；將二氯甲烷萃取溶液冷卻至室溫，加入適量的無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，過(guò)濾，濾液中加入 25 μL IS（186 μg/mL），40℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到1 mL，再氮吹濃縮至0.1 mL進(jìn) GC-MS分析[15]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲(chǔ)備液、校正曲線溶液的制備分別準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)樣，用二氯甲烷定容于50 mL容量瓶中制備成儲(chǔ)備液。然后分別量取10、25、50、100、200 μL 和 500 μL 儲(chǔ)備液于 50 mL 容量瓶中，加入12.5 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（使定容后內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為46.5 μg/mL），使用二氯甲烷定容，制備成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液。

1.3.3 GC-MS檢測(cè)條件 色譜條件，色譜柱：HPINNOWAX（30 m×0.25 mmi.d.，0.25 μmd.f.）毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣：He；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比 10∶1；升溫程序：從 50 ℃以4℃/min升溫到200℃，再以8℃/min的升溫速率升溫到230℃并保持20 min；電離方式：電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：250℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）和全離子掃描（Scan）模式；掃描范圍：50~350 amu；溶劑延遲4 min。采用Nist質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，有標(biāo)樣的物質(zhì)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，沒(méi)有標(biāo)樣的物質(zhì)忽略響應(yīng)因子，假定目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的面積比等于濃度比進(jìn)行近似定量[15]。

1.3.4 GC-O分析

1）SPME-強(qiáng)度法。使用SPME結(jié)合強(qiáng)度法對(duì)煙草香氣成分進(jìn)行評(píng)估，2個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)價(jià)員參與實(shí)驗(yàn)，針對(duì)煙草香氣物質(zhì)對(duì)評(píng)價(jià)員進(jìn)行額外的20個(gè)小時(shí)培訓(xùn)（每周4 h，共5周）。分析時(shí)，評(píng)價(jià)員對(duì)每個(gè)色譜峰進(jìn)行嗅聞分析，進(jìn)行香氣特征和強(qiáng)度評(píng)價(jià)，5分代表非常強(qiáng)，4分代表比較強(qiáng)，3分代表中等強(qiáng)度，2分代表比較弱，1分代表很弱。

2）GC-O 和香氣提取稀釋分析（AEDA，aroma extract dilution analysis）。使用SDE處理的煙草樣品進(jìn)行AEDA分析，將樣品按以下倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋：2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍…。記錄每一個(gè)流出峰能夠聞到氣味的最小濃度（最大稀釋倍數(shù)），即為該物質(zhì)的稀釋因子（FD）。

1.3.5 閾值測(cè)定 使用三點(diǎn)檢驗(yàn)法測(cè)定單個(gè)物質(zhì)的閾值，參照國(guó)標(biāo)GB/T 12311-2012《感官分析三點(diǎn)檢驗(yàn)》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用純水做參照樣，將香氣物質(zhì)的稀溶液和參照樣用三位隨機(jī)數(shù)字編碼，每3個(gè)杯子為1組，2組樣品一起呈送給評(píng)價(jià)員，評(píng)價(jià)員需判定3個(gè)杯子中氣味最強(qiáng)的一個(gè)，最終通過(guò)統(tǒng)計(jì)正確率得到閾值，評(píng)價(jià)員人數(shù)為32人。

1.3.6 數(shù)據(jù)的處理與分析 所有樣品至少測(cè)定2個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。方差分析（ANOVA）使用IBM SPSS19.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 使用GC/MS和GC-O分析皖南煙葉主要呈香組分

目前煙葉香氣成分提取常用的方法是SDE，該法可以有效將香氣物質(zhì)從煙葉中提取出來(lái)，樣品較干凈，雜質(zhì)少，該法的主要缺點(diǎn)是制樣過(guò)程中需要長(zhǎng)時(shí)間的加熱過(guò)程，容易生成人工副產(chǎn)物。SPME是一種近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高效檢測(cè)方法，制樣簡(jiǎn)單，靈敏度高，受到研究人員的重視。但是該法對(duì)香氣物質(zhì)的富集程度不如SDE，不利于評(píng)價(jià)員在GC-O分析中評(píng)價(jià)色譜流出峰的香氣。因此本研究使用SDE和HS-SPME 2種方法提取香味成分，結(jié)合GC-O對(duì)皖南煙葉主要呈香組分進(jìn)行鑒定。

表1 皖南煙葉SDE樣品GC/MS和GC-O分析結(jié)果Table 1 GC/MS and GC-O analysis results of tobacco leavesfrom southern Anhui extracted with SDE

續(xù)表1

由于SDE法制備的樣品為溶液，選擇香氣提取稀釋分析法（AEDA）進(jìn)行GC-O分析，使用稀釋因子（FD）表示每個(gè)物質(zhì)的香氣強(qiáng)度[16]。表1顯示了SDE法煙葉香氣物質(zhì)GC/MS和GC-O分析的結(jié)果，共檢測(cè)到了35個(gè)物質(zhì)，其中26個(gè)物質(zhì)能感受到香氣。把稀釋因子大于等于16的香氣物質(zhì)認(rèn)定為主要香氣物質(zhì)，得到了7個(gè)主要呈香物質(zhì)，包括：2-戊基呋喃、2-甲基-4氫呋喃-3-酮、2-糠醛、苯乙醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮以及巨豆三烯酮。其中香氣強(qiáng)度最大的是β-紫羅蘭酮。SDE法樣品制備需要高溫長(zhǎng)時(shí)間的加熱過(guò)程，可能會(huì)有人為副產(chǎn)物生成，比如2-糠醛和2-甲基四氫呋喃-3-酮是糖裂解和美拉德反應(yīng)的重要產(chǎn)物，二者的含量有可能被高估，因此有必要采用其他方法進(jìn)行分析驗(yàn)證。

HS-SPME法的原理是將香氣物質(zhì)吸附在萃取頭上進(jìn)行富集再于氣相進(jìn)樣口解吸附，因此不方便進(jìn)行梯度稀釋，在進(jìn)行GC-O分析時(shí)，強(qiáng)度法是比較合適的選擇，使用有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)價(jià)員對(duì)色譜流出峰進(jìn)行香氣特征和香氣強(qiáng)度的評(píng)價(jià)[16]。表2顯示了使用HS-SPME法提取煙葉香氣物質(zhì)的GC/MS-O分析結(jié)果，共檢測(cè)到了36個(gè)物質(zhì)，其中22個(gè)物質(zhì)可以感受到氣味，除了吡啶和己酸產(chǎn)生了令人不悅的氣味外，其他物質(zhì)均產(chǎn)生了令人愉悅的香氣。共有10個(gè)物質(zhì)的香氣強(qiáng)度超過(guò)了3.0，包括：2-糠醛、芳樟醇、苯乙醛、茄酮、2-乙酰吡咯、麥芽酚、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯。其中香氣強(qiáng)度最高的是香葉基丙酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯。與SDE法相比，HS-SPME法鑒定了更多的主要香氣物質(zhì)，其中2-糠醛、苯乙醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮和巨豆三烯酮被2種方法鑒定為主要香氣物質(zhì)，說(shuō)明這幾種香氣物質(zhì)可能對(duì)皖南煙葉的香氣有重要貢獻(xiàn)。

表2 皖南煙葉HS-SPME樣品GC/MS及GC-O分析結(jié)果Table 2 GC/MS and GC-O analysis results of tobacco leaves from southern Anhui extracted with HSSPME

2.2 使用香氣重組法驗(yàn)證皖南煙葉主要香氣組分

前面使用GC-MS結(jié)合GC-O得到了皖南焦甜香煙葉中的主要呈香組分，這種方法可以得到不同物質(zhì)對(duì)煙葉香氣的貢獻(xiàn)大小，也評(píng)估了單個(gè)物質(zhì)的香氣特點(diǎn)。但是煙葉中含有多種香氣物質(zhì)，實(shí)際上這些物質(zhì)之間可能存在復(fù)雜的相互作用，使用GCO也不能評(píng)估樣品基質(zhì)對(duì)香氣物質(zhì)的影響。因此，需要使用風(fēng)味重組法對(duì)前述研究得到的主要香氣組分進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)探討每個(gè)香氣物質(zhì)在基質(zhì)背景下對(duì)煙葉總體香氣的影響。因此首先對(duì)前面得到的重要香氣物質(zhì)進(jìn)行定量分析，一些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的校正曲線參數(shù)如表3所示。

表3 皖南煙葉香氣物質(zhì)校正曲線參數(shù)Table 3 Calibration curves，correlation coefficients and linearity rangefor aroma compounds oftobacco leaves fromsouthern Anhui

由于煙葉為固體，在實(shí)際基質(zhì)或者模擬體系下評(píng)估每個(gè)香氣成分的貢獻(xiàn)是比較困難的。本文中的閾值是香氣物質(zhì)在水溶液中的閾值，與實(shí)際體系可能會(huì)有偏差，但是這并不妨礙我們?cè)u(píng)估各個(gè)香氣物質(zhì)對(duì)煙葉香氣的貢獻(xiàn)大小。得到香氣物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之后，使用香氣活度值（OAV，香氣物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與閾值的比值）表征單個(gè)物質(zhì)的香氣貢獻(xiàn)大小。表4列舉了皖南煙葉香氣物質(zhì)的的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、閾值和香氣活度值（OAV），OAV值大于1的物質(zhì)共有14個(gè)。其中OAV值最高的物質(zhì)為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，苯乙醛、芳樟醇、β-二氫大馬酮、香葉基丙酮、2-戊基呋喃以及β-紫羅蘭酮的OAV值也比較高。這些物質(zhì)均能產(chǎn)生令人愉悅的香氣，4-乙烯基-2甲氧基苯酚能產(chǎn)生一種丁香、木香的香料味，而苯乙醛，芳樟醇，β-二氫大馬酮、香葉基丙酮以及β-紫羅蘭酮均能產(chǎn)生甜的果香，它們可能也對(duì)皖南煙葉的焦甜香有一定的貢獻(xiàn)。2-戊基呋喃、甲基環(huán)戊烯醇酮和2-糠醛能產(chǎn)生焦甜香、面包香、烘烤香，他們可能是皖南煙葉焦甜香的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)。此外巨豆三烯酮和茄酮沒(méi)有得到商業(yè)可用的標(biāo)樣，無(wú)法通過(guò)感官方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。但是GC-O實(shí)驗(yàn)中AEDA和強(qiáng)度法均發(fā)現(xiàn)二者有較強(qiáng)的香氣強(qiáng)度，因此可以斷定二者也是皖南焦甜香煙葉香氣的重要貢獻(xiàn)者。

表4 皖南煙葉香氣物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、閾值及香氣活度值Table 4 Content，threshold，and odor activity values of aroma compounds of tobacco leaves from southern Anhui

3 結(jié) 語(yǔ)

GC-MS/O是鑒定食品呈香組分的有效手段之一，本研究表明其在煙葉呈香組分鑒定方面也有較好的應(yīng)用效果。本文作者結(jié)合GC/MS、GC-O和感官分析（閾值測(cè)定、香氣活度值測(cè)定）鑒定了皖南煙葉的呈香組分，得到了16個(gè)主要呈香組分，除了茄酮和巨豆三烯酮由于沒(méi)有商業(yè)標(biāo)品無(wú)法驗(yàn)證外，其他呈香物質(zhì)對(duì)皖南煙葉香氣的貢獻(xiàn)都得到了驗(yàn)證。本文是結(jié)合化學(xué)分析與感官分析方法對(duì)煙葉香氣進(jìn)行鑒定的初步探索，將來(lái)還需要進(jìn)一步通過(guò)返添加或者模擬缺失實(shí)驗(yàn)確定單個(gè)香氣物質(zhì)對(duì)煙葉具體香氣屬性或者香型的貢獻(xiàn)規(guī)律。