瓦布貝母內(nèi)生真菌WBS020多糖理化性質(zhì)和抗氧化活性

潘 峰， 張慧慧， 許曉燕， 楊玉霞， 吳 衛(wèi)*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

多糖是一類由十個(gè)或十個(gè)以上單糖組成的聚合物，目前在食品、醫(yī)藥和材料等方面有著重要應(yīng)用。微生物作為多糖來(lái)源的最主要資源之一越來(lái)越受到人們的重視。從真菌中提取分離到的多糖表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌消炎、抗衰老等多種生理活性[1-3]。內(nèi)生真菌作為一類重要的真菌資源，已有研究表明其不僅能夠產(chǎn)生活性多樣的小分子化合物[4]，還可產(chǎn)生大量的大分子多糖類物質(zhì)[5-7]。然而相對(duì)于內(nèi)生真菌小分子天然產(chǎn)物而言，關(guān)于內(nèi)生真菌的多糖研究明顯偏少。

瓦布貝母（Fritillariaunibracteatavar.wabuensis）是百合科貝母屬川貝母的栽培品種，為名貴中藥川貝的基源種[8]。近年來(lái)，實(shí)踐證明瓦布貝母較暗紫貝母等品種更能適應(yīng)環(huán)境變化，形態(tài)也較大[9]。本課題組曾從瓦布貝母新鮮鱗莖中分離到多株內(nèi)生真菌，對(duì)其研究后發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)生真菌可產(chǎn)生物堿類活性成分[10-11]，作者還發(fā)現(xiàn)瓦布貝母內(nèi)生真菌WBS020發(fā)酵液具有良好的抗氧化活性，但其多糖成分尚未進(jìn)行研究。為此，本研究提取菌株WBS020發(fā)酵液胞外多糖，對(duì)其進(jìn)行了分離純化并對(duì)部分理化結(jié)構(gòu)信息初步研究，考察其抗氧化活性，以期對(duì)瓦布貝母內(nèi)生真菌多糖的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為其他藥用植物內(nèi)生真菌多糖研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

內(nèi)生真菌WBS020為分離自瓦布貝母的優(yōu)勢(shì)菌株，并且由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)吳衛(wèi)教授用分子生物學(xué)方法鑒定為Fusarium tricinctum（Accession No.KU350730）。

1.2 試劑

DEAE-纖維素（type DE52），購(gòu)于 Whatman 公司；Sephadex G-150，購(gòu)于 Pharmacia 公司；S-8 型和D101 resin大孔吸附樹(shù)脂，購(gòu)于廣州翔博生物科技有限公司。不同相對(duì)分子質(zhì)量的T-系列葡聚糖（T-5、T-10、T-40、T-70、T-500）、 甘 露糖 （D-（+）-mannose）、鼠李糖（L-rhamnose monohydrate）、半乳糖醛酸（D-（+）-galacturonic acid）、葡萄糖（D-（+）-glucose）、半乳糖（D-（+）-galactose）、木糖（D-（+）-xylose）、阿拉伯糖（L-（+）-arabinose）、巖藻糖（L-（-）-fucose）、DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）和 ABTS （2，2-Azino-bis （3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic）acid），購(gòu)于上海 Sigma-Aldrich公司。氧化氘（D2O，99.9 atom%D），購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；（色譜級(jí)）乙腈，購(gòu)于飛世爾實(shí)驗(yàn)器材（上海）有限公司；其它試劑均為分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HY-150s型生物搖床，武漢匯誠(chéng)生物科技公司產(chǎn)品；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠制造；SJIA-10N型普通多歧管冷凍干燥機(jī)，寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司產(chǎn)品；自動(dòng)餾分收集器，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；Waters 1525 HPLC系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；ELSD檢測(cè)器，美國(guó)Alltech公司產(chǎn)品；島津UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；安捷倫 1100高效液相色譜儀 （HPLC），美國(guó) Agilent公司產(chǎn)品；TSK-GEL G5000PWXL凝膠注 （7.8 mm×30 cm），日本TOSOH 公司產(chǎn)品；Phenomenex Luna 5u C18（2） 100 ? 柱 （250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm）， 丹 麥Phenomenex公司產(chǎn)品；傅里葉變化紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀（Multiskan GO），美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；MD34型透析袋（截留量3500），美國(guó)聯(lián)合碳化公司產(chǎn)品。

1.4 供試菌株發(fā)酵及粗多糖提取

取保存的菌種于新鮮PDA培養(yǎng)基上活化，將新長(zhǎng)出的菌絲接種到PDB液體培養(yǎng)基上，按照Pan所描述的培養(yǎng)方法制備種子液和發(fā)酵[11]。采用抽濾方法分離菌絲體和發(fā)酵液，收集發(fā)酵液，在50～60℃條件下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮到原體積的20%。之后用石油醚（30～60℃），乙酸乙酯和正丁醇依次分別重復(fù)2～3次等體積萃取濃縮液，進(jìn)行初步脫脂，除色素等。然后加入其體積4倍的無(wú)水乙醇，在4℃冰箱靜置過(guò)夜。除去上層澄清液之后，4000 r/min離心30 min并收集沉淀，用無(wú)水乙醇清洗。水浴去除乙醇后將所得粗多糖在冷凍干燥機(jī)凍干備用。

1.5 粗多糖除雜

1.5.1 粗多糖除色素 稱取適量粗多糖復(fù)溶于50 mL蒸餾水中，然后參考Liu的方法選用S-8和D101 2種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色素[12-13]。即首先將預(yù)處理好的S-8大孔吸附樹(shù)脂用濕法裝柱的方法制備大孔吸附樹(shù)脂色譜柱（3.0 cm×40 cm），將50 mL粗多糖溶液以1.0 mL/min流速采用動(dòng)態(tài)吸附法過(guò)S-8樹(shù)脂色譜柱，再用25 mL蒸餾水沖洗色譜柱，收集洗脫液，選取新的S-8樹(shù)脂色譜柱重復(fù)上述過(guò)程一次。將吸附過(guò)的多糖溶液再次濃縮到約50 mL，再以同樣的方法和過(guò)程用D101大孔吸附樹(shù)脂色譜柱進(jìn)行脫色素。收集多糖溶液并冷凍干燥備用。

1.5.2 粗多糖除蛋白質(zhì) 采用蛋白酶和Sevag試劑聯(lián)用的方法清除多糖溶液中的蛋白質(zhì)成分[14]。首先將多糖溶于50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（PBS，pH 7.4）中，使溶液質(zhì)量濃度約為100 mg/mL。再加入胰蛋白酶適量使得溶液中其終濃度為5 U/mL，在37℃水浴3 h，隨后4000 r/min離心10 min，由于多糖溶解于水層，收集上清液。在55℃預(yù)熱的上清液中加入木瓜蛋白酶（終濃度為5 U/mL），并在此溫度下水浴3 h，且4000 r/min離心10 min，收集上清液。最后選用Sevag試劑法除蛋白質(zhì)，重復(fù)3～5次。4000 r/min離心后收集下清液備用。

1.5.3 粗多糖除小分子物質(zhì) 將除色素和蛋白質(zhì)的多糖溶液置于分子截留量為3500的透析袋中，于蒸餾水中進(jìn)行透析。每12 h更換一次蒸餾水，共透析48 h，以除去鹽離子，小分子物質(zhì)等。完成透析后凍干備用。

1.6 多糖分離

多糖分離純化選用纖維素DEAE-52色譜和sephadex G-150色譜進(jìn)行。將纖維素DEAE-52按照說(shuō)明書(shū)處理后，采用濕法裝柱（31.2 mm×195 mm），然后用去離子水在0.6 mL/min條件下平衡色譜柱10 h左右，加入多糖樣品，分別用去離子水、0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L 的 NaCl溶液以 0.5 mL/min 流速梯度洗脫，10 mL每管收集洗脫液。用苯酚-濃硫酸法檢測(cè)，并繪制纖維素DEAE-52洗脫曲線，得到5個(gè)洗脫峰，其中以蒸餾水洗脫得到的峰為主峰。收集主峰，濃縮，得中性多糖備用。將sephadex G-150按照說(shuō)明書(shū)預(yù)處理后，按照纖維素DEAE-52相同方法裝柱、平衡。上樣后用0.5 mL/min流速以去離子水沖洗，10 mL每管收集洗脫液，用苯酚-濃硫酸法檢測(cè)，并繪制洗脫曲線，得到2個(gè)洗脫峰，將其中的主峰命名為WBS020EPS1-2。收集冷凍干燥備用。

1.7 純度和平均相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

純度和平均相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定采用高效液相凝膠滲透色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法 （Highperformance gel -permeation chromatography combined with evaporative light scattering detector，HPGPC-ELSD）色譜法，參考Liu所述步驟[15]，并略做修改。具體為，選用Waters 1525 HPLC高效液相色譜系統(tǒng)；TSK-GEL G5000PWXL凝膠注為色譜柱；流動(dòng)相為水，流速0.5 mL/min；ELSD檢測(cè)器參數(shù)：以壓縮空氣為載氣，流速3.2 L/min，漂移管溫度115℃，并選用Alltech 2000ES色譜工作站（浙江大學(xué)）；樣品進(jìn)樣量為10 μL。根據(jù)葡聚糖凝膠柱的色譜圖的峰形、出峰數(shù)量和主峰所占比例判斷WBS020EPS1-2的純度。此外，選用T-系列葡聚糖（T-5，T-10，T-40，T-70，T-500 和 T-2000） 作為標(biāo)準(zhǔn)多糖按照上述條件進(jìn)行HPGPC-ELSD分析。以標(biāo)準(zhǔn)多糖相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)和保留時(shí)間對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品出峰的保留時(shí)間（RT）推算多糖WBS020EPS1-2的平均相對(duì)分子質(zhì)量。

1.8 UV掃描

取質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的WBS020EPS1-2多糖溶液在UV-2450紫外分光光度計(jì)上掃描200～400 nm紫外區(qū)間的吸光譜。

1.9 單糖組分分析

WBS020EPS1-2多糖的單糖組分采用強(qiáng)酸水解后利用PMP柱前衍生法結(jié)合HPLC-DAD色譜法進(jìn)行分析[16-17]。單糖標(biāo)準(zhǔn)品為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖（內(nèi)標(biāo)），按照相同衍生化過(guò)程配置標(biāo)準(zhǔn)單糖供試液。將多糖水解樣品和標(biāo)準(zhǔn)多糖樣品分別于安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)分析。色譜條件為：色譜柱為 Phenomenex Luna 5u C18（2） 100 ? 柱，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)17%的乙腈和體積分?jǐn)?shù)83%磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0，體積比）等度洗脫，流速為 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積15 μL。

1.10 FT-IR光譜分析

稱取 WBS020EPS1-2多糖干樣 2～3 mg，用KBr法壓片，在4000～450 cm-1的紅外區(qū)間于PerkinElmer Spectrum 100系列傅立葉變換紅外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。

1.11 抗氧化活性分析

1.11.1 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基清除活性的測(cè)定參考Jin Boo Jeong[18]所述方法執(zhí)行，略做修改。簡(jiǎn)而言之，將多糖樣品WBS020EPS1-2溶解到水中，配置成0.1～8.0 mg/mL一系列質(zhì)量濃度梯度溶液。根據(jù)酶標(biāo)板體積，取70 μL多糖樣品溶液于96孔酶標(biāo)板，加入180 μL體積分?jǐn)?shù)0.004%DPPH乙醇溶液，混合均勻后在27℃條件下反應(yīng)5 min（反應(yīng)完全），然后在517 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。用水替代樣品作陰性對(duì)照，用乙醇替代DPPH溶液作空白對(duì)照。Vc作標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，試驗(yàn)重復(fù)3次。DPPH自由基清除活性按照如下公式（1）計(jì)算：

DPPH 自由基清除活性/%=[1-（Ai-A0）/Ac]×100（1）其中Ai為樣品測(cè)量值，A0為空白對(duì)照，Ac為陰性對(duì)照。

1.11.2 ABTS自由基清除活性 ABTS自由基清除活性的測(cè)定參考Yang Tao所述方法[19]，并略作修改。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取30 μL多糖樣品溶液于96孔酶標(biāo)板，加入180 μL ABTS試液，混合均勻后在37℃條件下反應(yīng)5 min，然后在734 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。用水替代樣品作陰性對(duì)照，用乙醇替代ABTS溶液作空白對(duì)照。Vc作標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，試驗(yàn)重復(fù)3次。ABTS自由基清除活性按照如下公式（2）計(jì)算：

其中Ai為樣品測(cè)量值，A0為空白對(duì)照，Ac為陰性對(duì)照。

1.11.3 亞鐵離子螯合活性 亞鐵離子螯合實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[20-21]中所述鄰二氮雜菲紫外光譜檢測(cè)方法，并略作修改。具體如下，先取0.3 mL多糖樣品溶液或者水 （陰性對(duì)照）加入到裝有0.3 mL濃度為150 mmol/L FeSO4·7H2O溶液的試管中，搖勻后在室溫靜置10 min，然后加入0.3 mL醋酸鈉緩沖液（HAc-NaA，pH 4.6）和 0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1%1，10-鄰二氮雜菲溶液來(lái)測(cè)量體系中未被螯合的Fe2+離子含量。用水替代FeSO4·7H2O溶液作空白對(duì)照。取200 μL上述反應(yīng)完成溶液于96孔酶標(biāo)板中，在510 nm條件下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。EDTA溶液作陽(yáng)性對(duì)照。亞鐵離子螯合率計(jì)算采用如下公式（3）：

其中Ai為樣品測(cè)量值，A0為空白對(duì)照，Ac為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生真菌WBS020多糖的提取純化及分離

經(jīng)發(fā)酵、濃縮、石油醚和乙酸乙酯等初步脫脂和除色素后，再經(jīng)過(guò)醇沉得到的內(nèi)生真菌WBS020胞外多糖粗提物，呈現(xiàn)深棕褐色浸膏狀，在4℃冰箱保存后呈塊狀。利用S-8型和D101型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行多次脫色素處理，不僅獲得了明顯的除色素效果，還除去了一部分蛋白質(zhì)等成分，并且整個(gè)吸附過(guò)程相對(duì)溫和，不會(huì)破壞多糖成分結(jié)構(gòu)[12-13]。利用酶法和Sevag試劑聯(lián)用脫去多糖中剩余的蛋白質(zhì)較相對(duì)單一方法脫蛋白質(zhì)效率更高[14]，利用半透膜透析法可有效除去一些小分子物質(zhì)。通過(guò)上述脫色素、脫蛋白質(zhì)和除去小分子，成分的樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步提高。將經(jīng)過(guò)純化的多糖纖維素DEAE-52陰離子交換色譜柱后得到5個(gè)洗脫的多糖餾分，分別編號(hào)為WBS020EPS-1、WBS020EPS-2、WBS020EPS-3、WBS020EPS-4 和 WBS020EPS-5。 其中以 WBS020EPS-1 為主要成分（圖 1（a）），且該成分為中性多糖（純水洗脫得到的餾分）[22]，將其收集之后，濃縮凍干，經(jīng)sephadex G-150進(jìn)一步分離得到 2個(gè)餾分 （圖 1 （b））， 分別編號(hào)為WBS020EPS1-1和WBS020EPS1-2，以后者質(zhì)量較高。收集WBS0020EPS1-2并濃縮凍干后得到淺白色多糖粉末WBS0020EPS1-2。HPGPC-ELSD分析結(jié)果表明多糖WBS020EPS1-2為質(zhì)量分?jǐn)?shù)在95%以上的純多糖。

2.2 多糖相對(duì)分子質(zhì)量和UV分析

由于不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的葡聚糖在HPGPC-ELSD上的色譜峰保留時(shí)間（RT）的自然對(duì)數(shù)與其相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）的自然對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，通過(guò)測(cè)定已知相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖在HPGPC-ELSD色譜上的RT值，得到了其Mw與RT值的線性關(guān)系式為：ln （Mw）=-8.039 9ln （RT）+33.983，R2=0.99-36。因此根據(jù)WBS020EPS1-2主峰的保留時(shí)間可以得到其平均分子質(zhì)量約為3.137×104。

圖1 菌株WBS020發(fā)酵液胞外粗多糖分離純化柱色譜圖Fig.1 Purification column chromatogram of the crude exopolysaccharide （EPS） extracted from the fermentation broth of strain WBS020

2.3 UV分析

如圖2所示，從在200～400 nm掃描范圍內(nèi)的WBS020EPS1-2的UV掃描圖中可以看出，在280 nm有一個(gè)較小的吸收峰，除此外整個(gè)曲線無(wú)其他吸收峰，說(shuō)明色素和核酸成分已被除完，僅含有少量的蛋白質(zhì)。取少量多糖進(jìn)行試驗(yàn)，在其水溶液加入乙醇（乙醇的終體積分?jǐn)?shù)控制在80%以上），多糖溶液溶解良好，表明其所含的蛋白質(zhì)應(yīng)該是結(jié)合在多糖鏈上的結(jié)合蛋白。另外，UV分析也顯示上述大孔吸附樹(shù)脂法和酶法與Sevag試劑聯(lián)用已基本除去樣品中的色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

2.4 單糖組成分析

圖2 WBS020EPS1-2多糖餾分UV掃描圖（200～400 nm）Fig.2 UV spectra （200-400 nm） of polysaccharides WBS020EPS1-2

多糖的單糖組分分析采用PMP衍生HPLCDAD色譜法。由圖3可知，在所選色譜條件下，衍生后的單糖可達(dá)到基線分離，且峰形良好。由圖3所知，WBS020EPS1-2主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其摩爾比為0.43∶0.13∶10.00∶1.92∶0.11。 此外，由圖 3 所示，在出峰時(shí)間為14.398 min處，有一個(gè)面積較大峰，但是由于未有標(biāo)準(zhǔn)品與之對(duì)應(yīng)，所以暫時(shí)無(wú)法判斷其成分種類，這也表明內(nèi)生真菌多糖的單糖組分較為豐富，將更有利于產(chǎn)生出結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖產(chǎn)物。在WBS020EPS1-2中，葡萄糖為其主要單糖組分。由培養(yǎng)基中添加的單糖成分為葡萄糖推測(cè)菌株WBS020能夠直接利用培養(yǎng)基中的葡萄糖來(lái)合成以葡萄糖為主的糖鏈。同時(shí)，半乳糖相對(duì)含量也相對(duì)較高，這也表明WBS020EPS1-2在主鏈或側(cè)鏈中含有部分半乳糖的雜多糖。

圖3 單糖PMP衍生化HPLC-DAD色譜圖Fig.3 HPLC-DAD chromatography of monosaccharide standards after PMP derivatization

2.5 紅外光譜分析

多糖WBS020EPS1-2的FT-IR光譜圖如圖4所示。在3400 cm-1處的強(qiáng)吸收為羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰。在2940 cm-1處為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1420 cm-1出現(xiàn)的峰為C-H的變角振動(dòng)，它和C-H鍵的伸縮振動(dòng)構(gòu)成了糖類的特征吸收峰。在1750~1700 cm-1區(qū)間內(nèi)無(wú)吸收峰，表明WBS020EPS1-2多糖樣品中不含有糖醛酸成分[23]，進(jìn)一步證實(shí)其為中性多糖。1635 cm-1處可能為C=O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的吸收峰，而之前試驗(yàn)的研究結(jié)果已經(jīng)表明WBS020EPS1-2多糖為中性多糖，且UV分析中280 nm處的微弱吸收峰，表明可能存在酰胺羧基，此處信號(hào)峰可能是樣品中存在著少量的與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)引起，但需進(jìn)一步驗(yàn)證。1300～1250 cm-1和1240 cm-1處無(wú)明顯吸收峰，表明樣品中無(wú)磷酸基和磺酸基取代。1149、1075 cm-1和1045 cm-1處的吸收峰歸為糖苷鍵CO-C或C-O-H中的C-O的伸縮振動(dòng)[24]，此3個(gè)吸收峰表明吡喃糖苷的存在。939 cm-1左右的吸收峰為α-構(gòu)型葡聚糖的特征吸收峰[25]；871 cm-1處的吸收峰表示存在甘露糖，結(jié)合939 cm-1左右的吸收峰，可以判斷存在甘葡聚糖[26]?？梢?jiàn)多糖WBS020EPS1-2主要為α-構(gòu)型葡萄吡喃糖和甘露吡喃糖組成的中性多糖，并且可能含有少量的結(jié)合蛋白。這與多糖的單糖組分分析和紫外掃描分析結(jié)果基本一致。但是作為摩爾分?jǐn)?shù)次高的半乳糖在糖鏈中的構(gòu)型，以及單糖的鏈接方式等還需要借助其它方法進(jìn)一步分析。

圖4 多糖組分WBS020EPS1-2的傅里葉變化紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of polysaccharide WBS020EPS1-2

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除活性 DPPH是一種穩(wěn)定自由基組成的深藍(lán)色結(jié)晶粉末，通常用于天然產(chǎn)物對(duì)自由基清除活性的評(píng)價(jià)。如圖5所示，分離自瓦布貝母內(nèi)生真菌的多糖WBS020EPS1-2表現(xiàn)出較弱的DPPH自由基清除活性，其IC50值遠(yuǎn)低于所測(cè)樣品的最大質(zhì)量濃度8.00 mg/mL，而且其量效關(guān)系也不明顯。可見(jiàn)多糖成分WBS020EPS1-2不適合清除DPPH自由基。

圖5 瓦布貝母內(nèi)生真菌WBS020EPS1-2多糖DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH free radical scavenging activities of the polysaccharideWBS020EPS1-2ofendophytic fungus from Fritillaria unibracteata var.wabuensis

2.6.2 ABTS自由基清除活性 ABTS自由基清除試驗(yàn)通常用于評(píng)價(jià)化合物總抗氧化活性[27]。如圖6所示，來(lái)源于瓦布貝母內(nèi)生真菌的多糖WBS020EPS1-2表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，其IC50為1.93 mg/mL，在所測(cè)最大質(zhì)量濃度8.00 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到 （89.83±3.59）%。在所測(cè)樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增加，其ABTS自由基清除活性也隨之增強(qiáng)，其擬合線性公式為Y=6.9484X+36.609，R2=0.9629，可見(jiàn)ABTS自由基清除活性與樣品質(zhì)量濃度之間有良好的量效關(guān)系。雖然與陽(yáng)性對(duì)照VC溶液相比，所得多糖活性仍然相對(duì)較低，但是多糖是大分子物質(zhì)，在相同質(zhì)量條件下多糖的活性中心遠(yuǎn)少于VC小分子，因此以其摩爾濃度相比而言，多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的ABTS自由基清除活性。

圖6 瓦布貝母內(nèi)生真菌WBS020EPS1-2多糖ABTS自由基清除活性Fig.6 ABTS free radical scavenging activities of the polysaccharideWBS020EPS1-2ofendophytic fungus from Fritillaria unibracteata var.wabuensis

2.6.3 亞鐵離子螯合分析 亞鐵離子（Fe2+）具有很強(qiáng)的助氧化活性，在溶液中會(huì)發(fā)生Fenton反應(yīng)（Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH·），并通過(guò)破壞氫鍵和脂質(zhì)過(guò)氧化酶加速細(xì)胞損傷[28]，可通過(guò)亞鐵離子螯合作用，降低亞鐵離子濃度，從而避免或者減小其氧化活性。1，10-鄰二氮雜菲會(huì)結(jié)合亞鐵離子形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，并且在510 nm處有最強(qiáng)的吸收峰[29]。如果樣品具有螯合亞鐵離子的活性，當(dāng)樣品加入后，亞鐵離子濃度將降低，通過(guò)測(cè)定與1，10-鄰二氮雜菲反應(yīng)后顏色變化，就可測(cè)定溶液中螯合除去的亞鐵離子的濃度。由圖7所示，多糖WBS020EPS1-2表現(xiàn)出較強(qiáng)的亞鐵離子螯合活性，在所測(cè)最大質(zhì)量濃度8.00 mg/mL時(shí)螯合率達(dá)到（74.34±1.23）%，其 IC50為 4.52 mg/mL。并且在所測(cè)樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增加，亞鐵離子螯合能力也增強(qiáng)。其擬合線性公式為Y=7.706X+15.135，R2=0.9774，可見(jiàn)其樣品質(zhì)量濃度和亞鐵離子螯合率之間有良好的量效關(guān)系。

圖7 瓦布貝母內(nèi)生真菌WBS020EPS1-2多糖亞鐵離子螯合能力Fig. 7 Ferrous ions chelating activities of the polysaccharideWBS020EPS1-2ofendophytic fungus Fritillaria unibracteata var.wabuensis

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)中對(duì)一株分離自珍稀藥用植物瓦布貝母的內(nèi)生真菌F.tricinctumWBS020胞外多糖進(jìn)行了研究，通過(guò)醇沉，除雜和分離最終得到了多糖成分WBS020EPS1-2。研究表明，WBS020EPS1-2平均相對(duì)分子質(zhì)量約為3.137×104，為含有少量結(jié)合蛋白的中性多糖，其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其中以葡萄糖摩爾分?jǐn)?shù)最高，其次是半乳糖。而抗氧化活性研究表明，多糖WBS020EPS1-2對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基具有良好的清除能力，對(duì)亞鐵離子也有較強(qiáng)的螯合能力。本研究是首次對(duì)瓦布貝母內(nèi)生真菌WBS020的多糖的研究，這對(duì)其他藥用植物內(nèi)生真菌的開(kāi)發(fā)利用具有一定的參考價(jià)值，同時(shí)也對(duì)WBS020多糖成分的開(kāi)發(fā)利用鑒定了基礎(chǔ)。